青春期前雙酚A 暴露對雌性大鼠卵巢組織中mRNA分子表達(dá)譜的影響

張雪瑩, 鄭連文, 鄒穎剛,周振環(huán)

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院生殖中心，吉林 長春 130041）

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs）是一類通過影響內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能對機體產(chǎn)生不利影響的物質(zhì)。EDCs 的生物學(xué)結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性類固醇激素相似，因此可以通過模仿類固醇激素，直接與激素受體相結(jié)合，影響內(nèi)源性激素的合成、分泌、運輸和代謝等相關(guān)過程，進(jìn)而干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功 能［1-2］。研究［2-4］顯示：EDCs 是影響肥胖、代謝紊亂、不育、糖尿病和激素依賴性腫瘤等疾病的高危險因素之一。雙酚A（bisphenol A，BPA）是一種較為常見的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其廣泛存在于聚碳酸酯塑料、樹脂、紙張和牙科材料等醫(yī)療設(shè)備中。在多種環(huán)境樣品中，包括水、污水過濾器、空氣和灰塵中等也可檢測到BPA 的存在［5］。日常生活中，聚碳酸酯塑料廣泛應(yīng)用于食品和飲料的存儲，這些容器中含有的BPA可以直接浸入食品或飲料產(chǎn)品中，因此，BPA可通過口服、吸入和經(jīng)皮膚接觸等多種途徑對人類的健康造成潛在危險［6-7］。多年來，BPA 對于人類健康的影響及其作用機制一直是研究的焦點。作為一種雌激素類似物，BPA 被發(fā)現(xiàn)具有弱雌激素活性和抗雄激素活性，可能影響生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能［8］。BPA 對機體的影響由其劑量、暴露方式、時間、機體生命階段及其他相關(guān)因素共同決定。而BPA 的雌激素活性也與作用的組織類型和受體的親和力等因素密切相關(guān)［9］。盡管BPA 的雌激素活性較弱，且較體內(nèi)內(nèi)源性雌激素水平低，但BPA暴露對女性生殖內(nèi)分泌健康仍有一定損害作用。研究［10-11］顯示：BPA 可能通過干擾類固醇相關(guān)信號通路，進(jìn)而在性早熟、多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、卵巢早衰、肥胖、糖尿病、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜容受性下降和不育等女性生殖內(nèi)分泌疾病相關(guān)的病理生理過程中發(fā)揮作用。BPA 還被認(rèn)為與激素依賴性腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌和睪丸癌等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［4］。卵巢是兼具生殖功能和內(nèi)分泌功能的器官，而作為卵巢的基本結(jié)構(gòu)與功能單位，卵泡的數(shù)量、質(zhì)量和發(fā)育過程直接影響卵巢功能，BPA 暴露可能對卵巢功能具有不良影響。青春期是指從兒童至成人的過渡時期，也是個體生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟的重要階段。出生后BPA 暴露可導(dǎo)致青春期出現(xiàn)過早及持續(xù)的發(fā)情間期改變，成年后可出現(xiàn)無排卵和不育等結(jié)局［12］。BPA 暴露可造成原始卵泡數(shù)下降、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降和卵泡閉鎖等［13］。BPA 還可抑制類固醇合成酶相關(guān)因子的表達(dá)水平，進(jìn)而干擾類固醇激素的合成［9］。盡管上述研究結(jié)果提示：BPA 與卵巢發(fā)育間具有密切關(guān)聯(lián)，但BPA對青春期前女性卵巢發(fā)育的影響及其作用機制仍待研究。青春期前個體的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)中，其相應(yīng)

