柔肝化纖顆粒聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植術(shù)治療肝硬化失代償期的臨床療效及其對血清炎性因子水平和免疫功能及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

呂艷杭，吳姍姍，王振常，葉學(xué)勁，符燕青，段桂姣，蘇曉文，農(nóng)小欣

肝硬化指由一種或多種病因長期、反復(fù)刺激肝臟而造成的肝彌漫性損傷，肝硬化進(jìn)展至一定程度、超出肝臟代償能力時稱之為肝硬化失代償期。肝硬化失代償期主要臨床表現(xiàn)為肝功能減退和門靜脈高壓，發(fā)病率和致死率極高[1]。原位肝移植（OLT）是肝硬化失代償期等終末期肝病的理想治療方法，但由于肝臟供體緊缺、費(fèi)用高、免疫排斥反應(yīng)高等限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用[2-3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一種多功能干細(xì)胞，可在體內(nèi)分化為正常肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞，并可通過分泌多種促進(jìn)肝臟生長的因子而逆轉(zhuǎn)肝纖維化或肝硬化進(jìn)程[4-6]。

研究表明，炎性因子在肝硬化發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）、白介素（IL）-2、IL-10、IL-12等參與肝臟炎癥的發(fā)展，而促炎/抗炎因子失衡可加速肝硬化進(jìn)程[7-9]；Th1/Th2失衡也與肝纖維化、肝硬化有關(guān)[10]，其中Th1類細(xì)胞因子可抑制膠原蛋白合成及肝星狀細(xì)胞增殖，而Th2類細(xì)胞因子可促進(jìn)膠原蛋白合成及肝星狀細(xì)胞增殖并抑制二者降解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積及纖維化[11]；氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中形成的氧自由基可參與肝星狀細(xì)胞由上皮型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)型，引起機(jī)體氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，加快肝纖維化進(jìn)展為肝硬化的速度[12]。本研究旨在探討柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)治療肝硬化失代償期的臨床療效及其對血清炎性因子水平、免疫功能、氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病區(qū)及廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病區(qū)2016年5月—2019年5月收治的肝硬化失代償期患者120例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A組、B組和C組，每組40例。A組中男28例，女12例；年齡32～65歲，平均年齡（56.7±5.3）歲；病程6～13年，平均病程（9.2±3.2）年。B組中男26例，女14例；年齡34～68歲，平均年齡（58.4±5.3）歲；病程7～11年，平均病程（9.0±4.2）年。C組中男29例，女11例；年齡35～67歲，平均年齡（58.5±5.6）歲；病程7～12年，平均病程（9.2±3.6）年。三組患者性別（χ2=1.43，P=0.26）、年齡（F=1.26，P=0.35）、病程（F=0.96，P=0.58）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 肝硬化失代償期西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年《慢性乙型肝炎防治指南》[13]：（1）影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果提示肝細(xì)胞合成障礙、門靜脈高壓、脾大及食管-胃底靜脈曲張等；（2）臨床表現(xiàn)為蜘蛛痣、肝掌、腹腔積液、黃疸、男性乳房發(fā)育甚至肝性腦病等。肝硬化失代償期中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中鼓脹、黃疸的診斷標(biāo)準(zhǔn)，主癥為腹部脹滿、皮膚緊繃，甚至腹大如鼓，扣之有鼓音伴移動性濁音、納差、神疲乏力、脅痛及便溏等[14]。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合肝硬化失代償期的中、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌；（2）臨床資料不完整；（3）對造影劑過敏；（4）慢性腎功能不全（血肌酐＞300 μmol/L）；（5）妊娠或哺乳期女性；（6）嚴(yán)重心血管、肺、腎、腦疾病，內(nèi)分泌、造血系統(tǒng)等疾病，精神疾病。

1.4 剔除與脫落標(biāo)準(zhǔn) 剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)；（2）因臨床資料不完整而影響研究結(jié)果；（3）因研究數(shù)據(jù)不全而不能判斷臨床療效。脫落標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者中途退出研究；（2）不按照規(guī)定進(jìn)行治療；（3）未完成整個臨床試驗(yàn)。中止試驗(yàn)是指臨床試驗(yàn)尚未按預(yù)定方案完成但由于出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥等中止或停止全部試驗(yàn)。

