何首烏提取物對(duì)失重小鼠骨質(zhì)疏松和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

劉軒辰, 帖曉瑛, 劉玉林, 王 寧

（1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，陜西 西安 710038；2.西安海棠職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710038；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨科，陜西 西安 710038）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種異常的骨代謝性疾病，其主要特征是成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收失衡，導(dǎo)致破骨細(xì)胞骨吸收能力強(qiáng)于成骨細(xì)胞的骨形成能力，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)丟失以及骨量減少，形成OP［1］。在歐洲，超過(guò)2 000萬(wàn)女性和5 500萬(wàn)男性O(shè)P 患者，并且每年超過(guò)350萬(wàn)人遭受骨質(zhì)疏松型骨折。在全球范圍內(nèi)，OP 相關(guān)并發(fā)癥的治療費(fèi)用巨大，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)壓力［2］。研究［3］顯示：航天員由于長(zhǎng)期處于失重環(huán)境，導(dǎo)致骨鈣磷丟失、骨量和骨機(jī)械強(qiáng)度降低，使航天員出現(xiàn)類似于OP 的癥狀。隨著中國(guó)載人航天的發(fā)展和中國(guó)太空站的建立及運(yùn)行，越來(lái)越多的航天員長(zhǎng)時(shí)間在太空失重環(huán)境中工作，因此探討如何預(yù)防和治療因失重導(dǎo)致的骨量丟失形成的OP 成為現(xiàn)階段以及未來(lái)的研究重點(diǎn)。絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用［4］。絲分裂原活化蛋白激酶激酶（MAP kinase kinase，MEK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）作為MAPK 經(jīng)典信號(hào)通路之一，在BMSCs 成骨分化代謝中扮演重要角色，激活Raf/MEK/ERK 能夠促進(jìn)骨重建和成骨分化［5］。因此，激活MEK/ERK 信號(hào)通路是促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵之一。何首烏（polygonum multiflorum，PM）是一種傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)益精血和固腎烏須作用［6］。近年來(lái)研究［7-10］顯示：PM 提取物以及其主要成分二苯乙烯苷（stilbene glycoside，TSG）對(duì)多種疾病包括糖尿病和灰白發(fā)變黑等具有廣泛的作用，同時(shí)可以促進(jìn)骨形成，緩解骨丟失。但PM 能否緩解因失重導(dǎo)致的骨量丟失及其機(jī)制尚不清楚。本研究構(gòu)建失重小鼠模型，給予失重小鼠PM 提取物進(jìn)行治療，采用微型計(jì)算機(jī)斷層成像（micro-computer tomography，micro-CT）、免疫組織化學(xué)和Western blotting 等方法驗(yàn)證PM 對(duì)骨形成的促進(jìn)作用，為PM 提取物在失重性O(shè)P 治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物30只SPF級(jí)12周齡雄性C57BL/6 小鼠，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（陜）2019-001，體質(zhì)量20～22 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。PM 的提取方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［11-12］。

1.2 動(dòng)物分組、造模和給藥小鼠適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境1周后，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、失重組和失重+PM組，每組10只。對(duì)照組小鼠自由活動(dòng)，失重組和失重+PM組小鼠采用尾懸吊28 d 的方法構(gòu)建失重模型，構(gòu)建失重模型方法依照文獻(xiàn)［13］ 報(bào)道的方法。失重+PM組小鼠以灌胃的形式給予200 mg·kg－1·d－1PM，連續(xù)給藥30 d。

1.3 micro-CT 檢測(cè)各組小鼠骨體積/組織體積比值、骨小梁數(shù)量和厚度以及骨小梁間隙采用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將其固定于micro-CT分析儀上，分辨率為20 μm，掃描結(jié)束后進(jìn)行圖像重建，采用Inveon Research Workplace 2.2 軟件分析各組小鼠骨體積/組織體積比值、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度和骨小梁間隙。

