參仙升脈口服液對(duì)病態(tài)竇房結(jié)綜合征小鼠ROS 表達(dá)的影響和對(duì)HCN4 離子通道的調(diào)控作用

毛 丹, 李志爽, 程佳新, 侯 平

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)二科，遼寧 沈陽 110032）

病態(tài)竇房結(jié)綜合征（sick sinus syndrome，SSS）也稱竇房結(jié)功能障礙，SSS 患者心臟竇房結(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，結(jié)締組織增生，導(dǎo)致竇房結(jié)功能障礙，起搏受到抑制，心率減緩，引起身體其他系統(tǒng)特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能異常，造成昏厥甚至猝死，外科手術(shù)、冠心病、心肌病和全身免疫性疾病均可導(dǎo)致該病的發(fā)生［1］。年齡增長是該病的主要原因之一，SSS患者平均年齡為68歲，每600例65歲或以上的心臟病患者中就有1例發(fā)生竇房結(jié)功能障礙，且不分性別［2］。1990年美國，因竇房結(jié)功能障礙植入起搏器者占起搏器植入者總數(shù)的50% 以上［3］。中樞神經(jīng)麻醉誘導(dǎo)的交感神經(jīng)切除術(shù)和使用諸如丙泊酚、瑞芬太尼、右美托咪定或維庫溴銨的交感神經(jīng)藥物均可以引起竇房結(jié)功能障礙并引發(fā)危及生命的心律失常，臨床常采用植入起搏器來進(jìn)行治療，但手術(shù)治療的費(fèi)用高昂，給多數(shù)家庭帶來了經(jīng)濟(jì)壓力［4］。參仙升脈口服液是臨床常用的治療心動(dòng)過緩和心律失常的復(fù)合藥物，具有溫補(bǔ)心腎及活血化瘀的功效，可通過增強(qiáng)細(xì)胞代謝活力，提高心率［5］。竇房結(jié)細(xì)胞具有高度的自律性，細(xì)胞膜上存在超級(jí)化激活環(huán)核苷酸陽離子（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated，HCN）通道，HCN 通道有4種亞型，竇房結(jié)細(xì)胞主要表達(dá)環(huán)化核苷酸調(diào)控陽離子通道蛋白亞型4（cyclic nucleotide regulated cation channel protein subtype 4，HCN4），維持心臟正常的起搏電流［6］。當(dāng)竇房結(jié)細(xì)胞受到損傷時(shí)，HCN4 的表達(dá)受到影響，影響電信號(hào)的傳導(dǎo)，造成心率減慢和心律異常［7］。心肌細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），當(dāng)循環(huán)失去平衡時(shí)，出現(xiàn)持續(xù)性氧化應(yīng)激，過量的ROS 就會(huì)損傷心肌細(xì)胞［8］，導(dǎo)致心律失常。然而參仙升脈口服液對(duì)HCN4 離子通道的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制尚未見報(bào)道。本文作者建立小鼠SSS 模型，基于參仙升脈口服液對(duì)SSS 小鼠ROS 釋放的影響，探討其對(duì)HCN4 離子通道調(diào)控的作用，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器30只C57B6小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在約23℃，濕度約為70%。參仙升脈口服液購于山東步長制藥有限公司，抗體SCN5A（ab56240）、CACNα1C（ab58552）、CACNα1G（ab128251）、CACNα1G（ab32675）和HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（ab6721）（美國Abcam 公司）和ECL 發(fā)光試盒（34580）購于美國賽默飛公司，ROS 染色液（D7008）購于美國Sigma 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒購于日本TaKaRa公司，Masson染色試劑盒（G1340）和HE染色試劑盒（G1121）購自美國索萊寶公司。倒置熒光顯微鏡（FM-500）購自上海普丹公司，酶標(biāo)儀（Epoch）購自美國BioTek 公司，WB 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（JP-K300）購自廣州滬瑞明儀器廠，MEDLAB 生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)購自上海瑞鮑生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組30只C57B6 小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、SSS組和參仙升脈治療（SXSM）組，每組10只。

