中藥復(fù)方抑菌液的體外抑菌性能研究

王佳慧 張紅強(qiáng) 張佳美 陳 躍

（1.山西振東制藥股份有限公司，山西長(zhǎng)治，047100；2.山西振東健康生物科技股份有限公司，山西長(zhǎng)治，047100）

化學(xué)防腐劑以其價(jià)格低廉、防腐效果好而被廣泛應(yīng)用。但現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)人們的身體健康有不良影響，應(yīng)嚴(yán)格限制其在產(chǎn)品中的用量。因此，開(kāi)發(fā)高效、廣譜、安全、穩(wěn)定且便宜的新型天然防腐劑具有重要的意義[1]。

我國(guó)中草藥資源豐富、歷史悠久，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中草藥具有顯著的抗菌、抑菌作用。同現(xiàn)今廣泛使用的抗生素以及化學(xué)防腐劑相比，中草藥中所含的抗抑菌物質(zhì)具有毒副作用小、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。因此，以中草藥提取物代替化學(xué)防腐抑菌劑，已成為諸多領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)[2]。

本文主要研究不同提取方法提取的清熱解毒類(lèi)、清熱燥濕類(lèi)藥物的中藥復(fù)方制劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的體外抑菌效果。以《中國(guó)藥典》的相關(guān)記載為依據(jù)，選取板藍(lán)根、牛蒡子、蒲公英、公丁香、金銀花、苦參、蛇床子、甘草為中藥復(fù)方進(jìn)行抑菌效果研究。其抑菌作用可能是由于這些藥物中富含的黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、酚類(lèi)等中藥活性成分能協(xié)同破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞壁，影響能量代謝，抑制菌體蛋白質(zhì)和核酸的合成[3]。

本研究的目的在于篩選長(zhǎng)效廣譜高效的中藥抑菌液。所用供試菌分別代表G+細(xì)菌群，G-細(xì)菌群、酵母菌和絲狀真菌群，具有菌群代表性，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果具有代表性和可靠性[4]。

1 材料

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，白色念珠菌均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供，無(wú)水硫酸氫二鈉由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，氯化鈉、磷酸二氫鉀由天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 中藥

苦參、蛇床子、金銀花、丁香、蒲公英、板藍(lán)根、牛蒡子、甘草均由山西道地中藥材有限公司提供。

2 方法

2.1 中藥提取液制備

2.1.1 中藥組方

板藍(lán)根20 g、牛蒡子20 g、蒲公英20 g、公丁香40 g、苦參40 g、蛇床子10 g、金銀花10 g、甘草10 g。

2.1.2 中藥提取

（1）水提液制備：按照配方稱(chēng)取中藥，第一次加8倍于中藥的去離子水浸泡1 h，加熱至微沸，煎煮1.5h，用200目篩濾過(guò)；煎煮2次，合并所得藥液，濃縮至相應(yīng)體積，使其終濃度為1.00 g/ml，100 ℃30 min滅菌，裝瓶并置于4 ℃冰箱保存待用。

（2）醇提液制備：按照配方稱(chēng)取中藥，分別加入20%、40%、60%、80%的酒精溶液，加熱至微沸，回流提取1.5 h，用200目篩濾過(guò)；加熱回流提取2次，合并所得藥液，60 ℃，-0.08 MPa條件下減壓濃縮將酒精除去，使其終濃度為1 g/ml，100 ℃、30 min滅菌，裝瓶并置于4 ℃冰箱保存待用。

2.2 抑菌率檢測(cè)

2.2.1 菌種制備

在無(wú)菌條件下，將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌接入對(duì)應(yīng)的試管斜面營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，然后置于0~4 ℃冰箱中冷藏備用。分別用接種環(huán)挑取少許菌體置于裝有9 ml無(wú)菌生理鹽水的試管內(nèi)，振蕩搖勻，制成菌懸液。調(diào)整菌懸液濃度，使其含菌量為106 cfu/ml[5]。

