小鼠孕期七氟醚暴露對(duì)后代母系行為學(xué)的影響及氫氣的保護(hù)機(jī)制

黃代強(qiáng), 劉朋飛, 何建斌, 孫靜雪, 袁 琳, 袁 靜, 趙 雷

（1.深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 深圳 518020；2.深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院日間手術(shù)中心，廣東 深圳 518020）

在胚胎階段，機(jī)體各組織器官處于發(fā)生、分化和發(fā)育最敏感的階段。腦發(fā)育是胎兒發(fā)育的重要組成部分，各種內(nèi)外環(huán)境的改變和高危因素都可能對(duì)發(fā)育中的腦組織造成威脅，而腦發(fā)育異常最終導(dǎo)致多種臨床疾病（包括社會(huì)行為異常等）［1-2］。七氟醚血?dú)夥峙湎禂?shù)小，誘導(dǎo)蘇醒迅速，麻醉安全性高，已經(jīng)成為兒科和產(chǎn)科全身麻醉誘導(dǎo)和維持中最常使用的吸入性麻醉藥［3］。有研究［4-5］顯示：新生小鼠接受七氟醚麻醉后，不但出現(xiàn)學(xué)習(xí)障礙，而且出現(xiàn)反常的社會(huì)行為，如自閉癥譜系障礙，但其具體機(jī)制尚未闡明。研究［6］顯示：嬰幼兒期接觸過(guò)七氟醚的小鼠，母系行為缺失，盡管分娩過(guò)程正常，但新生小鼠死亡率明顯增高，其具體機(jī)制尚未闡明［6］。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于孕期七氟醚暴露是否同樣導(dǎo)致新生小鼠成年后母系行為缺失的研究報(bào)道。有研究［7-8］顯示：抗氧化治療可以保護(hù)新生兒期小鼠七氟醚暴露引起的神經(jīng)元毒性，這種抗氧化治療可以減輕神經(jīng)元凋亡，同時(shí)減輕學(xué)習(xí)能力損害的程度。SCHULTZ 等［9］將氫氣（H2）用作氣體載體與七氟醚混合，作用于新生小鼠，結(jié)果顯示H2可能對(duì)七氟醚的神經(jīng)毒性起保護(hù)作用。本研究將孕鼠暴露于H2與七氟醚混合的氣體中，觀察其能否改善1代小鼠成年后的母系行為，如果能夠得到改善，說(shuō)明胎兒期接觸七氟醚導(dǎo)致的母系行為缺失的部分原因是由于過(guò)氧化損傷導(dǎo)致，并探討治療異常行為的辦法。同時(shí)，本研究設(shè)計(jì)了2種不同濃度的抗氧化劑，期望通過(guò)對(duì)照研究得出最佳的治療濃度。本研究分析小鼠胎兒期七氟醚暴露后1代新生小鼠成年后的母系行為，觀察孕期接觸七氟醚是否導(dǎo)致后代母系行為表達(dá)異常，探討其可能的機(jī)制及預(yù)防治療措施等，為臨床上孕產(chǎn)婦麻醉劑的使用和藥物開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器40只懷孕15～16 d 的C57BL/6 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。血管加壓素ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision 公司，催產(chǎn)素ELISA 試劑盒、兔抗c-Fos多克隆抗體、兔抗PARP 多克隆抗體和兔抗Caspase 3 多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，小鼠抗GAPDH 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 和ECL 發(fā)光液均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。EXL-808 酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)寶特公司，Western blotting 電泳設(shè)備購(gòu)自上海天能公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理方法小鼠每日12h光照（7： 00～19： 00），室溫維持在（21±1）℃，濕度維持在45%～60%。小鼠自主飲食。將懷孕15～16 d C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、2% 七氟醚組、2%七氟醚+1% H2組和2%七氟醚+4% H2組。4組小鼠均以50% O2+ 50% N2為載氣，各組小鼠處理時(shí)間均為6 h·d－1，連續(xù)處理3 d 后，各組孕鼠繼續(xù)喂養(yǎng)，其后代（1代）在受孕后被用來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)深圳市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 各組1代小鼠母系行為學(xué)評(píng)價(jià)7～9周齡大的1代小鼠與健康成年雄性小鼠配種，進(jìn)行母系社會(huì)行為學(xué)的分析。各組取10只雌性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有母系行為評(píng)價(jià)均由同一觀察員記錄：①記錄各組2代幼崽需要采用牛奶喂養(yǎng)的數(shù)量；②記錄各組中不清潔的2代幼崽數(shù)量，不清潔的定義包括胎盤(pán)、羊膜或者臍帶的殘留；③評(píng)價(jià)各組母鼠做窩質(zhì)量評(píng)分，一共分4級(jí)（0級(jí)：無(wú)邊緣，計(jì)0分；1級(jí)：窩的四周邊緣低平，計(jì)1分；2級(jí)：窩的四周邊緣中等高度，計(jì)2分；3級(jí)：窩的形狀像一個(gè)中空形狀，四周邊緣高的盒子，計(jì)3分）；④取回幼崽實(shí)驗(yàn)：每只2代幼崽被隔離30 min 后，將1代小鼠放在一個(gè)盒子的1個(gè)角，2代幼崽放在其他3個(gè)角，連續(xù)觀察10 min。記錄1代小鼠第1次去嗅2代幼崽的時(shí)間和將2代幼崽重新放回窩內(nèi)的時(shí)間；⑤幼崽交換撫育實(shí)驗(yàn)：將2% 七氟醚組2代幼崽交給正常對(duì)照組1代小鼠進(jìn)行喂養(yǎng)，同時(shí)，將正常對(duì)照組2代幼崽交給2% 七氟醚組1代小鼠喂養(yǎng)，觀察兩者存活率差異。存活率=交換后存活幼崽數(shù)量/交換后幼崽總數(shù)×100%。