1.3 SSS 模型小鼠制備采用2% 戊巴比妥鈉腹腔注射（45 mg·kg－1）麻醉小鼠，俯臥固定小鼠四肢，頸后備皮處切口，制作囊袋，將Alzet 滲透壓泵植入囊袋，滲透壓泵中放入血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）（3 mg·kg－1·d－1），縫合切口，通過微量泵入AngⅡ建立竇房結(jié)纖維化模型模擬SSS［9］；采用同樣方法處理假手術(shù)組小鼠，將AngⅡ替換成生理鹽水（3 mg·kg－1·d－1）；SXSM組在小鼠造模后第2天灌胃參仙升脈口服液（0.2 mL·d－1），持續(xù)28 d。采集竇房結(jié)組織，取一部分置于中性甲醛中固定，一部分置于－80℃冰箱待用。

1.4 各組小鼠心率檢測對(duì)各組小鼠于造模前0 d 和造模后7、14、21、28 d 檢測心率，麻醉小鼠后，仰臥固定，刺入信號(hào)傳導(dǎo)需要的電極針，接入電極后，利用生物信息采集系統(tǒng)采集各組小鼠的心率。

1.5 HE 染色觀察各組小鼠竇房結(jié)組織損傷情況取出固定液中的竇房結(jié)組織樣本，流水沖洗后酒精梯度脫水，采用二甲苯透明，浸入石蠟中包埋，包埋后蠟塊連續(xù)切片，厚度為5 μm。展片、貼片和脫蠟后進(jìn)行蘇木素染色及伊紅染色，樹脂膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠竇房結(jié)組織損傷情況。

1.6 MASSON 染色觀察各組小鼠竇房結(jié)組織纖維化情況取出固定竇房結(jié)組織樣本，沖洗，酒精梯度脫水，透明后浸入石蠟包埋，包埋蠟塊連續(xù)切片，厚度為5 μm。展片、貼片、脫蠟，采用Masson 染色試劑盒染色，樹脂膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠竇房結(jié)組織纖維化情況。

1.7 免疫熒光法檢測各組小鼠竇房結(jié)組織中ROS水平取出竇房結(jié)冰凍組織，制作冰凍切片，切片在室溫下復(fù)溫，控干水分。采用組織化學(xué)筆在組織周圍畫圈，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑保持5 min，流水沖洗10 min，在圈內(nèi)滴加ROS染液，避光37℃恒溫孵育30min；采用PBS洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min；采用PBS 緩沖液洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后采用抗熒光淬滅封片劑封片。于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，采用Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度，將參數(shù)設(shè)置為“Analyse”，直接檢測熒光強(qiáng)度，以呈現(xiàn)熒光的面積與總面積百分比代表ROS 水平。

1.8 RT-qPCR 法檢測各組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A、CACNα1C 和CACNα1GmRNA表達(dá)水平采用TRIzol裂解液裂解小鼠竇房結(jié)組織后，按照常規(guī)方法提取組織中RNA，并合成熒光定量引物。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

提取后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，配伍反應(yīng)體系，放置于RT-qPCR 儀中，設(shè)置PCR 熱循環(huán)參數(shù)：95℃、2 min，95℃、30 s，60℃、30s收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計(jì)算各組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A、CACNα1C 和CACNα1G mRNA 表達(dá)水平。

1.9 Western blotting 法檢測各組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A、CACNα1C、CACNα1G 和HCN4 蛋白表達(dá)水平取各組小鼠竇房結(jié)組織，加入RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑、PMSF 提取總蛋白質(zhì)。BCA法測定蛋白濃度，各組取相同質(zhì)量蛋白質(zhì)進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉液室溫封閉3 h，TBST洗膜3次，每次10 min，按說明書建議比例加入SCN5A、CACNα1C、CACNα1G、HCN4 和GAPDH抗體稀釋液，TBST 洗膜，每次5 min，洗滌3次。加入HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育3 h。采用ECL 發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Image J軟件計(jì)算條帶的灰度值，將目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

1.10 免疫熒光法檢測各組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 水平采用免疫熒光法檢測各組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4水平，操作步驟同“1.7”。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad prism8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠心率，各組小鼠竇房結(jié)組織中ROS 和HCN4 水平，竇房結(jié)組織中SCN5A、CACNα1C 和CACNα1G mRNA表達(dá)水平和SCN5A、CACNα1C、CACNα1G 及HCN4 蛋白表達(dá)水平均以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心率接入電極后，采用生物信息采集系統(tǒng)采集各組小鼠的心率進(jìn)行分析，隨著時(shí)間的延長，與假手術(shù)組比較，從第7天開始，SSS組和SXSM組小鼠心率逐漸降低（P＜0.05）；與SSS組比較，從第14天開始SXSM組小鼠心率升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠心率Fig.1 Heart rates of mice in various groups