在無(wú)菌條件下，將白色念珠菌接入相對(duì)應(yīng)的試管斜面改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，然后置于0~4 ℃下冷藏備用。分別用接種環(huán)挑取少許菌體置于裝有9 ml無(wú)菌生理鹽水的試管內(nèi)，振蕩搖勻，制成菌懸液。調(diào)整菌懸液濃度，使其含菌體量為105 cfu/ml。

2.2.2 抑菌檢測(cè)方法

按照《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[6]GB15979-2002進(jìn)行抑菌性能檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.3 穩(wěn)定性測(cè)試方法

選取對(duì)3種菌的抑菌效果都比較好的2、3、4、5號(hào)提取液，進(jìn)行抑菌穩(wěn)定性測(cè)試。

取以上中藥提取液各2份，一份加入0.5%的D-異抗壞血酸鈉，一份不加，分別放入溫度為37 ℃、濕度75%的恒溫箱內(nèi)3個(gè)月。最后，取出恢復(fù)至室溫，再進(jìn)行同樣抑菌率測(cè)試。通過(guò)比較封存前后抑菌率的變化，評(píng)價(jià)其抑菌穩(wěn)定性。

2.2.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1）抑菌率≥50%～90%，產(chǎn)品有抑菌作用，抑菌率≥90%，產(chǎn)品有較強(qiáng)抑菌作用。

（2）樣品經(jīng)37 ℃加速試驗(yàn)，其殺菌率或抑菌率達(dá)到（1）中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)值，樣品抑菌作用在室溫下至少保持2年。

3 結(jié)果分析

3.1 不同提取方法所得中藥液的抑菌率結(jié)果

見(jiàn)表1～表3。

表1 對(duì)白色念珠菌的抑菌率結(jié)果

表2 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率結(jié)果

表3 對(duì)大腸桿菌的抑菌率結(jié)果

水提液對(duì)白色念珠菌無(wú)抑菌效果，醇提液對(duì)白色念珠菌的抑菌率均＞50%，表明醇提液抑菌效果優(yōu)于水提液，且提取介質(zhì)中酒精濃度含量越高抑菌效果越好。

本文收治的對(duì)象為80例胰腺癌患者，收治的時(shí)間為2017年9月—2018年9月，根據(jù)電腦隨機(jī)的方式，將觀察對(duì)象分為兩組，即常規(guī)組、研究組各40例。研究組中男性觀察對(duì)象20例，女性觀察對(duì)象20例，年齡30～77歲，平均（53.3±5.5）歲；病程3個(gè)月～3年，平均（19.1±2.4）個(gè)月。常規(guī)組中男性觀察對(duì)象22例，女性觀察對(duì)象18例，年齡30～78歲，平均（53.5±5.4）歲；病程2個(gè)月～3年，平均（19.2±2.2）個(gè)月。兩組資料客觀對(duì)比，P值＞0.05，無(wú)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可分組研究。均簽署研究同意書(shū)；通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查；經(jīng)病理檢查予以確定。排除精神異常、意識(shí)障礙、心腦血管?chē)?yán)重疾病者。

水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率＞50%，表明有抑菌效果，其余4種醇提液抑菌率＞90%，抑菌效果較強(qiáng)，醇提效果優(yōu)于水提。

5種提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌率＞90%，抑菌效果較強(qiáng)，不同提取方法對(duì)大腸桿菌的抑菌率無(wú)明顯區(qū)別。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水提液對(duì)細(xì)菌的抑菌效果較好，是因?yàn)槠压?、板藍(lán)根、甘草等富含的多糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抑制作用，而對(duì)白色念珠菌的抑菌效果不明顯。隨著提取介質(zhì)中酒精含量增高，黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)含量增加，這幾類(lèi)物質(zhì)對(duì)這3種菌均有較好的抑制作用。