1.4 各組小鼠骨組織的收集和處理取各組小鼠雙側(cè)股骨和脛骨。4% 多聚甲醛固定3～6 d 后，10%EDTA 脫鈣，每3～5 d 更換1次，脫鈣約4周后，針頭可以輕松扎透骨頭表明脫鈣完成。去除失重大鼠股骨兩端，PBS 沖洗骨髓腔，離心，紅細(xì)胞裂解液裂解，去除紅細(xì)胞，離心，計(jì)數(shù)。取2只無(wú)菌流式管，標(biāo)記為對(duì)照管和樣品管。對(duì)照管中細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，樣品管中細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè)。對(duì)照管中加入熒光素標(biāo)記同型對(duì)照抗體作為同型對(duì)照。在樣品管中加入PE 標(biāo)記的小鼠單克隆抗體Integrin beta 1（ab218273）和FITC 標(biāo)記的大鼠單克隆抗體Sca1/Ly6A/E（ab268016）抗體（美國(guó)Abcam 公司），混勻。4℃避光孵育30 min，1 000 r·min－1離心10 min，反復(fù)洗滌2次。棄上清，對(duì)照管中加入500 μL PBS 重懸。樣品管中加入1 mL 培養(yǎng)基重懸，混勻。采用FACS-Aria 型流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選。采用含有10% 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的α-MEM 培養(yǎng)基，于37 °C、95% 濕度和5%CO2孵箱中培養(yǎng)分選后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）。

1.5 酒石酸酸性磷酸酶（tartrate acid phosphatase staining，TRAP）染色檢測(cè)各組小鼠骨組織中BMSCs 數(shù)量、成骨細(xì)胞數(shù)量、脂肪細(xì)胞數(shù)量和破骨細(xì)胞數(shù)量4% 多聚甲醛固定骨組織切片30 s，去離子水清洗后等體積石榴石型堿溶液和亞硝酸鹽溶液，混勻，室溫靜置1～2 min。染色杯中加入45 mL、37℃去離子水、1 mL 配制好的快速石榴石型堿溶液、0.5 mL Naphthol AS-BI phosphqte 溶液、2 mL 醋酸鹽溶液和1 mL 酒石酸溶液。切片置入染色杯中，37℃避光孵育1 h。清洗切片，蘇木精復(fù)染2 min。封片，采用顯微鏡統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中的破骨細(xì)胞數(shù)量，每組重復(fù)3次。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠骨組織中CD29、干細(xì)胞抗原1（stem cell antigen-1，Sca-1）和Ⅰ型膠原（collagenⅠ，Col-Ⅰ）蛋白表達(dá)水平。脫鈣后的骨組織石蠟包埋，將蠟塊固定于切片機(jī)中，調(diào)整切片厚度，切片，脫蠟，洗脫，3% H2O2水孵育10 min，PBS 洗滌3次，每次5 min，山羊血清封閉30 min，加一抗，4℃過(guò)夜。PBS 洗滌3次，每次5 min，二抗室溫30 min。PBS 洗滌3次，每次5 min。加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，孵育30 min。PBS 緩沖液洗滌3次，每次5 min。DAB 顯色，沖洗，蘇木精復(fù)染，樹(shù)膠封片?？贵w采用兔多克隆抗體CD29（GTX128839，美國(guó)GeneTex 公司）、Sca-1（108103，美國(guó)Biolegend 公司）和鼠單克隆抗體Col-Ⅰ（ab6308）。鏡下以被抗體標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量作為該種細(xì)胞的數(shù)量，每組重復(fù)3次，取平均數(shù)。CD29 和Sca-1 陽(yáng)性細(xì)胞為BMSCs、Col-Ⅰ陽(yáng)性細(xì)胞為成骨細(xì)胞。