2.2 各組小鼠竇房結(jié)組織損傷和纖維化情況HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組小鼠竇房結(jié)區(qū)域竇房結(jié)組織中細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰明顯，細(xì)胞分布均勻；SSS組小鼠正常竇房結(jié)組織中較多細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)溶解壞死，未見細(xì)胞核，結(jié)締纖維組織增生；SXSM組小鼠出現(xiàn)較少部分細(xì)胞壞死，結(jié)締纖維組織少量增生，見圖2。Masson 染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組小鼠竇房結(jié)組織中細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，紋理清晰，界限明顯，組織間隙存在極少量結(jié)締組織；SSS組小鼠竇房結(jié)組織中細(xì)胞大量溶解壞死，組織間隙結(jié)締纖維組織大量增生；SXSM組小鼠竇房結(jié)組織中細(xì)胞間隙有少量膠原纖維，細(xì)胞部分壞死溶解，多數(shù)細(xì)胞輪廓清晰。見圖3。

圖2 HE 染色觀察各組小鼠竇房結(jié)組織病理形態(tài)表現(xiàn)（×200）Fig.2 Pathomorphology of sinoatrial node tissue of mice in various groups detected by HE staining（×200）

圖3 Masson 染色觀察各組小鼠竇房結(jié)組織纖維化情況（×200）Fig.3 Fibrillation of sinoatrial node tissue of mice in various groups detected by Masson staining（×200）

2.3 各組小鼠竇房結(jié)組織中ROS 水平免疫熒光法檢測各組小鼠竇房結(jié)組織中ROS 水平結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，SSS組和SXSM組小鼠竇房結(jié)組織中熒光強(qiáng)度明顯增加，ROS 水平升高（P＜0.05）；與SSS組比較，SXSM組小鼠竇房結(jié)組織中熒光強(qiáng)度明顯降低，ROS 水平降低（P＜0.05）。見圖4 和5。

圖4 各組小鼠竇房結(jié)組織中ROS 的陽性表達(dá)(免疫熒光,Bar=20 μm)Fig.4 Positive expressions of ROS in sinoatrial node tissue of mice in various groups(Immunofluorescence,Bar=20 μm)

2.4 各組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A、CACNα1C和CACNα1G mRNA 表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，SSS組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），CACNα1C 和CACNα1G mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與SSS組比較，SXSM組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），CACNα1C 和CACNα1G mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A、CACNα1C 和CACNα1G mRNA 表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of SCN5A,CACNα1C，and CACNα1G mRNA in sinoatrial node tissue of mice in various groups

2.5 各組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A、CACNα1C和CACNα1G 蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，SSS組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），CACNα1C 和CACNα1G 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與SSS組比較，SXSM組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），CACNα1C 和CACNα1G 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A、CACNα1C 和CACNα1G 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of SCN5A ，CACNα1C，and CACNα1G proteins in sinoatrial node tissue of mice in various groups

2.6 各組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，SSS組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與SSS組比較，SXSM組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見圖8。

圖8 各組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of HCN4 protein in sinoatrial node tissue of mice in various groups

2.7 免疫熒光法檢測各組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 水平與假手術(shù)組比較，SSS組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 表達(dá)熒光強(qiáng)度明顯減弱，HCN4 水平降低（P＜0.05）；與SSS組比較，SXSM組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 表達(dá)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，HCN4 水平升高（P＜0.05）。見圖9 和10。

圖9 各組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 的陽性表達(dá)(免疫熒光,Bar=20 μm)Fig.9 Positive expression of HCN4 in sinoatrial node tissue of mice in various groups(Immunofluorescence,Bar=20 μm)

圖5 各組小鼠竇房結(jié)組織中ROS 水平Fig.5 Levels of ROS in sinoatrial node tissue of mice in various groups

