合成大麻素類新精神活性物質(zhì)的代謝物鑒定研究進(jìn)展

李樂，趙君博，嚴(yán)慧，劉萬卉，向平，吳何堅(jiān)

1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；2.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005

合成大麻素類新精神活性物質(zhì)是與天然大麻主要活性成分四氫大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）相似的人工合成物質(zhì)，是內(nèi)源性大麻素受體1（cannabinoid receptor 1，CB1）和CB2的激動(dòng)劑，其中CB1主要存在于神經(jīng)細(xì)胞，介導(dǎo)與大麻相關(guān)的精神效應(yīng)，而CB2主要存在于免疫細(xì)胞[1-3]。合成大麻素不依賴于大麻的種植，成本更低且獲取容易，能產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的興奮、致幻等效果，是目前世界上新精神活性物質(zhì)中涵蓋物質(zhì)種類最多、濫用最為嚴(yán)重的家族[4]。歐洲毒品和毒癮監(jiān)測(cè)中心（European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction，EMCDDA）在2021 年的世界毒品報(bào)告中指出，合成大麻素類物質(zhì)是監(jiān)測(cè)到的最大一類[5]。

合成大麻素于2008 年首次被發(fā)現(xiàn)，德國的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室在網(wǎng)絡(luò)上熱銷的一種名為“香料”的產(chǎn)品中首次檢出1-戊基-3-（1-萘甲酰基）吲哚（JWH-018），同年12 月，歐洲和日本首次確定將合成大麻素歸類為娛樂性濫用藥物[6-7]，隨后其他國家也將其進(jìn)行了列管[8]。但仍有不法分子對(duì)列管內(nèi)的合成大麻素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以規(guī)避相關(guān)法律規(guī)定，吸食該類物質(zhì)后會(huì)出現(xiàn)頭暈、嘔吐、精神恍惚、致幻等反應(yīng)，過量吸食會(huì)出現(xiàn)休克、窒息甚至猝死等情況[9-10]，已引發(fā)多起毒駕、故意傷害等危害公共安全事件。我國于2021年7月正式整類列管合成大麻素，與之相關(guān)的合成大麻素濫用監(jiān)測(cè)技術(shù)亟待提高。合成大麻素在人體內(nèi)代謝迅速，尿液中幾乎無法檢出原體[11-14]。一般來講，Ⅰ相代謝產(chǎn)物可作為鑒別合成大麻素是否攝入的最佳代謝標(biāo)志物，因?yàn)槠滟|(zhì)譜響應(yīng)較高，并且在一段時(shí)間內(nèi)比Ⅱ相代謝產(chǎn)物穩(wěn)定。其中還有一些羥基化代謝產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生比合成大麻素原體更大的毒性，比如JWH-018 的主要代謝產(chǎn)物4’-羥基-JWH-018 和5’-羥基-JWH-018，1-（5-氟戊基）-3-（1-萘甲酰基）-1H-吲哚（AM-2201）的主要代謝產(chǎn)物4’-羥基-AM-2201[15]，有報(bào)道[16]稱服用JWH-018 后會(huì)導(dǎo)致癲癇發(fā)作和室上性心動(dòng)過速，所以對(duì)新出現(xiàn)的合成大麻素進(jìn)行代謝研究非常重要。許多新精神活性物質(zhì)的代謝物仍具有藥理活性，同時(shí)，代謝物對(duì)確認(rèn)攝取新精神活性物質(zhì)、延長檢出時(shí)限、提供攝毒信息等具有極大應(yīng)用價(jià)值，因此，代謝物通常與原體物質(zhì)一同被納入分析鑒定的范疇。隨著合成大麻素的不斷涌現(xiàn)和泛濫，對(duì)其代謝物進(jìn)行鑒定成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。合成大麻素種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同合成大麻素的體內(nèi)代謝與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，明確合成大麻素體內(nèi)代謝及其與結(jié)構(gòu)的關(guān)系可有效補(bǔ)充合成大麻素的相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)。此外，體內(nèi)外代謝研究可以為合成大麻素濫用監(jiān)測(cè)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本文基于合成大麻素的結(jié)構(gòu)和分類，對(duì)代謝軟件預(yù)測(cè)以及人肝細(xì)胞模型、人肝微粒體模型、大鼠體內(nèi)模型、斑馬魚模型、真菌秀麗線蟲模型在代謝物鑒定方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，在此基礎(chǔ)上可以對(duì)新出現(xiàn)的合成大麻素在體內(nèi)的代謝情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，在沒有代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下可以根據(jù)相關(guān)代謝物的參考譜圖對(duì)合成大麻素進(jìn)行鑒別，為臨床監(jiān)測(cè)和法醫(yī)毒物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物檢材中合成大麻素及其相關(guān)代謝物的分析提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

