高麗參治療睪丸缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

韋思明，顏志中，周 劍

(1. 浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院，浙江 杭州 310003；3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

·基礎(chǔ)與臨床研究·

高麗參治療睪丸缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

韋思明1，顏志中2，周 劍3

(1. 浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院，浙江 杭州 310003；
3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

目的：睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的損傷是一個(gè)缺血再灌注損傷。本研究探討高麗參治療睪丸缺血再灌注損傷的功效。方法60只成年雄性SD大鼠被隨機(jī)分為3組。對(duì)照組接受了左側(cè)睪丸假手術(shù)。扭轉(zhuǎn)復(fù)位組經(jīng)受了左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)，2小時(shí)后復(fù)位。治療組接受了同扭轉(zhuǎn)復(fù)位組一樣的外科手術(shù)，但給予高麗參口服治療。復(fù)位后4小時(shí)或3個(gè)月，行左側(cè)睪丸切除術(shù)，分析睪丸中丙二醛水平(活性氧標(biāo)志)、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件調(diào)控因子(cAMP-responsive element modulator, CREM)的表達(dá)和睪丸生精功能。結(jié)果睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起睪丸丙二醛水平顯著升高，CREM表達(dá)和生精功能明顯降低。高麗參治療顯著降低了睪丸丙二醛水平，明顯提高了CREM表達(dá)和生精功能。結(jié)論高麗參對(duì)睪丸缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)效應(yīng)。該效應(yīng)可能與減少活性氧產(chǎn)生、提高CREM表達(dá)有關(guān)。

高麗參;睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位;缺血再灌注損傷

Abstract:[Objective] The damage after testicular torsion-detorsion (TTD) is an ischemia-reperfusion injury. This study investigated the effect of Korean ginseng (KG) on testicular ischemia-reperfusion injury. [Method] 60 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups. Control group received a sham operation of left testis. TTD group underwent 2 hours of left testicular torsion. Treatment group underwent same surgical procedure as TTD group, but KG was given orally. Left orchiectomy was performed 4 hours or 3 months after detorsion to measure malondialdehyde(a mark of reactive oxygen species), cAMP-responsive element modulator (CREM) expression and spermatogenic function. [Result] TTD caused a significant increase in malondialdehyde level and significant decreases in CREM expression and spermatogenic function. The rats treated with KG had a significant decrease in malondialdehyde level and significant increases in CREM expression and spermatogenic function. [Conclusion] KG protects testes from ischemia-reperfusion injury. The protective effect of KG may be related to decrease of reactive oxygen species production, and improvement of CREM expression.

Keywords: Korean ginseng; testicular torsion-detorsion; ischemia-reperfusion injury

睪丸扭轉(zhuǎn)又稱精索扭轉(zhuǎn)，它是泌尿外科急癥，是指精索沿其縱軸旋轉(zhuǎn)，精索內(nèi)血液循環(huán)產(chǎn)生障礙，導(dǎo)致睪丸缺血甚至壞死。在25歲以下的男性發(fā)生率為1/4000，因此本病并非少見[1]。通過手術(shù)復(fù)位是治療睪丸扭轉(zhuǎn)的現(xiàn)有方法，可以避免睪丸因缺血而壞死。睪丸復(fù)位后即使存活，但患者隨后出現(xiàn)了睪丸萎縮，生精功能損傷[1]。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的損傷是一個(gè)典型的缺血再灌注損傷，目前缺乏相應(yīng)的臨床輔助治療，所以手術(shù)后的臨床輔助治療已成為研究的重要方向之一。本研究通過建立大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型，探討高麗參在睪丸缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用，為更好地進(jìn)行臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性SD大鼠(250～300g)購于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。高麗紅參購自杭州華東大藥房連鎖有限公司。丙二醛測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。兔抗鼠環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件調(diào)控因子(cAMP-responsive element modulator, CREM)抗體和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑由Santa Cruz公司生產(chǎn)。帶辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購自Sigma公司。

1.2 高麗參溶液的制備[2]

300g高麗參在6升沸水中煮2小時(shí)，過濾，取濾液凍干。凍干粉76.6克，得率26%，4℃保存。每次實(shí)驗(yàn)前，將干粉溶解在去離子的蒸餾水中作為高麗參溶液。