3 討 論

引起SSS 的原因有很多［10］，竇房結(jié)細(xì)胞退行性病理改變、冠心病和心肌炎等心臟疾病均可引起SSS。SSS 的臨床治療常以植入起搏器為主要手段，但其價(jià)格較高，不能被大多數(shù)患者及其家屬所接 受［11］。臨床研究［12］顯示：參仙升脈口服液能夠有效治療竇房結(jié)心動(dòng)過緩及病態(tài)竇房結(jié)導(dǎo)致的心律失常。本研究結(jié)果表明：參仙升脈口服液可以明顯提高SSS小鼠心率，抑制竇房結(jié)纖維化的發(fā)生；心肌細(xì)胞的活動(dòng)需要大量的線粒體功能來實(shí)現(xiàn)［13］，平衡狀態(tài)下ROS 對(duì)心肌細(xì)胞興奮性的產(chǎn)生具有一定作用，過量蓄積時(shí)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞損傷和凋亡。李超等［14］發(fā)現(xiàn)：慢性心衰大鼠的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平均高于正常組，說明在心率減退下降的過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)參與其中，而抑制這種氧化應(yīng)激反應(yīng)后能夠增強(qiáng)心功能增加心率。研究［15］顯示：外源性給予雙氧水（H2O2）模擬氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，心臟起搏電流會(huì)受到影響，同時(shí)HCN 通道蛋白的表達(dá)受到影響，而該作用與ROS 的過量釋放存在一定關(guān)系。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，SSS組小鼠竇房結(jié)組織中ROS 過度釋放，采用參仙升脈口服液干預(yù)可以抑制這一現(xiàn)象，說明參仙升脈口服液可以抑制SSS 小鼠竇房結(jié)中ROS 的釋放，并且推測與HCN通道有關(guān)聯(lián)。

圖10 各組小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 水平Fig.10 Levels of HCN4 in sinoatrial node tissue of mice in various groups

HCN4 屬于超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道基因家族的一員，主要在竇房結(jié)細(xì)胞中表達(dá)，維持并在一定程度上調(diào)節(jié)竇房結(jié)的起搏頻率［16］，HCN4 通道激活產(chǎn)生內(nèi)向的陽離子電流，維持起搏點(diǎn)電位去極化，產(chǎn)生動(dòng)作電位［17］。研究［18］顯示：HCN4 與竇房結(jié)功能障礙和竇性心率過緩存在必然的聯(lián)系，HCN4 表達(dá)異常是導(dǎo)致心律失常的根本原因之一。研究［19］顯示：過表達(dá)HCN4 的干細(xì)胞可以向心肌細(xì)胞分化，并可產(chǎn)生起搏電流；王歡［20］研究顯示：轉(zhuǎn)染HCN4 的干細(xì)胞可以治療緩慢型心律失常。本研究針對(duì)HCN4 離子通道進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：參仙升脈口服液可以提高SSS 小鼠心率，改善其病理損傷；同時(shí)免疫熒光檢測結(jié)果顯示：SSS 小鼠竇房結(jié)組織中HCN4 蛋白表達(dá)水平降低，且參仙升脈口服液可以升高HCN4 蛋白表達(dá)，說明參仙升脈口服液可以提高HCN4 表達(dá)，調(diào)控HCN4 離子通道發(fā)揮增強(qiáng)心率，增強(qiáng)竇房結(jié)功能的作用。心臟鈉通道SCN5A 的缺失或功能喪失突變與廣泛的心律失常有關(guān)［21］。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，SSS組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低，SXSM組小鼠竇房結(jié)組織中SCN5A mRNA 和蛋白表達(dá)水平增加；電壓門控的L- 型鈣通道（L-type calcium channel，LTCC）與心律相關(guān)，是鈣離子流入興奮細(xì)胞響應(yīng)于膜去極化主通路［22］，CACNα1C 是竇房結(jié)細(xì)胞中占主導(dǎo)地位的電壓門控鈣通道，影響心臟的起搏［23］。有研究［24］顯示：CACNα1C 基因表 達(dá)的降低會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞重構(gòu)及收縮能力的降低。電壓門控T 型通道Cav3.1（α1G）Ca2+通道涉及多種生理功能［25］，CACNα1G 是編碼該通道的基因，該通道在起搏器細(xì)胞的自發(fā)活動(dòng)中同樣起重要作用，可影響心率，先天性心動(dòng)過緩和心臟傳導(dǎo)阻滯，均歸因于Cav1.3 和Cav3.1 通道功能的喪失。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，SSS組小鼠竇房結(jié)組織中CACNα1C 和CACNα1G mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低，SXSM組可以逆轉(zhuǎn)這種改變，從而增強(qiáng)竇房結(jié)功能。

綜上所述，參仙升脈口服液可以增強(qiáng)SSS小鼠心率，抑制竇房結(jié)纖維化發(fā)生，其機(jī)制可能與抑制ROS表達(dá)有關(guān)，其可進(jìn)一步通過調(diào)節(jié)HCN4離子通道，增強(qiáng)SSS小鼠的竇房結(jié)功能。