的保護(hù)機制尚存在缺陷，因此機體對外源性激素的影響較為敏感［14］。BPA 作為一種雌激素類似物，在日常生活中其接觸量不斷增多，卵巢對雌激素水平的變化高度敏感，由此本文作者推測：BPA 對青春期前個體的卵巢組織發(fā)育具有一定影響。轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析作為篩選差異基因及預(yù)測基因功能的重要實驗方法，近年來得到了較為廣泛的應(yīng)用。本研究以青春期前SD 大鼠作為動物模型，采用RNA 測序（RNA-seq）和生物信息學(xué)預(yù)測分析方法探討青春期前BPA 暴露對個體卵巢組織中mRNA分子表達(dá)譜的影響，尋找與該過程相關(guān)的重要靶向基因，為后續(xù)深入探討其作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器32只28d齡SPF級雌性SD 大鼠，體質(zhì)量（85±10）g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，本實驗在吉林大學(xué)實驗動物中心開展，實驗動物倫理審查編號：KT202004003。BPA（純度≥99%，美國Sigma 公司），4% 多聚甲醛、戊巴比妥鈉和無水乙醇（北京化工廠），玉米油（上海昂一生物科技有限公司），TRIzol 試劑（日本TaKaRa 公司），5X All-In-One RT MasterMix（Applied Biological Materials），實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］。光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），Legend Micro 17 離心機（美國Thermo 公司），動物天平（浙江省余姚市紀(jì)銘電子天平有限公司），BS 124S分析天平（德國Sartorius 公司），3500P 熒光定量PCR 儀［安捷倫科技（中國）有限公司］。

1.2 實驗動物分組和處理適應(yīng)性飼養(yǎng)的32只大鼠隨機分為對照組、低劑量BPA組、中劑量BPA組和高劑量BPA組，每組各8只。將BPA 完全溶解于無水乙醇中配置成濃度為500 g·L－1的儲備液，使用前再按1∶100 比例溶解于玉米油中配置成5 g·L－1的工作液，按0、50、100 和200 mg·kg－1BAP 的劑量分別給予對照組、低劑量BPA組、中劑量BPA組和高劑量BPA組大鼠皮下注射，連續(xù)14 d。每日測量大鼠體質(zhì)量。4組大鼠在末次處理后禁食水12h并稱體質(zhì)量，2% 戊巴比妥鈉麻醉處死。迅速剝離雙側(cè)的卵巢組織，稱其質(zhì)量并計算卵巢系數(shù)，卵巢系數(shù)＝卵巢質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。一側(cè)卵巢組織放置于10% 甲醛溶液中，用于石蠟包埋切片后蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色；另一側(cè)卵巢組織置入－80℃冰箱中冷凍、備用。

1.3 HE 染色觀察各組大鼠卵泡形態(tài)表現(xiàn)卵巢組織經(jīng)10% 甲醛溶液固定后進(jìn)行石蠟包埋、連續(xù)切片（厚度5～6 μm）、HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織中卵泡形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 各組大鼠卵巢總RNA 提取和RT-qPCR 法檢測按照TRIzol 總RNA 抽提試劑盒說明書提供的操作步驟提取卵巢組織總RNA。采用RT-qPCR 法檢測各組大鼠卵巢組織中Hapln3、Nr4a1、Arc、Ccl2、Ccn5、Egr2 和Rab33a mRNA 表達(dá)水平。以GAPDH作為對照基因，采 用2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序分別從對照組和高劑量BPA組中隨機挑選3個RNA 樣品，由生工生物工程（上海）有限公司通過Illumina 平臺完成后續(xù)RNAseq，篩選差異表達(dá)的基因（篩選條件：P≤0.05且|Log2Fold Change|≥1）。

1.6 京都基因與基因組大百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析和基因功能分類體系（Gene Ontology，GO）富集分析采用KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway分析。采用GO 富集分析對差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能描述。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠的體質(zhì)量，卵巢質(zhì)量，各組大鼠卵巢組織中Hapln3、Nr4a1、Arc、Ccl2、Ccn5、Egr2 和Rab33a mRNA 表達(dá)水平均以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)和體質(zhì)量處理前后的各組大鼠一般狀態(tài)尚好，無明顯差異。處理前各組大鼠體質(zhì)量相近，約100 g，處理前各組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；處理期間每日稱體質(zhì)量，各組大鼠體質(zhì)量均增加，但各組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 BPA 暴露后各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats in various groups after BPA exposure (n=8,±s,m/g)

表1 BPA 暴露后各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats in various groups after BPA exposure (n=8,±s,m/g)

Group Control BPA Low dose Middle dose High dose Body weight PND28 100.43±0.75 103.43±2.01 101.79±1.36 98.95±1.20 PND32 121.80±1.11 126.88±2.91 122.61±1.79 121.79±1.37 PND36 141.34±1.69 146.98±3.22 143.44±2.27 144.01±1.77 PND41 156.11±3.20 157.03±4.04 157.85±3.08 157.16±2.84

