肺類器官
——研究人類肺部發(fā)育和疾病的新途徑

楊天立，王向東，白 楠，董柳含，車皓月，蔡 蕓 解放軍總醫(yī)院 醫(yī)療保障中心，藥劑科，藥物臨床研究室，北京 00853； 解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 00853

肺是由一個高度分支的管道系統(tǒng)組成的復(fù)雜器官，能夠參與各種重要的生理過程，包括氣體交換和免疫防御。肺的發(fā)育是一個復(fù)雜而精密的過程，任何階段的失敗/缺陷都可能導(dǎo)致嚴重的先天性疾病甚至死亡。在成人肺內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的情況下，細胞更新率通常很低?，F(xiàn)有的呼吸道祖細胞處于靜止狀態(tài)，而這些祖細胞在應(yīng)對各種損傷時具有增殖和分化為一種或多種細胞的能力[1]。這種能力引起了研究者的廣泛關(guān)注。雖然目前部分動物模型能夠用來研究肺的發(fā)生和發(fā)病機制，但種屬差異性卻限制了許多試圖闡明人類肺特性和發(fā)育的研究。目前，以胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)和誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)為主的人類多能干細胞(human pluripotent stem cell，hPSC)最常被用于體外研究人的肺部生理學(xué)和病理學(xué)[2]。3D體外模型被認為是最接近實際器官的模型，因此也被稱為“類器官”，通常具有與原生器官相似的結(jié)構(gòu)組織、來自多個胚層的細胞類型以及多個細胞譜系[3]。近年來，類器官也逐漸成為研究體外發(fā)育過程、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和病理狀況的復(fù)雜生理學(xué)模型[4]。人類類器官能夠進行人類出生缺陷、人類特異性病原體以及臨床試驗前對試驗藥物進行療效篩選等研究。同時在人類肺中干/祖細胞的特性研究，尋找哮喘和肺囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)等疾病的新療法，以及內(nèi)源性修復(fù)在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、肺氣腫、家族性和特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)和閉塞性細支氣管炎綜合征(bronchiolitis obliterans syndrome，BOS)等疾病中作用的研究方面，肺類器官也具有很大的應(yīng)用前景[5-6]。本文著重介紹肺類器官的主要類別及研究現(xiàn)狀、肺類器官的培養(yǎng)過程、肺類器官技術(shù)的獨特應(yīng)用、肺類器 官培養(yǎng)的主要局限。

1 肺類器官的主要來源及研究現(xiàn)狀

成人肺包括近端和遠端兩個區(qū)域，氣管、支氣管和細支氣管構(gòu)成傳導(dǎo)區(qū)(氣道)，由Club細胞、杯狀細胞、纖毛細胞、基底細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞組成，通過黏膜纖毛活動排出異物和病原體，有助于濕潤空氣和保護肺部。進行氣體交換的呼吸區(qū)(肺泡)由Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial type 1 and type 2，AT1 and AT2 cells)以及相關(guān)血管系統(tǒng)組成。肺類器官則主要由兩種來源的細胞產(chǎn)生——從成熟肺組織分離的上皮干/祖細胞[7]和人類多能干細胞[8-10]，前者包括基底祖細 胞、氣道分泌細胞和AT2細胞。

1.1 基底祖細胞 基底細胞排列在人的大部分氣道和小鼠的主支氣管中，緊貼基底層，不延伸到管腔[1]?；准毎禺惐磉_的基因包括編碼轉(zhuǎn)錄因子Trp63、細胞角蛋白Krt5、整合素α6(integrin alpha 6，Itga6)、平足蛋白(podoplanin，Pdpn；也稱為T1α)和跨膜神經(jīng)生長因子受體(nerve growth factor receptor，Ngfr；也稱為p75)的基因[11]。