1.5 治療方法

1.5.1 A組 A組患者采用內(nèi)科綜合治療，具體如下：（1）一般支持治療：臥床休息，減少體力消耗，減輕肝臟負(fù)擔(dān)，高蛋白、低脂肪、適量糖類飲食（進(jìn)食不足者可通過靜脈通路補(bǔ)充熱量及維生素），補(bǔ)充白蛋白或新鮮血漿以糾正低白蛋白血癥，并酌情補(bǔ)充凝血因子，注意糾正水、電解質(zhì)紊亂及消毒隔離，加強(qiáng)口腔護(hù)理，預(yù)防院內(nèi)感染。（2）針對病毒復(fù)制活躍期患者，可考慮給予抗病毒治療；采用乳果糖酸化腸道以減少腸道細(xì)菌異位；采用抗氧化劑還原型谷胱甘肽等進(jìn)行保肝治療；行促進(jìn)肝細(xì)胞生長治療以減少肝細(xì)胞壞死、促進(jìn)肝細(xì)胞再生；行免疫調(diào)節(jié)治療以調(diào)節(jié)肝衰竭患者免疫功能、減少感染等并發(fā)癥的發(fā)生，可酌情使用胸腺素α1等免疫調(diào)節(jié)劑。（3）防治肝性腦病、腦細(xì)胞水腫、肝腎綜合征等并發(fā)癥。經(jīng)內(nèi)科綜合治療無效者需盡早考慮人工肝支持治療甚至肝臟移植。

1.5.2 B組 B組患者在內(nèi)科綜合治療基礎(chǔ)上進(jìn)行1次BMSCs移植術(shù)，術(shù)后給予抗病毒治療1年。BMSCs移植方案：（1）移植前骨髓動員：動員劑為重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液（商品名：欣粒生，廈門特寶生物工程股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字S19990040），劑量為150 mg/次，使用頻率為1次/d，療程為5 d。注意每次使用動員劑前常規(guī)復(fù)查血常規(guī)和凝血功能，白細(xì)胞計數(shù)≤20×109/L且凝血功能無明顯異常者繼續(xù)使用；白細(xì)胞計數(shù)＞20×109/L或凝血功能明顯異常者則暫停使用，隔日復(fù)查后根據(jù)情況繼續(xù)應(yīng)用動員劑。（2）BMSCs的制備：在百級潔凈手術(shù)室環(huán)境下，嚴(yán)格按照外科無菌操作要求對患者進(jìn)行局部麻醉、消毒，之后通過穿刺患者髂骨抽取抗凝骨髓血約200 ml，采用細(xì)胞分離試劑盒（寧夏中聯(lián)達(dá)生物有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：160920）、負(fù)收集混合法分離BMSCs，并抽取適量標(biāo)本送檢驗(yàn)科進(jìn)行合格性檢驗(yàn)；最后采用0.9%氯化鈉溶液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度并在37 ℃恒溫條件下保存于無菌瓶內(nèi)，4 h內(nèi)行BMSCs移植術(shù)。（3）BMSCs的鑒定：采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原并進(jìn)行鑒別，以從成人骨髓中分離培養(yǎng)的BMSCs穩(wěn)定表達(dá)CD73、CD105、CD166而不表達(dá)CD34、CD45為合格BMSCs。（4）BMSCs移植術(shù)主要操作步驟：術(shù)前常規(guī)備皮、禁食6 h，在數(shù)字減影血管造影（DSA）引導(dǎo)、局部麻醉下采用Seldinger技術(shù)穿刺右側(cè)股動脈并置入5 F動脈鞘，引入5 F RH肝動脈導(dǎo)管并置于肝固有動脈；結(jié)合DSA顯示的血管分布情況在肝內(nèi)局部緩慢注入分離好的BMSCs懸液，注入完畢后拔出動脈鞘，加壓包扎穿刺部位，囑患者臥床休息24 h并進(jìn)行常規(guī)對癥處理。