將細(xì)胞分為對(duì)照組（0 μ mol·L－1PM）、10 μmol·L－1PM組、20 μ mol·L－1PM組 和40 μmol·L－1PM組。為了驗(yàn)證MAPK 信號(hào)通路在PM 促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化中的作用，采用MEK 抑制劑PD98059（PD）探討何首烏促進(jìn)成骨分化的作用是否發(fā)生改變。PD 作用后再將細(xì)胞分為對(duì)照（0 μmol·L－1PD）組、1 μ mol·L－1PD組、10 μmol·L－1PD組和25 μmol·L－1PD組。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測(cè)各組BMSCs中成骨相關(guān)因子mRNA 表達(dá)水平將模板1 μL，上下游引物各1 μL、DEPC 水7 μL、Premix Taq 10 μL 混合。采用快速3 步法，擴(kuò)增 條件： 變性95℃、5 min，變性95℃、30 s；退火65℃、30 s；延 伸72℃、40 s。以2－ΔΔCt法計(jì)算各組BMSCs 中RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX family transcription factor-2，Runx-2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Osterix、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）mRNA 表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 Western blotting 法檢測(cè)各組BMSCs 中成骨相關(guān)蛋白和MEK/ERK 信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平帶膠玻璃板插入電泳槽，加入電泳緩沖液，上樣。電壓100 V，15 min 后調(diào)至120 V。PVDF 膜甲醇浸泡5～10 s，轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡5～10 min。電壓100 V、100 min。麗春紅染色1～2 min，剪下目的條帶。5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗4℃過(guò)夜孵育。二抗室溫孵育2 h，PBST 清洗3次，每次10 min。化學(xué)發(fā)光儀發(fā)光檢測(cè)各組細(xì)胞中Runx-2、ALP、Osterix、PPARγ、MEK、磷酸化MEK 1/2（phosphorylated MEK 1/2，p-MEK1/2）、ERK和磷酸化ERK1/2（ phosphorylated ERK 1/2 ，p-ERK1/2）蛋白表達(dá)水平。采用Image J 軟件掃描各蛋白條帶灰度值，重復(fù)3次，取平均值。目的蛋白表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值/對(duì)照組蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠骨體積/組織體積比值、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁間隙、BMSCs 數(shù)量、成骨細(xì)胞數(shù)量、脂肪細(xì)胞數(shù)量、破骨細(xì)胞數(shù)量、小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨相關(guān)因子Runx-2、ALP、Osterix、p-MEK1/2 和p-ERK1/2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均以xˉ±s表示，多組間多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠骨體積/組織體積比值、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度和骨小梁間隙與對(duì)照組比較，失重組小鼠骨體積/組織體積比值、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度明顯降低（P＜0.05），而骨小梁間隙增加（P＜0.05）。與失重組比較，失重+PM組小鼠骨體積/組織體積比值、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度升高（P＜0.05），骨小梁間隙降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1 和2。

圖1 micro-CT 檢測(cè)各組小鼠骨組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)Fig.1 Construction indexes of bone tissue of mice in various groups detected by micro-CT

2.2 各組小鼠骨組織中BMSCs、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組比較，失重組小鼠BMSCs 數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；與失重組比較，失重+PM組小鼠BMSCs 數(shù)量增加（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，失重組小鼠成骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；與失重組比較，失重+PM組小鼠骨組織中成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，失重組小鼠脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P＜0.05）；與失重組比較，失重+PM組小鼠骨組織中脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯降低（P＜0.05）。與對(duì)照組小鼠比較，失重組小鼠骨組織中破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P＜0.05）；與失重組比較，失重+PM組小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn) 圖3～6。

圖3 各組小鼠被標(biāo)記的成骨細(xì)胞和BMSCs 形態(tài)表現(xiàn)(Bar= 20 μm)Fig.3 Morphology of labeled osteoblasts and BMSCs of mice in various groups (Bar= 20 μm)

2.3 各組BMSCs 中Runx-2、ALP 和Osterix 和PPARγ mRNA 及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組（0 μmol·L－1PM）比較，10、20 和40 μmol·L－1PM組BMSCs 中Runx-2、ALP 和Osterix mRNA和蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），PPARγ mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 各組BMSCs 中Runx-2、ALP、Osterix 和PPARγ mRNA 和蛋白表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of Runx-2,ALP,Osterix,and PPARγ mRNA and proteins in BMSCs in various groups