從人類肺組織中分離的基底細胞通過擴增能夠獲得類器官，而不同類器官則根據(jù)基底細胞是來源于氣管還是大氣道命名。在標準條件下，類器官應(yīng)包含TRP63+KRT5+基底細胞、功能性纖毛細胞和分泌杯狀細胞(MUC5AC+，MUC5B+)[12-15]。由于基底細胞也存在于鼻腔上皮細胞中，因此從這些細胞中獲得的類器官能夠方便臨床醫(yī)生對患者進行最終的藥物篩選[16]。人類基底細胞來源的類器官目前能夠被用來篩選影響纖毛細胞和分泌細胞比例的細胞因子和其他蛋白質(zhì)，未來也可能作為某些穩(wěn)態(tài)失衡性疾病的潛在治療手段，如慢性哮喘。但目前由于缺乏檢測基因表達的方法，使 用人類類器官作篩選仍受到較大的限制[6]。

1.2 氣道分泌細胞 分泌細胞是指肺部氣道上皮中的柱狀、無纖毛、非神經(jīng)內(nèi)分泌細胞，主要有Club細胞和杯狀細胞。成熟的Club細胞能夠合成并儲存Secretoglobins(Scgb1a1，Scgb3a2)和Splunc1等蛋白質(zhì)，而杯狀細胞能夠合成并儲存黏蛋白Muc5AC和Muc5B等。

Club細胞是一個異質(zhì)性細胞群，在病毒和細菌感染、損害氣道或肺泡上皮細胞的因子作用下，能夠表現(xiàn)出相當(dāng)強的表型可塑性[17]。使用化療藥物博來霉素損傷肺泡區(qū)域后，譜系追蹤研究可以發(fā)現(xiàn)遠端細支氣管中表達Scgb1a1的細胞進行增殖并在肺泡中產(chǎn)生具有AT1和AT2細胞特征的后代細胞[18]。類器官培養(yǎng)提供了一個模型系統(tǒng)，理論上可以用于測試細胞因子和生長因子對單個細胞增殖和分化的影響，以及識別具有較強再生潛力的Club細胞亞群。然而，目前缺乏同時純化和定位這些Club細胞亞群的有效表面標志物。

氣道分泌細胞類器官的研究目前只在小鼠中實現(xiàn)，主要使用流式細胞熒光分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)。McQualter等[19]基于檢測表面標記表達的方法分離出Scgb1a1+細胞用來構(gòu)建類器官，而Chen等[20]使用Scgb1a1-CreER敲入等位基因和熒光表達等位基因進行譜系追蹤，分離出Club細胞進行類器官研究。這些結(jié)果顯示了Club細胞亞群與AT2細胞亞群轉(zhuǎn)化為基底細胞的能力確實存在差異。而后，用類器官培養(yǎng)測試遠端細支氣管中同時表達Sftpc的部分Scgb1a1+Club細胞亞群對肺內(nèi)皮細胞因子的反應(yīng)[18,21]，結(jié)果表明細支氣管肺泡干細胞(bronchioalveolar stem cell，BASC)具有分化為AT2細胞和氣道細胞的潛力。

目前，分離BASC的標準方法涉及FACS和其是否表達EpCAM和Sca1。未來的新技術(shù)將使這些細胞能夠在編碼Scgb1a1和Sftpc基因共表達的基礎(chǔ)上得到更嚴格的純化，從而找到其他標志物 來區(qū)分BASC與其他Club細胞。

1.3 AT2細胞 肺泡上皮細胞有兩種不同的形態(tài)及功能：AT2細胞，呈立方形，能夠產(chǎn)生肺泡表面活性物質(zhì)(如Sftpc、Sftpb)、板層小體以及與它們的生成和分泌有關(guān)的基因(如Lamp3和Lyz2)，肺泡表面活性物質(zhì)可以降低肺泡表面張力，防止肺泡塌陷[22]；AT1細胞，大鱗狀細胞，覆蓋肺泡的大部分表面積，與毛細血管緊密相連，通常表達糖基化終產(chǎn)物特異性受體(advanced glycosylation end product-specific receptor，Ager)、Pdpn和轉(zhuǎn)錄因子Hopx。