本研究背景:

肝硬化是嚴(yán)重危害人們健康的重大疾病之一，而其治療仍是目前醫(yī)學(xué)界難題之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植術(shù)為肝硬化患者帶來了希望，但BMSCs在骨髓中含量極少且歸巢能力有限，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限。采用中醫(yī)藥招募內(nèi)源性干細(xì)胞的動員方案可促進(jìn)BMSCs歸巢肝臟，對充分發(fā)揮中醫(yī)藥維持或改善機(jī)體正常再生修復(fù)作用具有重要意義。

本研究創(chuàng)新點(diǎn):

國際上對干細(xì)胞的研究多著眼于移植和克隆，而通過藥物激活內(nèi)源性干細(xì)胞從而改善再生反應(yīng)與從外部植入干細(xì)胞是全然不同的新思路。在移植干細(xì)胞數(shù)量不足以恢復(fù)肝功能且內(nèi)源性干細(xì)胞自身遭破壞、修復(fù)能力有限的情況下，采用中醫(yī)藥招募內(nèi)源性干細(xì)胞的動員方案雖不能替代干細(xì)胞移植，但可以促進(jìn)BMSCs、體內(nèi)干細(xì)胞歸巢肝臟并分化為肝細(xì)胞，從而使殘留肝細(xì)胞群擴(kuò)展至足夠數(shù)量并提高其質(zhì)量。

本研究價值:

本研究采用先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)系統(tǒng)地從促BMSCs修復(fù)受損肝臟、促進(jìn)肝功能恢復(fù)、改善機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)炎性因子及氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面探討了中醫(yī)藥聯(lián)合 BMSCs移植術(shù)對肝硬化失代償期的協(xié)同增效作用，并用現(xiàn)代化語言闡釋了名老中醫(yī)學(xué)術(shù)理論，同時重視利用中醫(yī)藥調(diào)控機(jī)體再生修復(fù)機(jī)制以減少或防止機(jī)體再生病變、減少對移植干細(xì)胞數(shù)量的需求及培養(yǎng)擴(kuò)增等繁瑣操作，為干細(xì)胞動員提供了新的思路。

1.5.3 C組 C組患者在內(nèi)科綜合治療基礎(chǔ)上采用柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)，即在內(nèi)科綜合治療基礎(chǔ)上進(jìn)行1次BMSCs移植術(shù)，術(shù)后長期抗病毒治療同時給予柔肝化纖顆粒治療。柔肝化纖顆粒由黃芪45 g、牡蠣30 g、黃精20 g、枸杞20 g、薏苡仁45 g、橘紅10 g、澤蘭30 g、雞內(nèi)金15 g、鱉甲30 g、虎杖20 g、丹皮12 g、黑棗15 g組成，中藥材購自江蘇天陰天江藥業(yè)有限公司，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部嚴(yán)格按照1 g：6 g比例進(jìn)行顆粒配方；服用方法：藥品制成顆粒后裝袋（49 g/袋），溫開水沖服，1袋/次，早、中、晚各1次，合1劑/d；療程為1年。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 臨床療效 比較三組患者臨床療效。臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)：治療后患者臨床癥狀明顯改善，體征消失或明顯減輕，肝功能指標(biāo)和凝血酶原時間（PT）均恢復(fù)正常為顯效；治療后患者臨床癥狀和體征好轉(zhuǎn)或無明顯改善，肝功能指標(biāo)和PT較治療前下降＞50%為有效；治療后患者臨床癥狀和體征無明顯改善或出現(xiàn)加重，肝功能指標(biāo)和PT較治療前下降≤50%或病情出現(xiàn)惡化為無效。

1.6.2 主要中醫(yī)證候評分 比較三組患者治療前后主要中醫(yī)證候評分，包括脅痛、納差、神疲乏力、黃疸，分別按照無、輕、中、重計 0、1、2、3 分[14]。