圖2 各組小鼠骨體積分?jǐn)?shù)（A）、骨小梁數(shù)量（B）、骨小梁厚度（C）和骨小梁間隙（D）Fig.2 Bone volume fraction(A),number of bone trabeculae(B),thickness of bone trabeculae(C),and trabecular space(D) of mice in various groups

2.4 各組BMSCs 中MEK/ERK 信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組（0 μmol·L－1PM）比較，10 μmol·L－1PM組細(xì)胞中p-MEK1/2 和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與10 μmol·L－1PM組比較，20 μmol·L－1PM組細(xì)胞中p-MEK1/2 和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與20 μmol·L－1PM組比較，40 μmol·L－1PM組細(xì)胞中p-MEK1/2和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖8。為了驗(yàn)證MAPK 信號(hào)通路在PM 促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中的作用，采用MEK 抑制劑PD98059（PD）探討PM 促進(jìn)成骨分化的作用是否發(fā)生改變。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組（0 μmol·L－1PD）比較，1 μmol·L－1PD組細(xì)胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、Runx-2 和Osterix蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與1 μ mol·L－1PD組比較，10 μ mol·L－1PD組 細(xì)胞 中p-MEK1/2 、p-ERK1/2、Runx-2 和Osterix蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與10 μmol·L－1PD組細(xì) 胞 比 較，25 μmol·L－1PD組細(xì)胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、Runx-2 和Osterix 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖9。

圖8 各組細(xì)胞中p-MEK1/2 和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)情況Fig.8 Expressions of p-MEK1/2 and p-ERK1/2 proteins in cells in various groups

圖9 MEK 抑制劑PD 作用后各組BMSCs 中p-MEK1/2 和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)情況Fig.9 Expression levels of p-MEK1/2 and p-ERK1/2 proteins in BMSCs in various groups after treated with MEK inhibitor PD

3 討 論

OP 是一類以骨量降低和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的骨代謝性疾?。?4］。老齡、失重、絕經(jīng)和長(zhǎng)久服用藥物等均可導(dǎo)致OP 的發(fā)生［15-16］。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，失重組小鼠骨體積/組織體積、骨小梁數(shù)量和厚度明顯降低；而給予失重小鼠PM提取液治療后，與失重組比較，失重+PM組小鼠骨體積/組織體積比值、骨小梁數(shù)量和厚度明顯升高，但其與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明PM 能夠 緩解失重導(dǎo)致的骨量丟失。HAM 等［11］研究顯示：PM 能夠改善因糖尿病導(dǎo)致的骨量丟失，提高糖尿病小鼠的骨體積/組織體積比值和骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度，血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PM 可以提高血清中胰島素水平、骨鈣素含量以及堿性磷酸酶濃度，降低骨小梁表面積與骨小梁體積的比值。研究［11］顯示：PM 提取物可以抑制破骨細(xì)胞的生成，從而緩解骨量丟失以及OP。PM 提取物能夠緩解因使用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的OP。ZHOU 等［17］研究顯示：強(qiáng)的松能夠降低骨密度、骨體積/組織體積以及骨小梁厚度，不僅如此，強(qiáng)的松能夠降低大鼠脛骨肌肉質(zhì)量。不同濃度PM 提取物能顯著改善大鼠的骨量，緩解強(qiáng)的松的不良反應(yīng)。HWANG［12］等研究顯示：給予OVX 小鼠PM 提取物治療6周后，能夠降低OVX 小鼠的體質(zhì)量和器官質(zhì)量，提高骨質(zhì)量，改善骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)，降低骨量丟失。不僅如此，PM 提取物能夠緩解卵巢切除小鼠的骨量丟失，促進(jìn)絕經(jīng)小鼠干細(xì)胞成骨分化，提高骨量［12］。除此之外，PM 提取物能夠促進(jìn)灰白發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎l(fā)，增強(qiáng)骨骼強(qiáng)壯，改善心血管疾?。?8］。同時(shí)，PM 提取物能夠改善因肥胖導(dǎo)致的高血糖和高胰島素血癥［19］。研究［17］顯示：給予類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者糖皮質(zhì)激素治療，能夠抑制其成骨細(xì)胞的分化，抑制骨形成，從而導(dǎo)致OP，但配合使用PM則能夠改善糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的骨生長(zhǎng)緩慢。