由于肺氣腫和特發(fā)性肺纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病影響氣體交換區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能，需要更多地了解肺泡干細胞的生物學(xué)特性。人類的AT2細胞可以通過FACS或磁珠分選(magnetic bead sorting，MACS)經(jīng)由單克隆抗體HTII280進行特異性分離。

肺泡的形成需要支持細胞的存在，為了更接近上皮細胞和間充質(zhì)細胞之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系，需要一種能夠使兩種細胞群都能存活的培養(yǎng)基[19]。幾種不同的支持細胞群已用于小鼠類器官的構(gòu)建，與免疫/巨噬細胞亞群結(jié)合的效果正在研究中。同樣，使用損傷前還是損傷后分離的細胞、老年小鼠還是年輕小鼠的細胞、攜帶與人類肺泡疾病相關(guān)特定突變細胞的研究也正在進行中[23]。

用類器官研究肺泡上皮細胞基因功能的主要困難是小鼠或人的AT2細胞均不能在Matrigel基質(zhì) 膠中進行有效的培養(yǎng)擴增。

1.4 hPSC 目前研究者們正在努力培育未成熟的肺上皮細胞和間充質(zhì)祖細胞，這些細胞能夠被大量擴增，然后定向分化為成熟的氣道和(或)肺泡組織。如來源于慢性哮喘或CF患者的iPSC所生成的氣道上皮細胞，可用來驗證祖細胞表觀遺傳學(xué)的改變能夠影響其自我更新和分化能力這一觀點[24]，以及CF患者iPSC來源的肺類器官也可以提供一個可靠和可重復(fù)的突變細胞來源，以篩選補償或糾正患者特異性突變的藥物[25]。

在肺泡組織中，hPSC分化為遠端肺祖細胞將有助于研究AT2細胞的突變，這些突變可以導(dǎo)致呼吸衰竭和間質(zhì)性肺病。對健康者和患者特異性hPSC來源的遠端上皮進行組學(xué)對比，將有助于更好地了解突變細胞如何隨著時間的推移而失調(diào)[26]。進行CRISPR/Cas9基因編輯后仍能夠擴增并穩(wěn)定分化的祖細胞，有助于該技術(shù)能夠在發(fā)育過程中檢測人類特異基因在氣道和肺泡細胞分化中的功 能。

2 肺類器官的培養(yǎng)過程

與成熟肺上皮干/祖細胞來源的類器官相比，多能干細胞(pluripotent stem cell，PSC)來源的類器官需要額外的處理步驟，即將PSC誘導(dǎo)為肺上皮干/祖細胞，肺類器官培養(yǎng)的全程都涉及體內(nèi)多種 信號通路嚴格的時間和空間控制。

2.1 hPSC向前部前腸球體分化 首先，使用重組人激活素A(Activin A)誘導(dǎo)PSC分化為終末內(nèi)胚層(definitive endoderm，DE)，在DE形成后，通過使用Noggin和小分子抑制劑(SB431542)分別抑制BMP和TGF-β信號通路，從而獲得前腸特性，生成SOX2+AFE。許多信號通路對肺的誘導(dǎo)和發(fā)育非常重要，Activin A模擬的Nodal信號在脊椎動物的DE發(fā)育中起著決定性的作用，而成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)gf)和Wnt信號的激活協(xié)同促進了hPSC源性內(nèi)胚層中CDX2+腸道譜系的形成，同時也促進了2D結(jié)構(gòu)自我組織轉(zhuǎn)化為由間充質(zhì)層和極化上皮層組成的3D球體，抑制BMP和TGF-β信號能夠促使組織進 入SOX2+前腸譜系[27]。

2.2 通過Fgf和Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)前腸內(nèi)胚層(anterior foregut endoderm，AFE)進入肺譜系 為了進一步使前腸球體向肺譜系發(fā)育，目前的研究主要集中于調(diào)控Fgf和Hedgehog(Hh)信號傳導(dǎo)。Fgf信號在肺生長和分支形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用，而Hh分子在體內(nèi)對肺間質(zhì)的增殖也有重要作用。高水平的Fgf分子可以誘導(dǎo)Sonic Hedgelog(SHh，即高等動物的Hh)在肺內(nèi)胚層的表達，同時誘導(dǎo)甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子陽性(NKX2.1+)的肺祖細胞發(fā)育，而在前腸球體期添加Hh激活劑(smoothened agonist，SAG)則是提高NKX2.1表達最有效的方法。目前這兩種信號通路的配體已經(jīng)應(yīng)用于2D培養(yǎng)的hPSC源性肺譜系[25,28]。