1.6.3 肝功能指標(biāo)及PT 分別于治療前后采集三組患者清晨空腹外周靜脈血5 ml并置于抗凝管，采用低溫冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)，TD4）以3 000 r/min的速率在室溫條件下離心10 min，離心半徑為30 cm；取上清液，采用Olympus-Au640型全自動生化儀檢測肝功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBiL）；采用STAGO血凝儀檢測PT。

1.6.4 血清炎性因子水平 分別于治療前后采集三組患者清晨空腹外周靜脈血5 ml并置于抗凝管，如上離心后取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELLSA）檢測TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-12水平，試劑盒均購自上海拜力生物科技有限公司（生產(chǎn)批號分別為20170721、20171113、20180408、20181006）。

1.6.5 體液及細(xì)胞免疫功能指標(biāo) 分別于治療前后采集三組患者清晨空腹外周靜脈血5 ml并置于抗凝管，如上離心后取上清液，采用免疫比濁法檢測血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白E（IgE）水平，試劑盒購自艾森生物杭州有限公司（生產(chǎn)批號分別為181121、181009、180206、170820）；采用流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞亞群，包括CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值。

1.6.6 氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo) 分別于治療前后采集三組患者清晨空腹外周靜脈血5 ml并置于抗凝管，如上離心后取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求、采用ELLSA測定血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平，試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司（生產(chǎn)批號分別為20170918、20181206、20170324）。

1.6.7 不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥發(fā)生情況 記錄患者三組患者治療期間不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥發(fā)生情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級資料分析采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效 治療期間A組2例患者脫落，B組1例患者脫落，最終A組、B組分別納入38、39例患者。三組患者臨床療效比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=11.59，P=0.021）；C組患者臨床療效優(yōu)于A組（u=11.43，P=0.003）、B組（u=4.92，P=0.045），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）。

2.2 主要中醫(yī)證候評分 三組患者治療前脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分低于A組、B組，B組患者治療后脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表1 三組患者臨床療效比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of clinical responses in the three groups

2.3 肝功能指標(biāo)及PT 三組患者治療前血清ALT、AST、TBiL水平及PT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后血清ALT、AST、TBiL水平及PT比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后血清ALT、AST、TBiL水平低于A組、B組，PT短于A組、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組患者治療后血清ALT、AST、TBiL水平低于A組，PT短于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.4 血清炎性因子水平 三組治療前血清TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-12水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后血清TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-12水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后血清TNF-α、IL-2、IL-12水平低于A組、B組，血清IFN-γ、IL-10水平高于A組、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組患者治療后血清TNF-α、IL-2、IL-12水平低于A組，血清IFN-γ、IL-10水平高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

2.5 體液及細(xì)胞免疫指標(biāo) 三組患者治療前血清IgA、IgM、IgG、IgE水平和CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后血清IgA、IgM、IgG、IgE水平和CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后血清IgA、IgM水平和CD3+、CD4+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值高于A組、B組，血清IgG、IgE水平和CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于A組、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組患者治療后血清IgA、IgM水平和CD3+、CD4+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值高于A組，血清IgG、IgE水平和CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表5）。

2.6 氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo) 三組患者治療前血清SOD、MDA、GSH-Px水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后血清SOD、MDA、GSH-Px水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后血清SOD、GSH-Px水平高于A組、B組，血清MDA水平低于A組、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組患者治療后血清SOD、GSH-Px水平高于A組，血清MDA水平低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表6）。

表2 三組患者治療前后主要中醫(yī)證候評分比較（±s，分）Table 2 Comparison of mean scores of major TCM syndromes in the three groups before and after treatment

表2 三組患者治療前后主要中醫(yī)證候評分比較（±s，分）Table 2 Comparison of mean scores of major TCM syndromes in the three groups before and after treatment

注：與治療前比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) 脅痛 納差 神疲乏力 黃疸治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 2.3±0.2 1.4±0.1a 2.2±0.1 1.3±0.2a 2.0±0.2 1.1±0.1a 2.4±0.2 1.3±0.2a B 組 39 2.3±0.1 0.9±0.1ab 2.2±0.1 0.9±0.1ab 2.0±0.1 0.8±0.1ab 2.3±0.2 0.9±0.1ab C 組 40 2.3±0.2 0.5±0.1abc 2.1±0.1 0.5±0.1abc 2.0±0.2 0.5±0.1abc 2.4±0.2 0.5±0.1abc F值 1.50 29.30 1.00 58.30 0.51 31.40 0.40 46.20 P值 0.20 ＜0.01 0.40 ＜0.01 0.95 ＜0.01 0.68 ＜0.01