1.4 各組1代小鼠血漿中催產(chǎn)素和血管加壓素水平檢測(cè)分娩后6h處死各組1代孕鼠，收集各組孕鼠的血漿，按照催產(chǎn)素和血管加壓素ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組1代小鼠血漿中催產(chǎn)素和血管加壓素水平。

1.5 Western blotting 法檢測(cè)各組孕鼠下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平處死孕鼠后，取各組孕鼠下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)組織，采用Western blotting 法檢測(cè)各組孕鼠下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)組織中c-Fos癌基因（c-Fos proto-oncogene，c-Fos）、多聚ADP核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1）、剪切的PARP1（cleaved PARP1）、Caspase 3和剪切的Caspase 3（cleaved Caspase 3）蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠血漿中催產(chǎn)素和血管加壓素的水平，下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)組織中c-Fos、PARP1、cleaved PARP1、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表達(dá)水平符合正態(tài)分析，均以±s表示。各組小鼠牛奶喂養(yǎng)數(shù)量、不清潔2代幼崽數(shù)量、母鼠做窩質(zhì)量、取回幼崽的時(shí)間和幼崽交換撫育的存活率以±s 表示。各組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 1代孕鼠母系行為評(píng)價(jià)指標(biāo)1代孕鼠分娩后，各組均未見(jiàn)任何需要牛奶喂養(yǎng)的2代幼崽，此外，也未見(jiàn)任何不清潔的2代幼崽。各組母鼠做窩質(zhì)量評(píng)分結(jié)果顯示：各組母鼠做窩質(zhì)量十分相近，大多數(shù)鼠窩呈中空形狀，四周邊緣較高，各組母鼠做窩質(zhì)量評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。取回幼崽實(shí)驗(yàn)中，2% 七氟醚組母鼠第1次去嗅幼崽時(shí)間明顯長(zhǎng)于正常對(duì)照組（P＜0.05），將幼崽取回放入窩內(nèi)時(shí)間也明顯長(zhǎng)于正常對(duì)照組（P＜0.05），表明七氟醚在一定程度上影響了母鼠的母系行為學(xué)，2% 七氟醚+1% H2組和2% 七氟醚+4% H2組1代母鼠第1次去嗅幼崽時(shí)間和將幼崽取回放入窩內(nèi)的時(shí)間縮短（P＜0.05），2% 七氟醚+4% H2組母鼠將幼崽取回放入窩內(nèi)的時(shí)間與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。H2可能對(duì)七氟醚引起的母系行為學(xué)障礙有一定防護(hù)作用。正常對(duì)照組和2% 七氟醚組母鼠的幼崽交換撫育成活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組1代小鼠母系行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)Tab.1 Indexes of matrilineal behavioral evaluation of 1st-generation mice (n=10，±s）

表1 各組1代小鼠母系行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)Tab.1 Indexes of matrilineal behavioral evaluation of 1st-generation mice (n=10，±s）

“－”：No data.*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs 2% sevflurane+1% H2 group.

Group Normal control 2% sevoflurane 2% sevoflurane +1% H2 2% sevoflurane +4% H2 Score of nest quality 2.8±1.03 2.8±1.03 2.7±0.94 2.7±0.78 Time to sniff pups (t/s)48.5±9.85 77.9±13.9*70.9±9.05*59.9±9.83*△Time to retrieve pups and put into nest (t/s)396.1±69.5 553.0±49.2*536.8±51.0*456.6±67.8*△Survival rate of 2ndgeneration exchange pups(η/%)96.9±4.98 92.2±10.7－ －

2.2 各組1代小鼠血漿中催產(chǎn)素和血管加壓素水平各組1代小鼠血漿中催產(chǎn)素和血管加壓素水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明胎兒期七氟醚暴露并不影響雌性激素的水平。見(jiàn)表2。

表2 各組1代小鼠血漿中催產(chǎn)素和血管加壓素水平Tab.2 Levels of oxytocin and vasopressin in plasma of 1stgeneration mice in various groups [n=10,±s,ρB/(ng?L-1)]

表2 各組1代小鼠血漿中催產(chǎn)素和血管加壓素水平Tab.2 Levels of oxytocin and vasopressin in plasma of 1stgeneration mice in various groups [n=10,±s,ρB/(ng?L-1)]