總的來說，在hPSC源性內(nèi)胚層培養(yǎng)物中加入Fgf 2、Fgf 4、BMP、Wnt和Hh等生長因子混合物，可以使其成功分化為表達NKX2.1的肺祖細 胞。

2.3 前 腸 球 體 生 成 人 肺 類 器 官(human lung organoid，HLO) 將前腸球體植入Matrigel基質(zhì)膠中，形成3D生長環(huán)境。在含有1%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中對前腸球體進行維持培養(yǎng)，3D培養(yǎng)20 d內(nèi)就會逐漸失去鈣黏蛋白(E-Cadherin，ECAD)陽性的上皮結(jié)構(gòu)并由間質(zhì)填充[29]。Fgf 10在成人肺的發(fā)育過程中，對于肺祖細胞的分支形成和維持以及組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)是必不可少的。與基礎(chǔ)條件和添加Fgf抑制劑相比，F(xiàn)gf 10促進維持ECAD+上皮結(jié)構(gòu)，減少間質(zhì)的形成，并且在整個HLO中都表達近端肺標志物SOX2和遠端肺標志物SOX9。隨著時間的推移，F(xiàn)gf 10處理的前腸球體能夠保持NKX2.1的表達；然而，遠端祖細胞標志物NMYC和ID2表達降低，而遠端A T1和AT2細胞標志物Hopx和Sftpc表達增加[30]。

2.4 HLO產(chǎn)生近端氣道樣結(jié)構(gòu) 培養(yǎng)2個月以上的HLO具有明顯的類似近端氣道的上皮結(jié)構(gòu)，能夠表達近端細胞特異性的標志物，如基底細胞表達P63、纖毛細胞表達FOXJ1、ACTTUB以及Club細胞表達SCGB1A1等，且近端類氣道組織常被平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)陽性的間充質(zhì)隔層所包圍[29]。在超過2個月的長時間培養(yǎng)時，能夠看到P63+細胞沿著上皮管樣結(jié)構(gòu)的基底側(cè)排列，并與SMA+間質(zhì)相鄰，類似于人類支氣管和細支氣管[15]。在HLO近端氣道樣結(jié)構(gòu)管腔面的細胞可表達纖毛細胞轉(zhuǎn)錄因子FOXJ1，另一種纖毛細胞標志物ACTTUB則定位于這些細胞的頂端側(cè)，但細胞表面并未發(fā)現(xiàn)纖毛，且鮮有細胞表達Club細胞標志物SCGB1A1[29]。

研究表明，hPSC源性纖毛細胞的成熟分化需要改變培養(yǎng)條件以促進細胞功能的分化，而Wnt通路能夠調(diào)節(jié)NKX2.1肺上皮祖細胞向近端氣道分化，使用Wnt激活劑(CHR99021)可促進向遠端上皮分化，而停用CHR99021可快速促進向近端上皮分化[10]。因此，Matrigel基質(zhì)膠和富含F(xiàn)gf 10的培養(yǎng)基并不會促進所有類型細胞向終末分化。此時，如果將前腸內(nèi)胚層接種于脫細胞肺基質(zhì)上，可以觀察到近端氣道樣結(jié)構(gòu)，如細胞頂端表面 ACTTUB+的纖毛結(jié)構(gòu)向腔內(nèi)成簇生長[29]。