表3 三組患者治療前后肝功能指標(biāo)及PT比較（±s）Table 3 Comparison of mean levels of liver function markers and prothrombin time in the three groups before and after treatment

表3 三組患者治療前后肝功能指標(biāo)及PT比較（±s）Table 3 Comparison of mean levels of liver function markers and prothrombin time in the three groups before and after treatment

注：ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，TBiL=總膽紅素，PT=凝血酶原時間；與治療前比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） TBiL（μmol/L） PT（s）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 153±12 101±7 a 166±8 98±6a 82.1±4.0 71.5±3.1a 18.6±0.5 16.8±0.4a B 組 39 152±11 79±4ab 165±10 80±5ab 81.9±3.9 59.2±4.7ab 18.6±0.4 15.2±0.4ab C 組 40 153±11 58±5abc 165±9 54±7abc 82.5±4.2 43.7±4.4abc 18.6±0.6 13.3±0.6abc F值 0.10 68.20 0.20 53.80 0.20 44.50 0.10 52.40 P值 0.90 ＜0.01 0.90 ＜0.01 0.80 ＜0.01 0.90 ＜0.01

表4 三組患者治療前后血清炎性因子水平比較（±s）Table 4 Comparison of mean levels of serum inflammatory cytokines in the three groups before and after treatment

表4 三組患者治療前后血清炎性因子水平比較（±s）Table 4 Comparison of mean levels of serum inflammatory cytokines in the three groups before and after treatment

注：TNF-α=腫瘤壞死因子，INF-γ=干擾素γ，IL=白介素；與治療前比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) TNF-α（ng/L） IFN-γ（ng/L） IL-2（μg/L） IL-10（μg/L） IL-12（ng/L）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 66.55±3.76 54.42±2.66a 42.76±3.98 50.63±2.47a 66.54±2.85 57.16±2.31a 22.32±2.34 31.61±1.99a 73.21±3.89 60.47±4.45a B 組 39 67.72±3.86 49.03±2.21ab 43.26±3.69 58.26±3.38ab 66.51±2.42 48.92±3.26ab 22.38±1.50 38.46±2.26ab 72.97±3.62 55.26±5.48ab C 組 40 67.11±3.91 40.90±3.18abc 42.87±3.61 62.82±3.26abc 66.00±2.81 35.28±3.01abc 22.28±2.18 43.54±3.75abc 72.79±4.01 41.62±4.21abc F值 0.92 46.43 0.23 57.96 0.76 74.70 0.22 45.71 0.27 58.63 P值 0.40 ＜0.01 0.80 ＜0.01 0.47 ＜0.01 0.98 ＜0.01 0.93 ＜0.01

表5 三組患者治療前后體液及細(xì)胞免疫指標(biāo)比較（±s）Table 5 Comparison of mean levels of humoral and cellular immune markers in the three groups before and after treatment

表5 三組患者治療前后體液及細(xì)胞免疫指標(biāo)比較（±s）Table 5 Comparison of mean levels of humoral and cellular immune markers in the three groups before and after treatment