2.2 各組大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢系數(shù)低、中劑量BPA組大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢系數(shù)較對照組有下降趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高劑量BPA組大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢系數(shù)較對照組明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 BPA 暴露后各組大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢系數(shù)Tab.2 Ovarian weights and ovary coefficients of rats in various groups after BPA exposure (n=8,±s)

表2 BPA 暴露后各組大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢系數(shù)Tab.2 Ovarian weights and ovary coefficients of rats in various groups after BPA exposure (n=8,±s)

*P＜0.05 vs control group.

Group Control BPA Low dose Middle dose High dose Ovarian weight（m/mg）20.480±0.759 19.350±0.974 18.310±1.333 14.180±1.282*Ovarian coefficient（η/%）0.130±0.004 0.120±0.006 0.120±0.008 0.090±0.007*

2.3 各組大鼠卵巢組織形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠卵巢組織切片中各級生長卵泡清晰可見；低、中劑量BPA組大鼠卵巢組織未見明顯異常改變；高劑量BPA組大鼠卵巢組織可觀察到原始卵泡、竇前卵泡及竇狀卵泡數(shù)下降，閉鎖卵泡數(shù)增多，高劑量BPA組大鼠卵巢組織中可觀察到顆粒細(xì)胞層減少的擴張的囊狀卵泡。見圖1。

圖1 BPA 暴露后各組大鼠卵巢組織形態(tài)表現(xiàn)（HE，×40）Fig.1 Morphology of ovarian tissue of rats in various groups after BPA exposure (HE,×40 )

2.4 各組大鼠RNA-seq 測序結(jié)果選取差異明顯的對照組和高劑量BPA組大鼠卵巢組織進(jìn)行后續(xù)的RNA-seq 實驗，分析得到組間差異表達(dá)的mRNAs 共 有14個（P≤0.05，|Log2Fold Change|≥1），其中有1個上調(diào)基因和13個下調(diào)基因。14個mRNAs 的差異分組聚類分析結(jié)果見圖2。

2.5 各組大鼠卵巢組織中Hapln3、Nr4a1、Arc、Ccl2、Ccn5、Egr2 和Rab33a mRNA 表達(dá)水平從組間差異表達(dá)的mRNAs 中選擇7個mRNAs 進(jìn)行后續(xù)的RT-qPCR實驗。與對照組比較，高劑量BPA組大鼠卵巢組織中Hapln3、Nr4a1、Arc、Ccl2、Ccn5 和Egr2 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；而高劑量BPA組大鼠卵巢組織中Rab33a mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。RT-qPCR 法檢測結(jié)果與RNA-seq 預(yù)測的表達(dá)趨勢一致，驗證了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。見表3。

表3 2組大鼠卵巢組織中Hapln3、Nr4a1、Arc、Ccl2、Ccn5、Egr2 和Rab33a mRNA 表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of Hapln3, Nr4a1, Arc, Ccl2, Ccn5, Egr2 ，and Rab33a mRNA in ovarian tissue of rats in two groups(n=3,±s)

表3 2組大鼠卵巢組織中Hapln3、Nr4a1、Arc、Ccl2、Ccn5、Egr2 和Rab33a mRNA 表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of Hapln3, Nr4a1, Arc, Ccl2, Ccn5, Egr2 ，and Rab33a mRNA in ovarian tissue of rats in two groups(n=3,±s)

*P＜0.05 vs control group.

Group Control High dose of BPA Hapln3 1.014 7±0.117 3 0.078 5±0.014 4*Nr4a1 1.014 7±0.117 3 0.078 5±0.014 4*Arc 1.014 7±0.117 3 0.078 5±0.014 4*Ccl2 1.014 7±0.117 3 0.078 5±0.014 4*Ccn5 1.014 7±0.117 3 0.078 5±0.014 4*Egr2 1.014 7±0.117 3 0.078 5±0.014 4*Rab33a 1.014 7±0.117 3 0.078 5±0.014 4*