2.5 HLO產(chǎn)生未成熟的肺泡氣道樣結(jié)構(gòu) 在HLO培養(yǎng)過程中肺遠端上皮細胞可表達包括SOX9、ID2和NMYC在內(nèi)的祖細胞標志物，其中SOX9為持續(xù)性表達，而ID2和NMYC表達量隨著培養(yǎng)時間延長而減少[30]。在肺泡相關(guān)生長因子作用下，與人成纖維細胞共培養(yǎng)，可獲得PSC源性肺泡。多數(shù)研究表明，聯(lián)合使用地塞米松、CHIR99021、Fgf 7、cAMP和磷酸二酯酶抑制劑IBMX足以促進肺泡分化并產(chǎn)生Sftpc+上皮細胞[9,31-33]。在一項長時間培養(yǎng)HLO的研究中，可以看到表達Sftpc和Sftpb的極少量AT2細胞，以及表達Pdpn和Hopx的極少量AT1細胞[29]，提示HLO主要為未分化的肺泡祖細胞，在遠端類氣道組織中分布著極少的分化成熟的AT1細胞和AT2細胞。

為了獲得遠端上皮細胞并部分克服PSC源性上皮細胞的成熟度限制，除了延長體外培養(yǎng)時間，與胎肺間質(zhì)共培養(yǎng)[32]、植入脫細胞肺基質(zhì)中[34]、在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)中進行分化[35]或小鼠腎包膜下的移植[28,31, 36]等方法也有探索。這些方法均表明，細胞外基質(zhì)的機械外力作用，以及來自細胞外基質(zhì)或來自間充質(zhì)細胞的分子信號均在促進肺泡上皮細胞分化方面起著關(guān)鍵作用。

3 肺類器官技術(shù)的獨特應(yīng)用

建立肺類器官有助于進一步了解肺部的發(fā)育過程和病理生物學(xué)，這兩點都是尋找治療呼吸系統(tǒng)疾病新方法的關(guān)鍵。人類肺部發(fā)育、修復(fù)和再生的幾個重要研究結(jié)果都是從小鼠模型中推斷出來的[37]。然而，人與鼠的肺組織之間存在著許多內(nèi)在差異，如基底細胞遍布于人體氣道，但在小鼠中僅限于氣管，亦如杯狀細胞在人呼吸道中常見，但在小鼠中少見等。雖然肺上皮細胞系能夠表現(xiàn)出人類肺組織的一些表性特征，但這些細胞系只能單層培養(yǎng)，并且很難通過其進一步了解肺組織發(fā)育和形成過程的影響因素，如上皮-間充質(zhì)相互作用和分支形態(tài)發(fā)生等[22]。因此，建立人體模型是準確研究人肺發(fā)育的關(guān)鍵。近年來，已經(jīng)成功實現(xiàn)了hPSC源性肺類器官的建立，雖然它們在體外培養(yǎng)時仍處于與胎肺相似的轉(zhuǎn)錄和功能狀態(tài)，但可以通過移植到小鼠腎包膜或附睪脂肪墊下使其形態(tài)成熟且具備一定的生理功能[29,31,38]。目前尚不清楚為什么類器官模型不能在體外“成熟”，但這些hPSC源性肺類器官具有的未成熟性狀成為探索未完全發(fā)育肺生理和病理過程的理想模型，最終能夠為肺部發(fā)育不成熟的早產(chǎn)兒開發(fā)新的治療方法。

對于某些呼吸道疾病研究來說，小鼠并非完美模型，如在建立小鼠CF模型時，通過致病基因囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)突變的方法，小鼠模型并不能完全重現(xiàn)人類疾病的癥狀[39]。目前，通過CFTR突變的肺類器官可以成功建立CF類器官模型，并表現(xiàn)出關(guān)鍵的CF表型[40]，這項研究表明肺類器官是一種易于操作的模型，可用于體外檢測CFTR藥物的療效。杯狀細胞化生是一種與CF、哮喘和COPD相關(guān)的表型，亟需體外人體模型來開發(fā)新的治療方法。最近一項對人肺類器官的研究發(fā)現(xiàn)，IL-13和IL-17A均可誘導(dǎo)黏膜高分泌表型，使纖毛細胞標志物減少且杯狀細胞標志物增多，而Notch信號的調(diào)節(jié)是IL-13誘導(dǎo)的黏膜高分泌表型的一個控制因素，抑制Notch2可以防止杯狀細胞化生[13]。因此，Notch通路是目前治療杯狀細胞化生的一個潛在的治療干預(yù)靶點，該項研究也突出了類器官對呼吸系統(tǒng)研究的價值。