1 結(jié)構(gòu)和分類

大多數(shù)合成大麻素是親脂性和非極性的化合物，一般由20～26 個(gè)碳原子組成。典型的合成大麻素結(jié)構(gòu)主要由四部分組成：帶取代基的母核、鏈接部分、鏈接組和末端取代基[17-18]。鏈接組指的是戊基吲哚環(huán)或吲唑環(huán)與萘環(huán)之間的化學(xué)鍵，主要是羰基、酯鍵、酰胺鍵[19-20]。聯(lián)合國毒品和犯罪問題辦公室（United Na?tions Office on Drugs and Crime，UNODC）根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)將合成大麻素主要分為經(jīng)典大麻、萘甲?；胚犷悺⒈揭阴；胚犷?、苯甲?；胚犷悺⑤良谆胚犷?、金剛烷甲酰基吲哚類、萘甲酰基吡咯類、環(huán)丙基甲酰吲哚類、吲唑酰胺類和其他合成大麻素[21-22]。

2 代謝軟件預(yù)測(cè)

在制藥行業(yè)，代謝軟件預(yù)測(cè)潛在的毒性代謝物對(duì)臨床前研究和臨床決策都非常重要[23-30]。該工具主要基于專家知識(shí)預(yù)測(cè)目標(biāo)化合物在體內(nèi)的代謝情況，研究人員通過積累代謝研究經(jīng)驗(yàn)、完善代謝物數(shù)據(jù)庫、總結(jié)最新的代謝知識(shí)、及時(shí)將其轉(zhuǎn)化為代謝規(guī)則、定期更新數(shù)據(jù)庫，為未知代謝物的鑒定提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。

2011 年，T’JOLLYN 等[24]對(duì)Meteor、MetaSite、Star?Drop 代謝軟件預(yù)測(cè)工具進(jìn)行了評(píng)估。其中Meteor 是一個(gè)基于代謝經(jīng)驗(yàn)的軟件預(yù)測(cè)工具。MetaSite 是一種與血紅素相關(guān)的代謝軟件，可用于預(yù)測(cè)在細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶參與下的Ⅰ相代謝反應(yīng)，但并不涉及非CYP450 酶介導(dǎo)的反應(yīng)，比如[1-（5-氟戊基）-1H-吲唑-3-基]（萘-1-基）甲酮（THJ-2201）的氧化脫氟反應(yīng)不是由CYP450 酶催化產(chǎn)生的，所以MetaSite 對(duì)THJ-2201 的代謝預(yù)測(cè)沒有包含該反應(yīng)[26]。StarDrop 則是通過分子動(dòng)力學(xué)和量子化學(xué)模擬CYP450 3A4、2D6、2C9 參與下的相關(guān)代謝反應(yīng)，預(yù)測(cè)藥物研發(fā)中小分子藥物的代謝位點(diǎn)[27]。META 通過匯總與代謝相關(guān)的主要酶，并對(duì)每個(gè)酶的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)及其活性進(jìn)行評(píng)估，其中包含1 000 多種生物轉(zhuǎn)化，涵蓋了30種轉(zhuǎn)化酶[28]。MetabolExpert 可在藥物發(fā)現(xiàn)過程或研究階段快速預(yù)測(cè)化合物的代謝過程，有助于對(duì)代謝物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒別，其中10.0版本的數(shù)據(jù)庫包含了17 種生物轉(zhuǎn)化，新版本更是可以預(yù)測(cè)通過新陳代謝產(chǎn)生特定化合物的底物[29]。MetaDrug 則是基于規(guī)則對(duì)人體內(nèi)的代謝物進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過一個(gè)通用的分析程序?qū)氲玫降拇x組學(xué)數(shù)據(jù)，然后逐個(gè)分析或與結(jié)構(gòu)信息學(xué)橫向相結(jié)合進(jìn)行分析[30]。

DIAO 等[31]對(duì)THJ-2201 的代謝進(jìn)行了研究，在進(jìn)行肝細(xì)胞孵育實(shí)驗(yàn)之前首先用MetaSite 代謝軟件進(jìn)行了預(yù)測(cè)，該軟件共預(yù)測(cè)了8 種Ⅰ相代謝產(chǎn)物和7 種Ⅱ相代謝產(chǎn)物，主要涉及脫烷基化、羥基化、羰基化和烯基化的代謝反應(yīng)，但軟件預(yù)測(cè)的代謝產(chǎn)物與人肝細(xì)胞孵育、尿液中的代謝情況不一致。研究人員采用高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)THJ-2201在人肝細(xì)胞模型中的代謝情況進(jìn)行表征，共得到了27 種代謝產(chǎn)物，其中最主要的兩種代謝產(chǎn)物是N-戊酸-THJ-018 和5’-羥基-THJ-018。尿液中的THJ-2201通過氧化脫氟生成5’-羥基-THJ-018 后進(jìn)一步氧化為N-戊酸-THJ-018。N-戊酸-THJ-018 可以作為鑒別THJ-2201 是否攝入的代謝標(biāo)志物[32]。ADAMS 等[33]在一次大規(guī)模的中毒案件中采用代謝軟件預(yù)測(cè)尿液中的羧酸化代謝產(chǎn)物用于鑒別3-甲基-2-[1-（4-氟芐基）吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（AMB-FUBINACA）的攝入，所得樣品采用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分析后，在所有8 名患者的血清和全血中都發(fā)現(xiàn)了脫酯基后羧酸化的代謝產(chǎn)物。