圖4 各組小鼠被標(biāo)記的成骨細(xì)胞和BMSCs 數(shù)量Fig.4 Numbers of labeled osteoblasts and BMSCs of mice in various groups

圖5 各組小鼠被標(biāo)記的脂肪細(xì)胞和破骨細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)(Bar= 20 μm)Fig.5 Morphology of labeled adipocytes and osteoclasts of mice in various groups (Bar= 20 μm)

圖6 各組小鼠被標(biāo)記的破骨細(xì)胞（A）和脂肪細(xì)胞（B）數(shù)量Fig.6 Numbers of labeled osteoclasts(A) and adipocytes(B) of mice in various groups

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BMSCs 和成骨細(xì)胞的結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，失重減少小鼠骨表面BMSCs 和成骨細(xì)胞的數(shù)量，從而導(dǎo)致失重小鼠骨量降低。給予失重小鼠PM 提取物治療后發(fā)現(xiàn)：失重小鼠BMSCs 和成骨細(xì)胞的數(shù)量明顯升高，與失重組小鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失重導(dǎo)致骨量降低的原因可能是其減少了BMSCs 和成骨細(xì)胞的數(shù)量，從而降低骨量，而PM 提取物能夠逆轉(zhuǎn)因失重導(dǎo)致的成骨細(xì)胞數(shù)量降低，從而促進(jìn)骨形成以及骨量增加。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：PM 提取物能夠促進(jìn)失重小鼠來(lái)源的BMSCs 向成骨細(xì)胞分化，使Runx-2 和Osterix 等成骨相關(guān)蛋白高表達(dá)。KIM 等［9］研究顯示：PM 提取物能夠促進(jìn)SaOS-2 細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)提高細(xì)胞中Runx-2、ALP 和Osterix的表達(dá)水平。TSG是PM提取物中的主要成分，研究［20］顯示：TSG 水平在1.56～25.00 mg·L－1能夠提高BMSCs中ALP 活性，TSG 水平在6.25～25.00 mg·L－1時(shí)能夠明顯提高骨鈣素水平。以上結(jié)果證實(shí)： PM 提取物和TSG 能夠促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化以及成骨相關(guān)因子的表達(dá)。

Wnt/β-catenin 經(jīng)典通路在BMSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要角色［21-22］。ZHOU 等［17］提出：PM提取物能夠激活BMSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。MAPK 信號(hào)通路在細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其包含P38 MAPK 信號(hào)通路、JNK 信號(hào)通路和ERK 信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示：PM 提取物能夠提高M(jìn)EK磷酸化和ERK 磷酸化水平，激活MEK/ERK 信號(hào)通路，提高成骨相關(guān)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)失重小鼠BMSCs 向成骨細(xì)胞分化。給予BMSCs MEK 抑制劑PD 后，BMSCs 中MEK 和ERK 的磷酸化水平明顯降低，同時(shí)Runx-2 和Osterix 蛋白表達(dá)水平也明顯降低。上述結(jié)果提示：PM 通過(guò)激活ERK 信號(hào)通路，從而促進(jìn)BMSCs 成骨分化，促進(jìn)骨形成，緩解失重導(dǎo)致的OP。

綜上所述，PM 提取物可明顯改善因失重導(dǎo)致的骨量丟失，其機(jī)制可能與激活MEK/ERK 信號(hào)通路和促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化有關(guān)。