目前人們關(guān)于感染對呼吸道的影響及其發(fā)病機制的了解有限，主要是由于缺乏一個真實的模型來重現(xiàn)體外感染的表型。近年來，hPSC源性肺類器官已被用于研究麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)和人類副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3，HPIV3)感染[31,41]。嬰幼兒呼吸道感染主要由RSV引起，目前尚無疫苗或有效藥物，而RSV感染的hPSC源性肺類器官則再現(xiàn)了RSV感染人肺的重要特征，即感染細胞腫脹，與上皮細胞分離并脫落到受感染的支氣管腔中。HPIV3是兒童下呼吸道疾病的常見病因，HPIV3感染的肺類器官在組織完整性方面沒有明顯變化，也沒有感染細胞脫落到管腔中，與臨床表現(xiàn)一致，且肺類器官中的HPIV3全基因組測序與在臨床環(huán)境中分離的病毒也完全相同。這些研究表明，肺類器官可以作為研究呼吸道病毒發(fā)病機制的可靠模型，能夠重現(xiàn)宿主的感染情況，為研究宿主-病原體相互作用、肺部感染和病毒在肺部傳播機制提供了一個有價值的工具。引起COVID-19大流行的2019-nCoV主要導(dǎo)致包括AT2細胞在內(nèi)的肺上皮細胞損傷[42]，肺類器官能夠重現(xiàn)肺的結(jié)構(gòu)和細胞微環(huán)境，有望為揭示COVID-19發(fā)病機制和篩選有效治療藥物提供一個新方法。

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)自1832年被Koch發(fā)現(xiàn)以來，對東南亞和一些非洲國家的人口健康構(gòu)成了巨大威脅[43-44]。世界衛(wèi)生組織提出2035年消除結(jié)核病這一策略，在此過程中最大的障礙是耐藥菌株的出現(xiàn)以及HIV合并感染[45]。用于研究結(jié)核病病理學(xué)和藥物篩選的動物模型有幾個明顯的缺陷。首先，通常容納MTB感染動物的設(shè)施都很昂貴，限制了動物在結(jié)核病研究中的應(yīng)用；此外，這些動物不是MTB的天然宿主，因此它們只能部分模擬結(jié)核病的臨床癥狀、特征性的病理病變(肉芽腫形成和肺空洞)和免疫指標變化[46]。而人肺類器官的顯著優(yōu)勢在于其空間結(jié)構(gòu)的存在和細胞成分的異質(zhì)性[47]，肺泡類器官的MTB感染可以納入非常早期的MTB(動物模型很難做到)，而且還能克服種屬差異[48]。因此，將MTB注射到人肺泡類器官可用來研究MTB與肺泡上皮細胞之間的直接作用，或?qū)⒚庖呒毎?如巨噬細胞等)加入類器官結(jié)構(gòu)中模擬體內(nèi)免疫反應(yīng)的復(fù)雜性[47]。

研究腫瘤發(fā)生和早期肺癌的特征可以大大提高早期診斷肺癌的能力，但目前肺癌的早期診斷能力仍較差，通常是其他醫(yī)療檢查時意外發(fā)現(xiàn)[22,49]。肺癌的動物模型可以提供豐富的信息，但也存在著顯著的種屬差異，如人類細胞轉(zhuǎn)化過程中與嚙齒類動物所需的致癌和抑癌基因是不同的，這些差異可能會阻礙小鼠研究成果向人類的轉(zhuǎn)化。而用人肺類器官體外模擬肺癌發(fā)生過程較肺癌細胞系具有明顯的優(yōu)勢，其包含多種正常的肺細胞類型，還可以通過基因工程檢測特定突變驅(qū)動前體細胞的轉(zhuǎn)化能力[22]。因此，探索肺類器官的致癌性轉(zhuǎn)化將有助于開發(fā)可用于研究腫瘤發(fā)生的模型，并能夠提供用于人體治療評估的新臨床模 型。