Group Normal control 2% sevoflurane 2% sevoflurane +1% H2 2% sevoflurane +4% H2 Oxytocin 323.5±56.7 321.0±35.6 324.3±62.8 328.3±38.4 Vasopressin 693.2±42.9 697.1±54.5 695.6±41.0 687.7±55.8

2.3 各組孕鼠下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)組織中c-Fos、PARP1、cleaved PARP1、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表達(dá)水平Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：各組1代小鼠下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)組織中c-Fos、cleaved PARP1、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 Western blotting 法檢測(cè)各組1代小鼠下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)組織中c-Fos、PARP1、cleaved PARP1、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.1 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of c-Fos, PARP1, cleaved PARP1, Caspase 3, and cleaved Caspase 3 proteins in medial preoptic area in hypothalamus tissue of 1st-generation mice in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

人類大腦快速發(fā)育的時(shí)期從妊娠后期到出生后數(shù)年，在嚙齒類動(dòng)物，該階段從妊娠后期持續(xù)到出生后2周左右［10］。研究［11］顯示：在神經(jīng)突觸發(fā)育的重要階段接受某些麻醉劑，會(huì)引起神經(jīng)元凋亡和抑制神經(jīng)再生，從而導(dǎo)致認(rèn)知和社會(huì)行為異常，這種異常甚至持續(xù)到動(dòng)物成年。有研究［12］已經(jīng)證實(shí)：哺乳動(dòng)物新生期暴露于臨床有效麻醉濃度的麻醉劑會(huì)導(dǎo)致大腦發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)廣泛的神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而造成成年后學(xué)習(xí)能力下降，盡管成年后神經(jīng)元凋亡已經(jīng)不明顯。2016年，美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）［13］發(fā)表聲明：懷孕母親及兒童反復(fù)或持續(xù)接受麻醉藥會(huì)阻礙新生兒神經(jīng)發(fā)育，但其機(jī)制尚不清楚。目前兒童的七氟醚麻醉問(wèn)題已逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)，但極少有關(guān)于妊娠期七氟醚暴露群體的相關(guān)研究。有研究［14］表明：新生小鼠接受七氟醚麻醉后，不但可以導(dǎo)致學(xué)習(xí)障礙，而且可以引起反常的社會(huì)行為，比如自閉癥譜系障礙，但其具體機(jī)制尚未闡明。

目前認(rèn)為人類的母系行為表達(dá)和后代構(gòu)建社會(huì)行為密切相關(guān)，母系行為缺失的母親，其后代罹患精神疾病的概率增加［15-16］。母系行為的神經(jīng)機(jī)制研究大部分集中在嚙齒類動(dòng)物，這種行為是一個(gè)極其復(fù)雜的社會(huì)行為任務(wù)［17］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：盡管在取回幼崽實(shí)驗(yàn)中，七氟醚組母鼠第1次去嗅幼崽時(shí)間明顯長(zhǎng)于正常對(duì)照組，同時(shí)，將幼崽取回放入窩內(nèi)的時(shí)間也明顯長(zhǎng)于正常對(duì)照組，經(jīng)H2作用處理后，母鼠第1次去嗅幼崽時(shí)間和將幼崽取回放入窩內(nèi)的時(shí)間可明顯縮短。由此可見(jiàn)七氟醚對(duì)小鼠的母系行為學(xué)造成了一定的影響，而且H2具有一定的保護(hù)作用。但是，最佳的評(píng)價(jià)模型和具體的作用機(jī)制仍未明確。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下丘腦細(xì)胞凋亡指標(biāo)，結(jié)果顯示：各組1代小鼠下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)組織中c-Fos、PARP1、cleaved PARP、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，小鼠血漿中催產(chǎn)素和血管加壓素水平也未見(jiàn)顯著變化。因此，暴露于臨床劑量的七氟醚可能不會(huì)顯著影響下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)細(xì)胞的凋亡情況，細(xì)胞凋亡也可能并不是七氟醚影響母系行為的機(jī)制。

近年來(lái)，除經(jīng)典的細(xì)胞凋亡外，自噬死亡和鐵死亡成為區(qū)別于細(xì)胞凋亡的新的死亡模式，在多個(gè)領(lǐng)域均產(chǎn)生了重要的影響［17-20］。因此，未見(jiàn)顯著細(xì)胞凋亡的情況下，這些細(xì)胞死亡模式可能發(fā)揮重要的作用。進(jìn)一步探討小鼠下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)組織中自噬死亡和鐵死亡的相關(guān)指標(biāo)，有助于深入分析七氟醚影響母系行為學(xué)的機(jī)制。這些機(jī)制研究對(duì)于了解現(xiàn)代人類精神疾病的發(fā)生與胎兒期接受麻醉藥物之間的關(guān)系、優(yōu)化臨床上對(duì)于孕產(chǎn)婦的麻醉劑使用情況和開(kāi)發(fā)針對(duì)這一負(fù)面效應(yīng)的藥物具有重要的理論和實(shí)踐意義。