注：IgA=免疫球蛋白A，IgM=免疫球蛋白M，IgG=免疫球蛋白G，IgE=免疫球蛋白E；與治療前比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) IgA（g/L） IgM（mg/L） IgG（g/L） IgE（mg/L）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 0.66±0.07 0.90±0.08a 5.09±0.15 5.51±0.46a 3.83±0.21 3.55±0.42a 1.24±0.70 0.88±0.08a B 組 39 0.65±0.09 1.16±0.12ab 5.08±0.18 5.97±0.39ab 3.80±0.22 3.00±0.21ab 1.25±0.66 0.72±0.06ab C 組 40 0.65±0.06 1.43±0.07abc 5.11±0.21 6.73±0.35abc 3.81±0.23 2.38±0.25abc 1.24±0.71 0.58±0.05abc F值 0.16 17.47 0.32 91.01 0.21 40.17 0.23 16.49 P值 0.85 ＜0.01 0.72 ＜0.01 0.81 ＜0.01 0.79 ＜0.01組別 CD3+細(xì)胞分?jǐn)?shù)（%） CD4+細(xì)胞分?jǐn)?shù)（%） CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)（%） CD4+細(xì)胞比值治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后+/CD8 A 組 55.38±5.72 60.47±3.88a 30.05±2.01 32.95±5.14a 37.08±1.51 32.55±1.62a 0.81±0.07 1.01±0.16ab B 組 56.28±4.89 63.27±4.26ab 30.00±2.00 37.64±5.61ab 36.77±1.18 29.56±1.50ab 0.82±0.06 1.27±0.07ab C 組 55.63±4.93 69.48±4.78abc 30.31±1.85 43.23±4.18abc 36.82±1.92 25.51±1.67abc 0.84±0.06 1.70±0.14abc F值 1.53 26.54 0.36 96.78 1.85 20.00 1.98 61.89 P值 0.11 ＜0.01 0.69 ＜0.01 0.08 ＜0.01 0.14 ＜0.01

2.7 不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥發(fā)生情況 A組患者治療期間出現(xiàn)腹腔積液3例、消化道出血1例；B組患者治療期間出現(xiàn)肝性腦病1例、腹腔積液1例；C組患者治療期間無一例出現(xiàn)不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥。

3 討論

肝硬化是多種慢性肝病的終末期表現(xiàn)，在中國肝硬化主要由乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）持續(xù)感染引起；據(jù)統(tǒng)計，我國平均HBV陽性率為7.18%，平均HCV陽性率為3.2%[15]。隨著人們生活方式及飲食習(xí)慣改變，我國由于飲酒過量、肥胖、糖尿病發(fā)病率升高而引起的酒精性和非酒精性肝病患者數(shù)量逐年增多，而酒精性和非酒精性肝病均有很大可能或已發(fā)展為肝纖維化甚至肝硬化，因此肝纖維化或肝硬化患者數(shù)量巨大[16]。

目前，針對肝硬化患者的臨床治療主要集于去除潛在病因、延緩病程進(jìn)展及維持患者生命，其中OLT雖能在一定程度上改善肝硬化患者肝功能并緩解病情，但并不能從根本上解決肝硬化過程中肝細(xì)胞的減少問題，且存在供體資源少、高免疫排斥反應(yīng)、高費(fèi)用等缺陷。近年研究表明，BMSCs對肝纖維化、肝硬化均有一定治療作用，并可改善患者肝功能，提高患者生存質(zhì)量，同時BMSCs會在受損的肝臟內(nèi)分化為正常肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞并分泌促進(jìn)肝生長的生長因子，進(jìn)而達(dá)到緩解或逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化的目的[17-18]。已有大量研究證實(shí)干細(xì)胞治療肝纖維化或肝硬化的分子作用機(jī)制與干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及對微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而BMSCs可在趨化受體作用下遷移至受損的肝臟，進(jìn)而分化為肝細(xì)胞并補(bǔ)充肝細(xì)胞數(shù)量[19]。此外，QIAO等[20]還發(fā)現(xiàn)，BMSCs可分泌一些促進(jìn)細(xì)胞生長的因子、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物、調(diào)節(jié)IFN-γ和TNF-α而抑制肝星狀細(xì)胞增殖。但是，BMSCs在骨髓中含量極少且其向肝臟損傷部位歸巢能力有限，因此BMSCs在臨床上的應(yīng)用也受到一定限制，而通過為干細(xì)胞的自我更新與定向分化提供一個良好的微環(huán)境以使其在含量極少的情況上提高存活率、增殖率并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞是目前肝硬化失代償期治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。