2.6 GO 富集分析和KEGG分析GO 富集分析結(jié)果顯示：RNA-seq 檢測得到的組間差異表達(dá)基因與某些生物學(xué)過程（生殖過程和代謝過程等）、細(xì)胞組分（細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞外基質(zhì)和突觸等）和分子功能（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、受體調(diào)控活性和催化活性等）相關(guān)（圖3）。KEGG分析結(jié)果顯示：組間差異表達(dá)的基因參與了p53、MAPK 和PI3K-Akt信號通路及與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路等（表4）。

表4 差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析Tab.4 KEGG enrichment analysis of all differential expression genes

圖3 差異表達(dá)mRNAs 的GO 富集分析圖Fig.3 GO enrichment analysis diagram of differential expression genes

3 討 論

BPA 作為一種可通過日常生活環(huán)境接觸或攝入的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，能夠影響機體的內(nèi)分泌活動，對機體健康產(chǎn)生風(fēng)險，因此多年來一直受到研究者的廣泛關(guān)注。研究［10］顯示：BPA 在不孕婦女體內(nèi)的含量較可生育婦女高；BPA 可能通過影響輸卵管及子宮的形態(tài)和功能，進(jìn)而干擾胚胎植入過程；BPA 能夠引起實驗動物的動情周期異常；BPA 可改變垂體促性腺激素相關(guān)因子的表達(dá)水平；BPA 能夠干擾下丘腦-垂體-性腺軸的正常功能等。上述研究均表明：BPA 是導(dǎo)致女性生殖障礙的重要環(huán)境影響因素。

目前學(xué)者認(rèn)為：BPA 因具有弱類雌激素和抗雄激素活性，能夠干擾女性卵巢的正常發(fā)育過程，進(jìn)而對女性生殖健康造成不良影響。處于青春期的女性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，因此機體容易受到外源性激素的干擾。研究［15-16］顯示：BPA 對處于青春期或青春期前個體的卵巢發(fā)育具有一定影響。ZAID 等［15］發(fā)現(xiàn)：青春期前大鼠在經(jīng)BPA 連續(xù)染毒6周后可出現(xiàn)持續(xù)發(fā)情間期的異常表現(xiàn)，如卵巢組織中竇前卵泡、優(yōu)勢卵泡和黃體數(shù)下降及閉鎖卵泡數(shù)上升等改變。LI 等［16］報道：與對照組比較，經(jīng)BPA 染毒處理的青春期前小鼠的卵巢質(zhì)量降低。與卵巢質(zhì)量比較，卵巢系數(shù)作為藥物毒性試驗中一項較為敏感的判斷指標(biāo)，能更為客觀地反映受試動物的卵巢是否受到藥物的不良影響。在本研究中，高劑量BPA組大鼠在經(jīng)BPA 處理后，其卵巢質(zhì)量和卵巢系數(shù)明顯降低，且卵巢組織出現(xiàn)原始卵泡、竇前卵泡和竇狀卵泡數(shù)減少，閉鎖卵泡數(shù)增加，出現(xiàn)囊狀卵泡等異常改變。這與ZAID等［15］和LI等［16］的研究結(jié)果一致。但BPA 作為一種弱雌激素類似物，其對卵泡發(fā)育和卵巢組織結(jié)構(gòu)的影響因作用的劑量、時間和染毒方式等不同而有所差異。