3.2 抑菌穩(wěn)定性結(jié)果

見(jiàn)表4～表6。

表4 對(duì)白色念珠菌的抑菌結(jié)果

表5 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果

表6 對(duì)大腸桿菌的抑菌率結(jié)果

不同濃度的酒精提取液對(duì)白色念珠菌的抑菌均＜50%，沒(méi)有抑菌效果，抑菌穩(wěn)定性差。

不同濃度的酒精提取液對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌率均＞50%，抑菌穩(wěn)定性較好。

不同濃度的酒精提取液對(duì)大腸桿菌抑菌率均＞90%，抑菌穩(wěn)定性好。

由以上結(jié)果可知，不同濃度的酒精提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的穩(wěn)定性較好，對(duì)白色念珠菌的抑菌穩(wěn)定性與提取介質(zhì)中乙醇含量成反比，乙醇含量越高抑菌穩(wěn)定性越差?？赡苁且?yàn)槎嗵穷?lèi)物質(zhì)性質(zhì)較穩(wěn)定，因此對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果，而黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等物質(zhì)在高溫條件下易被氧化、分解，破壞了原來(lái)的分子結(jié)構(gòu)，因此對(duì)白色念珠菌的抑菌效果下降。

3.3 加入抗氧化劑后的抑菌穩(wěn)定性結(jié)果

見(jiàn)表7～表9。

表7 對(duì)白色念珠菌的抑菌結(jié)果

表8 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率結(jié)果

表9 對(duì)大腸桿菌的抑菌率結(jié)果

2號(hào)、3號(hào)兩個(gè)低濃度酒精提取液對(duì)白色念珠菌的抑菌率均＜50%，沒(méi)有抑菌效果，穩(wěn)定性較差，4號(hào)、5號(hào)兩個(gè)高濃度酒精提取液對(duì)白色念珠菌的抑菌率均＞90%，抑菌穩(wěn)定性明顯提高。

不同濃度酒精提取液對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌率均＞90%，抑菌穩(wěn)定性好。

不同濃度酒精提取液對(duì)大腸桿菌抑菌率均＞90%，抑菌率穩(wěn)定性好。

由以上結(jié)果可知，加入抗氧化劑D-異抗壞血酸鈉后，對(duì)3種菌的抑菌穩(wěn)定性總體上逐步提高。對(duì)白色念珠菌的影響較為明顯，當(dāng)溶劑為60%的酒精提取液時(shí)，抑菌穩(wěn)定性最好，這可能是因?yàn)镈-異抗壞血酸鈉的還原性要強(qiáng)于黃酮類(lèi)、酚類(lèi)等物質(zhì)，因此能夠有效地減緩黃酮類(lèi)、酚類(lèi)等物質(zhì)被氧化，延長(zhǎng)其抑菌作用。

4 結(jié)論與探討

用60%的酒精對(duì)復(fù)方中藥提取2次所得中藥提取液，對(duì)白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作用2 min，各次抑菌率均＞90%，作用效果最好?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，中草藥中的黃酮、生物堿、有機(jī)酸、酚類(lèi)等成分，對(duì)多種致病菌具有抑制作用，加入抗氧化劑（D-異抗壞血酸鈉）后，能有效保護(hù)還原基團(tuán)，使提取液對(duì)3種菌的抑菌穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，該提取液在室溫下的抑菌效果至少可保持2年。

該中藥復(fù)方抑菌液，具有抑菌效果好，且毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，用于個(gè)人護(hù)理用品中不僅具有防腐的作用，同時(shí)兼具抗氧化、去皺、美白等功效。除此之外，也可開(kāi)發(fā)成消毒類(lèi)產(chǎn)品，用于疫情期間新冠病毒的防治。鑒于人們對(duì)綠色健康產(chǎn)品的不斷追求，相信此類(lèi)純天然抑菌液將會(huì)受到越來(lái)越多的關(guān)注。