中醫(yī)學(xué)無肝硬化的病名，根據(jù)臨床癥狀及體征可將其歸于“臌脹”“黃疸”“積聚”等范疇。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，肝硬化的主要病機(jī)為毒、瘀、虛羈留搏結(jié)，濕、熱、瘀、毒侵犯肝臟導(dǎo)致肝脾不調(diào)、氣虛血瘀，日久正氣虧虛而造成肝絡(luò)受損；而“腎藏精”，主生長發(fā)育與生殖，這與干細(xì)胞的“自我更新”和“定向分化”有很大的相似性和相關(guān)性。許靜等[21]研究證實(shí)，補(bǔ)腎中藥淫羊藿可通過動員體內(nèi)激素、細(xì)胞因子而激活內(nèi)源性干細(xì)胞。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腎藏精，肝藏血，腎中精氣充盈則肝有所養(yǎng)，血有所充；肝藏血量充盈則腎有所藏，精有所資，故云“肝腎同源、精血同源、相互化生”。吳理茂等[22]等研究發(fā)現(xiàn)，歸元方與BMSCs移植術(shù)對急、慢性肝損傷有明確的治療作用，二者聯(lián)用可優(yōu)勢互補(bǔ)，具有協(xié)同增效作用。范慧慧等[23]研究發(fā)現(xiàn)活血化瘀方藥不僅能激活并促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞大量增殖，還能調(diào)控內(nèi)源性干細(xì)胞分化。

柔肝化纖顆粒由全國名老中醫(yī)林沛湘所創(chuàng)壯肝逐瘀煎與關(guān)幼波教授治療肝炎肝硬化有效經(jīng)驗(yàn)方組合而成，并由黃芪、牡蠣、黃精、枸杞、薏苡仁、橘紅、澤蘭、雞內(nèi)金、鱉甲、虎杖、丹皮、黑棗組成，具有健脾補(bǔ)腎柔肝兼顧解毒活血、化痰軟堅散結(jié)功效和明顯的保肝、抗纖維化、抗肝硬化作用。柔肝化纖顆粒中黃芪、黃精、枸杞子、薏苡仁、黑棗具有益氣健脾、補(bǔ)腎柔肝功效，有利于通過恢復(fù)機(jī)體正氣、補(bǔ)腎生髓成肝而恢復(fù)肝臟組織氣血津液，進(jìn)而保障歸巢干細(xì)胞增殖、分化、修復(fù)、再生；橘紅、澤蘭、鱉甲、生牡蠣具有活血祛瘀、化痰散結(jié)功效，可通過活血化痰而調(diào)整氣血關(guān)系、達(dá)到“血和則經(jīng)脈流行”的目的，進(jìn)而為干細(xì)胞在肝臟的順利歸巢提供有利條件。本研究結(jié)果顯示，C組患者臨床療效優(yōu)于A組和B組，且患者治療后脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分及血清ALT、AST、TBiL水平低于A組、B組，PT短于A組、B組，表明柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效改善肝硬化失代償期患者臨床癥狀和體征、肝功能和凝血功能，有利于為受損的肝細(xì)胞創(chuàng)造再生及功能恢復(fù)的內(nèi)環(huán)境，促使干細(xì)胞在肝臟歸巢、分化。

研究表明，HBV等病毒持續(xù)感染過程中炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答紊亂會引起慢性肝損傷及肝纖維化，而促炎/抗炎因子及Th1/Th2的動態(tài)平衡在肝纖維化、肝硬化發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[24-25]。IL-2、IL-10、IL-12均為白介素家族成員，其中IL-2、IL-12是促炎性因子，可加劇肝纖維化進(jìn)程[26]；IL-10是一種抗炎因子，可通過促進(jìn)T輔助細(xì)胞增殖而抑制促炎性因子的過度表達(dá)并減輕炎性反應(yīng)所致肝損傷[27]。TNF-α與IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，其中TNF-α可促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎性因子并參與炎性反應(yīng)及抗凋亡等過程；IFN-γ主要參與抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)[28]。由Th2細(xì)胞分泌的IL-10的主要作用為誘發(fā)過敏反應(yīng)[29]。本研究結(jié)果顯示，C組患者治療后血清TNF-α、IL-2、IL-12水平低于A組和B組，而血清IFN-γ、IL-10水平高于A組和B組，表明柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效減輕肝硬化失代償期患者炎性反應(yīng)，對促炎/抗炎因子及Th1/Th2失衡具有一定調(diào)節(jié)作用。