1.3 大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型的制作及其治療

60只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組20只。將氯胺酮以每公斤體重50mg的劑量注入大鼠腹腔麻醉。對(duì)照組大鼠：通過左側(cè)髂腹股溝切口取出左側(cè)睪丸，用11/0無創(chuàng)傷縫線穿過睪丸白膜。然后，睪丸通過原切口放入陰囊，切口縫合關(guān)閉。扭轉(zhuǎn)復(fù)位組大鼠：通過同樣的切口暴露左側(cè)睪丸，將左側(cè)睪丸繞精索逆時(shí)針扭轉(zhuǎn)720°，睪丸白膜與陰囊肉膜之間用11/0無創(chuàng)傷縫線縫合固定，防止睪丸自發(fā)復(fù)位，縫合切口。2h后，再次打開切口，將睪丸反方向旋轉(zhuǎn)復(fù)位，睪丸恢復(fù)血供，仍然存活，放睪丸入陰囊，關(guān)閉切口。治療組大鼠：也行同樣的左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位術(shù)，但在復(fù)位的時(shí)候?qū)⑷芙庠谒锏母啕悈⒁悦抗矬w重1.0g的劑量灌胃[2]。復(fù)位后4h，每組半數(shù)的大鼠被處死，行左側(cè)睪丸切除術(shù)，測(cè)定睪丸中丙二醛水平。在治療組，剩下的大鼠繼續(xù)給予高麗參(1.0 g/kg/d)灌胃，連續(xù)3個(gè)月。復(fù)位后3個(gè)月，每組剩余的大鼠行左側(cè)睪丸切除術(shù)，分析睪丸中CREM蛋白表達(dá)和睪丸生精功能。

1.4 丙二醛水平的測(cè)定

用硫代巴比妥酸法測(cè)定睪丸中丙二醛水平, 操作步驟按照試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)說明書進(jìn)行。

1.5 Western blot檢測(cè)睪丸中CREM蛋白表達(dá)

睪丸組織在裂解緩沖液中被攪拌成組織勻漿， 4℃離心15min，取上清液，用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。樣品(含20μg蛋白)在100℃加熱3min使蛋白變性，然后上樣，在10%SDS-PAGE膠上電泳，轉(zhuǎn)膜，37℃封閉1h，加入兔抗鼠CREM抗體，4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，常溫孵育1h，ECL顯示膜上蛋白條帶。用GS-700型圖像密度測(cè)量?jī)x及其分析軟件(Bio-Rad Laboratories公司產(chǎn)品)測(cè)定條帶密度。CREM條帶與內(nèi)參照β-actin條帶的密度比值代表CREM蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 睪丸生精功能的分析

通過測(cè)定睪丸的重量和每日精子產(chǎn)量來分析睪丸生精功能。左側(cè)睪丸切除后立即稱重，在50ml含有0.154M氯化鈉、0.5%聚乙二醇辛基苯基醚、2%疊氮鈉、伊紅溶液中攪拌成勻漿。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定濃縮的精子細(xì)胞核數(shù)目，結(jié)果作為每日精子產(chǎn)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 4.0軟件處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睪丸丙二醛水平

表1顯示：扭轉(zhuǎn)復(fù)位組的丙二醛水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；治療組的丙二醛水平明顯低于扭轉(zhuǎn)復(fù)位組，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 各組睪丸中丙二醛、CREM蛋白、睪丸重量和每日精子產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果

注： ▲：與對(duì)照組比較P< 0.05; ◆：與扭轉(zhuǎn)復(fù)位組、對(duì)照組比較P< 0.05

2.2 睪丸中CREM蛋白的表達(dá)

表1和圖1顯示：扭轉(zhuǎn)復(fù)位組的CREM表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；治療組的CREM表達(dá)明顯高于扭轉(zhuǎn)復(fù)位組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 Western blot檢測(cè)各睪丸中CREM蛋白的表達(dá)

2.3 睪丸的生精功能

表1顯示：扭轉(zhuǎn)復(fù)位組睪丸重量和每日精子產(chǎn)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；治療組睪丸重量和每日精子產(chǎn)量明顯高于扭轉(zhuǎn)復(fù)位組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

睪丸扭轉(zhuǎn)是一個(gè)常見的泌尿科急診。如果睪丸扭轉(zhuǎn)在6小時(shí)內(nèi)不治療，睪丸將發(fā)生梗死[1]。但是，即使睪丸扭轉(zhuǎn)患者在這個(gè)時(shí)間內(nèi)接受了外科復(fù)位手術(shù)，睪丸也將喪失正常的生精功能[1]。在我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，大鼠經(jīng)受了2小時(shí)的睪丸扭轉(zhuǎn)，復(fù)位后睪丸仍然存活，但睪丸生精功能嚴(yán)重受損，包括睪丸重量和每日精子產(chǎn)量顯著下降。然而，睪丸損傷的機(jī)制尚不清楚。

環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件調(diào)控因子(cAMP responsive elemental modulator , CREM)是屬于堿性域/亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子類，它在大多數(shù)組織中都低水平表達(dá)，而在成年男性睪丸組織中其表達(dá)水平是其它組織的一百倍,它是控制雄性生殖細(xì)胞分化和凋亡的總開關(guān)[1]。突變小鼠CREM基因使蛋白表達(dá)減少或缺失，導(dǎo)致小鼠睪丸重量減輕20%～25%，精液中精子數(shù)量減少46%[3]。CREM的表達(dá)對(duì)精子發(fā)育成熟必不可少。在我們的研究中，睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起睪丸CREM表達(dá)明顯減少，睪丸生精功能也嚴(yán)重受損，包括睪丸重量和每日精子產(chǎn)量明顯下降。由于CREM表達(dá)對(duì)精子發(fā)育成熟必不可少，所以我們推測(cè)：CREM表達(dá)的降低可能是導(dǎo)致睪丸生精功能損傷的原因。高麗參的主要成分是人參皂苷，它擁有廣泛的藥理作用，如抗氧化，抗衰老，抗應(yīng)激，等[4]。因此，高麗參在亞洲已經(jīng)被應(yīng)用幾千年治療各種疾病，如冠心病，高血壓，糖尿病，腫瘤，等。據(jù)Park等人報(bào)道，高麗參通過增加CREM表達(dá)來提高睪丸生精功能[2]。因此，我們嘗試用高麗參治療睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位所誘導(dǎo)的損傷。結(jié)果顯示：相比于扭轉(zhuǎn)復(fù)位組，治療組睪丸CREM表達(dá)明顯升高，睪丸生精功能亦顯著提高。這表明高麗參通過提高CREM表達(dá)來減輕睪丸的損傷。在治療過程中我們沒有發(fā)現(xiàn)明顯的副作用，說明高麗參治療是安全的。但是，高麗參提高CREM表達(dá)的機(jī)制仍然未知。

睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是一個(gè)典型的缺血再灌注過程，在這一過程中產(chǎn)生了大量活性氧，如超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基。缺血組織細(xì)胞內(nèi)的次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應(yīng)是活性氧產(chǎn)生的一個(gè)重要途徑[5]。因?yàn)榛钚匝醢胨テ诤芏?，很難直接測(cè)定，通常用活性氧引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛來間接表示活性氧水平[6]。我們的研究顯示：扭轉(zhuǎn)復(fù)位組睪丸的丙二醛水平明顯高于對(duì)照組，這提示睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后活性氧大量產(chǎn)生?；钚匝蹩梢酝ㄟ^改變基因表達(dá)來引起細(xì)胞的損傷[1]。因此，我們推測(cè)：睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后，活性氧的大量產(chǎn)生可能是引起CREM表達(dá)降低的原因。據(jù)報(bào)道，高麗參可以通過抑制黃嘌呤氧化酶活性來減少活性氧產(chǎn)生[7]。在我們的研究中，高麗參治療顯著降低了活性氧含量，明顯提高了CREM表達(dá)。這結(jié)果證實(shí)了活性氧是引起CREM表達(dá)降低的原因，也意味著：高麗參通過減少活性氧的產(chǎn)生來提高CREM表達(dá)。結(jié)合前面的結(jié)論：高麗參通過提高CREM表達(dá)來減輕睪丸的損傷，我們認(rèn)為，高麗參通過減少活性氧的產(chǎn)生來提高CREM表達(dá)，從而保護(hù)睪丸的生精功能。

我們使用的高麗參劑量(1.0 g/kg/d)參考了Park等人的報(bào)道[2]，與扭轉(zhuǎn)復(fù)位組相比，治療組的這個(gè)劑量顯著降低了丙二醛水平，提高了CREM表達(dá)和生精功能，但治療后丙二醛水平、CREM表達(dá)和生精功能仍然沒有恢復(fù)到正常水平，這可能與藥物劑量有關(guān)，需要進(jìn)一步研究來確定最佳治療劑量。

總之，我們證實(shí)了高麗參對(duì)睪丸缺血再灌注損傷具有明顯保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討，這將為臨床治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Wei SM, Yan ZZ, Zhou J. Role of cAMP-responsive element modulator-tau (CREMtau) in ipsilateral testicular injury after unilateral testicular torsion-detorsion [J]. Fertil Steril, 2008, 89(6):1737-1742.

[2]Park WS, Shin DY, Kim do R, et al.

Korean ginseng induces spermatogenesis in rats through the activation of cAMP-responsive element modulator (CREM) [J]. Fertil Steril，2007，88(4):1000-1002.

[3]Nantel F, Monaco L, Foulkes NS, et al. Spermiogenesis deficiency and germ-cell apoptosis in CREM-mutant mice [J]. Nature, 1996, 380(6570):159-162.

[4]Kim CS, Park JB, Kim KJ, et al. Effect of Korea red ginseng on cerebral blood flow and superoxide production [J].Acta Pharmacol Sin, 2002,23(12):1152-1156.

[5]金惠銘.病理生理學(xué)[M].第四版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000.147-148.

[6]王迪潯.病理生理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1994.366-381.

[7]Wei X, Su F, Su X, et al. Stereospecific antioxidant effects of ginsenoside Rg3 on oxidative stress induced by cyclophosphamide in mice [J]. Fitoterapia, 2012,83(4):636-640.

Experimentalstudyoftesticularischemia-reperfusioninjurytreatedwithKoreanginseng

WEISiming1,YANZhizhong2,ZHOUJian3

(1. Zhejiang Medical College, Hangzhou310053,China；2. Red Cross Hospital of Hangzhou City, Hangzhou 310003, China；3. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China)

韋思明(1971-)，男，浙江杭州人，博士，副教授。研究方向：泌尿外科學(xué)

浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):2008B05)

R697.22

A

1672-0024(2013)02-0035-04

作者簡(jiǎn)介：張 焱(1973-)，女，浙江金華人，本科，副主任護(hù)師 。研究方向：老年護(hù)理