結(jié)合上述實驗結(jié)果可知：盡管BPA 對青春期前卵巢發(fā)育的影響已得到相關(guān)研究的證實，但其參與這一生物學(xué)過程的分子機制還亟待更加深入的研究與探討。研究［17］顯示：BPA 可通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)而非改變基因序列來誘導(dǎo)表觀遺傳學(xué)變化，進(jìn)而影響個體發(fā)育。本課題組采用RNA-seq 對比對照組和高劑量BPA組大鼠卵巢組織中mRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了14個差異表達(dá)基因（P≤0.05 且|Log2Fold Change|≥1），并選擇了差異基因Hapln3、Nr4a1、Arc、Ccl2、Ccn5、Egr2 和Rab33a 進(jìn) 行RT-qPCR法檢測，證明了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。在測序發(fā)現(xiàn)的這14個基因中，有一部分已有研究［18-27］顯示：其可能與卵巢功能異常甚至生殖內(nèi)分泌疾病的生物學(xué)過程相關(guān)。抑制素βA 亞基基因（inhibin subunit beta A，Inhba）和抑制素βB亞基基因（inhibin subunit beta B，Inhbb）均被認(rèn)為與PCOS 的發(fā)病機制相關(guān)。其中，Inhba 與患者的卵泡異常發(fā)育有關(guān)；WANG 等［18］研究顯示：Inhba在大鼠卵巢組織中的異常表達(dá)可能影響了機體正常的生殖內(nèi)分泌功能。而Inhbb 可能與PCOS 的代謝異常相關(guān)，并被認(rèn)為是早期PCOS 卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞紊亂的潛在原因［19］。此 外，Inhba 和Inhbb 均被認(rèn)為與卵泡刺激素的分泌相關(guān)。孤兒核NR4A 亞家族成員1（nuclear receptor subfamily 4 group A member 1，Nr4a1）屬于孤兒核受體家族（orphan nuclear receptor，ONR），是一種在卵巢癌組織中高表達(dá)的基因，近年來有研究［20-21］表明：Nr4a1 可受雄激素調(diào)控，進(jìn)而參與PCOS 的發(fā)生發(fā)展過程，Nr4a1 還參與了大鼠黃體發(fā)育和黃體溶解的生物學(xué)過程。C-C模體趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，Ccl2）是一種 細(xì)胞因子基因，有研究者［22］認(rèn)為：Ccl2 可能參與了高雄激素血癥（hyperandrogenemia，HA）和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）相關(guān)的代謝異常過程；對豬卵巢顆粒 細(xì)胞的研究［23-24］顯示：Ccl2可作為卵巢血管生成和發(fā)育的重要標(biāo)志物。細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)因子5（cellular communication network factor 5，Ccn5）也稱為WISP2，是編碼Wnt 誘導(dǎo)信號通路蛋白（Wnt-induced secreted protein，WISP）亞家族的一員。研究［25］顯示：PCOS 患者 血 清中Ccn5 的水平與脂肪酸結(jié)合蛋白4 直接相關(guān)，從而推測其可能參與了PCOS 相關(guān)的肥胖等異常代謝過程。早期生長反應(yīng)因子1（early growth response 1，Egr1）和早期生長反應(yīng)因子2（early growth response 2，Egr2）均被認(rèn)為與顆粒細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)聯(lián)［26-27］。但關(guān)于上述基因與BPA 誘導(dǎo)卵巢結(jié)構(gòu)和功能異常之間是否相關(guān)尚缺乏后續(xù)研究。

本研究通過GO 富集和KEGG 富集分析預(yù)測了經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因的相關(guān)功能與潛在的作用機制，結(jié)果顯示：這些差異表達(dá)的mRNAs 具有促進(jìn)生殖、代謝和細(xì)胞凋亡等多種功能，并可能參與了p53、MAPK 和PI3K-Akt 等多種信號通路。這些信號通路中，p53 通路可介導(dǎo)mRNA分子對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控，進(jìn)而參與了卵巢早衰和PCOS 等卵巢相關(guān)疾病的發(fā)病機制；PI3K-Akt 通路介導(dǎo)調(diào)控了細(xì)胞增殖和代謝以及維持基因組的完整性等生物學(xué)過程，進(jìn)而影響原始卵泡的募集和生長，且參與PCOS 相關(guān)的IR 和脂質(zhì)代謝等代謝過程；MAPK 通路也參與調(diào)控了PCOS 的發(fā)病機制［28-29］。因此本文作者推測：通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的這些差異表達(dá)基因可能介入了相關(guān)的信號通路，進(jìn)而影響了卵巢的正常發(fā)育過程。

本研究初步探討了BPA 暴露對正常青春期前雌性大鼠卵泡發(fā)育的影響，后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)一步預(yù)測了可能的分子機制及其相關(guān)的生物學(xué)過程。結(jié)合已報道文獻(xiàn)的研究結(jié)果，本文作者認(rèn)為：BPA可能通過改變青春期前大鼠卵巢組織中mRNA分子表達(dá)譜，進(jìn)而干擾了卵巢的正常發(fā)育過程。這也為后續(xù)的研究提供了研究方向和基礎(chǔ)。