表6 三組患者治療前后氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較（±s）Table 6 Comparison of mean levels of oxidative stress markers in the three groups before and after treatment

表6 三組患者治療前后氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較（±s）Table 6 Comparison of mean levels of oxidative stress markers in the three groups before and after treatment

注：SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛，GSH-Px=谷胱甘肽過氧化物酶；與治療前相比aP＜0.05；與A組相比bP＜0.05；與B組相比cP＜0.05

組別 例數(shù) SOD（U/ml） MDA（mol/L） GSH-Px（U/L）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 87.39±7.31 94.87±5.74a 15.29±3.08 9.47±1.43a 43.18±4.93 63.37±7.68a B 組 39 86.90±6.99 105.44±4.40ab 15.33±3.23 7.54±1.07ab 43.28±5.07 77.92±5.10ab C 組 40 87.21±5.79 120.62±6.69abc 15.28±3.08 4.97±1.09abc 43.44±5.18 96.54±5.36abc F值 0.10 50.69 0.14 39.03 0.12 79.84 P值 0.93 ＜0.01 0.96 ＜0.01 0.98 ＜0.01

免疫功能主要反映的是機(jī)體對外邪侵襲的抵抗能力，體液及細(xì)胞免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要組成部分，而免疫功能紊亂是導(dǎo)致肝硬化加重的重要原因，其中外周血T淋巴細(xì)胞亞群在肝臟炎癥、損傷及纖維化過程中發(fā)揮著重要作用，而免疫球蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞毒作用[30]。本研究結(jié)果顯示，C組患者治療后血清IgA、IgM水平和CD3+、CD4+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值高于A組、B組，血清IgG、IgE水平和CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于A組、B組，表明柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效改善肝硬化失代償期患者免疫功能。

氧化應(yīng)激反應(yīng)指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）過度產(chǎn)生和/或抗氧化防御功能減弱導(dǎo)致二者平衡受到嚴(yán)重破壞而造成組織、細(xì)胞損傷的狀態(tài)[31]。研究表明，ROS的過度產(chǎn)生可引起生物膜磷脂中多價不飽和酸和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而MDA為脂質(zhì)過氧化物之一，可反映機(jī)體組織損傷程度；SOD和GSH-Px均是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，對調(diào)節(jié)氧化/抗氧化平衡具有重要的作用[32]。本研究結(jié)果顯示，C組患者治療后血清SOD、GSH-Px水平高于A組和B組，而血清MDA水平低于A組和B組，表明柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效減輕肝硬化失代償期患者氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果還顯示，C組患者治療期間無一例出現(xiàn)不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥，提示柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)有利于減少肝硬化失代償期患者治療過程中不良反應(yīng)和或并發(fā)癥的發(fā)生，但由于本研究為單中心研究，樣本量較小、觀察時間較短且A、B組患者中出現(xiàn)并發(fā)癥者例數(shù)過少，無法行統(tǒng)計學(xué)分析及假設(shè)檢驗(yàn)，因此柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)治療肝硬化失代償期的具體作用機(jī)制及安全性等仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效改善肝硬化失代償期患者臨床癥狀和體征、肝功能、凝血功能及免疫功能，減輕患者炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，有一定臨床推廣應(yīng)用價值，而采用中醫(yī)藥招募內(nèi)源性干細(xì)胞的動員方案仍需進(jìn)行更多臨床試驗(yàn)以獲得更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)等。

作者貢獻(xiàn):呂艷杭負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析、文章撰寫及論文修訂；吳姍姍進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；王振常負(fù)責(zé)研究的構(gòu)思與設(shè)計及可行性分析，對文章整體負(fù)責(zé)；葉學(xué)勁負(fù)責(zé)文章的監(jiān)督管理；符燕青、段桂姣、蘇曉文、農(nóng)小欣進(jìn)行數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計學(xué)處理。

本文無利益沖突。