4 肺類器官培養(yǎng)的主要局限性

hPSC源性肺類器官極大地促進了我們對肺發(fā)育、再生以及肺部疾病發(fā)病機制的認識，迄今為止，它是唯一能夠研究不同生殖層起源細胞之間相互作用的完全人源性模型。而以肺類器官作為研究手段獲得研究益處之前，其存在的局限性需要研究者們共同解決。

肺類器官模型面臨的最大挑戰(zhàn)之一是其無法在體外達到完全成熟。雖然可以通過在小鼠腎包膜下或附睪脂肪墊下進行移植來促進肺類器官成熟，但在異位移植的情況下，無法進行氣體交換等原發(fā)性肺功能的研究。最近的一項研究證實了經(jīng)氣管內(nèi)移植后的hPSC源性肺類器官在小鼠受損肺中存活的能力，提示了原位肺移植模型能夠為肺類器官的植入、分化和功能提供一個更好的環(huán)境[50]。在這種情況下，需要解決的另一個問題則是移植細胞是否在功能上整合到宿主肺組織中并長期存活，且保留完整肺轉(zhuǎn)錄組的表達。這就需要更全面地探索介導(dǎo)人類肺部終末分化的分子機制，然而由于倫理問題，人們對妊娠晚期和產(chǎn)后肺發(fā)育的研究非常有限[2]。

肺類器官應(yīng)用的另一個限制是其缺乏免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。目前，體外培養(yǎng)或體內(nèi)移植的肺類器官不具備自身的血管系統(tǒng)、免疫細胞(如肺泡巨噬細胞)等，而這些系統(tǒng)的成分和功能在調(diào)節(jié)干細胞行為和肺組織結(jié)構(gòu)形成中也起著關(guān)鍵作用[47]。

肺類器官在藥物研發(fā)中的應(yīng)用也存在著挑戰(zhàn)。大多數(shù)藥物篩選平臺要求使用相同的起始材料，如相應(yīng)條件下相同的起始細胞數(shù)，從而獲得比較可靠的結(jié)果[47]。而類器官是self-organize的組織，通常大小并不一致。如想要在類器官形成過程中控制其大小和直徑，則可能會影響其分化的軌跡，又會使其失去招募和組織細胞的自由。但肺類器官仍是基于表型的藥物發(fā)現(xiàn)平臺(phenotypebased drug discovery，PDD)[51]的選擇之一。

近年來，患者細胞來源的3D類器官培養(yǎng)物為肺部腫瘤類器官作為個性化用藥工具提供了可能[52-54]。但單純肺腫瘤類器官的建立仍是一個主要問題，可能會限制其在臨床上的應(yīng)用。最近的一項研究表明，大多數(shù)來源于肺內(nèi)非小細胞肺癌的類器官會被過度生長的正常氣道類器官所替代 ，從而限制了單純肺癌類器官的應(yīng)用[55]。

5 結(jié)語

類器官技術(shù)是研究細胞間通訊和宿主-病原體相互作用的一種新病理模型，也是人類肺部疾病建模、藥物篩選和毒性分析的有力工具。這種工具可以代替一些動物實驗，從而減少動物在呼吸系統(tǒng)研究中的使用。未來待該技術(shù)成熟后，可以建立一個用于細胞治療或基因治療的人肺類器官庫，為研究個體對治療的反應(yīng)和個性化藥物的開發(fā)開辟了新途徑。盡管目前用類器官技術(shù)模擬遠端肺部疾病仍存在難以模擬氣體交換過程中肺部膨脹和收縮的機械力、缺乏成熟的體外培養(yǎng)等局限性，但目前hPSC源性肺類器官的研究極大推進了呼吸道疾病的治療和臨床/基礎(chǔ)研究，而肺類器官的應(yīng)用與活體成像、基因工程和生物材料等新技術(shù)的結(jié)合將極大促進肺部相關(guān)研究進展。