軟件預(yù)測(cè)的主要優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單、計(jì)算速度快，不需要參考標(biāo)準(zhǔn)、孵育或高分辨質(zhì)譜技術(shù)，不受種屬差異性的限制[34]。但軟件中所包含的代謝酶種類有限，不包含化合物的全部代謝途徑。隨著對(duì)底物和酶活性位點(diǎn)作用機(jī)理的深入了解，詳細(xì)分析相關(guān)代謝數(shù)據(jù)，有助于專業(yè)人員對(duì)代謝規(guī)則進(jìn)行補(bǔ)充。雖然軟件預(yù)測(cè)出來的代謝物種類更多，但假陽性結(jié)果也比較多，要求相關(guān)人員具有代謝經(jīng)驗(yàn)的同時(shí)，還應(yīng)該結(jié)合代謝物鑒定模型以及實(shí)際生物檢材獲得的數(shù)據(jù)，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行系統(tǒng)性的研究，為實(shí)際案情的解析提供可靠的依據(jù)。

3 代謝物鑒定模型

人體內(nèi)的代謝主要是通過將外源性藥物轉(zhuǎn)化為水溶性更大的代謝物排泄出體外[35]，主要在肝中進(jìn)行，也發(fā)生在消化道、肺、腎、腸和心臟等其他部位，藥物的代謝主要與局部組織的血流量和代謝相關(guān)酶的分布有關(guān)，其中肝血流量豐富且含有大部分代謝酶，特別是CYP450 家族[36-38]。代謝模型的建立為全面評(píng)估化合物在人體內(nèi)的代謝提供了有效的研究手段。本文對(duì)常見的體內(nèi)外代謝模型（人肝細(xì)胞模型、人肝微粒體模型、大鼠體內(nèi)模型、斑馬魚模型和真菌秀麗線蟲模型）的特點(diǎn)進(jìn)行了比較。附表1 總結(jié)了合成大麻素的常見代謝模型以及相關(guān)的代謝途徑[39-67]。

3.1 體外代謝模型

3.1.1 人肝細(xì)胞模型

肝細(xì)胞是從生物體內(nèi)分離出來的活細(xì)胞，包含完整的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶、代謝所需的輔因子、攝取和外排藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及藥物結(jié)合蛋白[34]，人肝細(xì)胞相比于人肝微粒體模型可以系統(tǒng)反映化合物在人體肝組織內(nèi)的代謝情況，是研究合成大麻素在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的理想模型[68]。為了優(yōu)化合成大麻素在人肝細(xì)胞中的代謝條件，研究人員首先通過量化人肝微粒體孵育過程中合成大麻素的消耗量來確定合成大麻素的半衰期。

該模型已經(jīng)成功預(yù)測(cè)了尿液中合成大麻素的主要代謝產(chǎn)物，包括N-（1-氨甲酰基-2-甲基丙基）-1-戊基吲唑-3-甲酰胺（AB-PINACA）和N-（1-氨甲?；?2-甲基丙基）-1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰胺（5FAB-PINACA）[39]、1-（4-氟芐基）-1H-吲哚-3-甲酸-1-萘酯（FDU-PB-22）和1-（4-氟芐基）吲哚-3-甲酸-8-喹啉酯（FUB-PB-22）[40]、1-（5-氟戊基）吲哚-3-甲酸-1-萘酯（NM-2201）[41]、N-（1-氨甲?；?2-甲基丙基）-1-（4-氟芐基）吲唑-3-甲酰胺（AB-FUBINACA）[42]等。CASTANETO 等[42]采用人肝細(xì)胞模型模擬了吲唑酰胺類合成大麻素AB-FUBINACA在人體內(nèi)的代謝情況，利用液相色譜-高分辨質(zhì)譜法（liquid chromatogra?phy-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）分析后共得到了11 種代謝產(chǎn)物，其中人肝細(xì)胞孵育后的主要代謝物是酰胺水解產(chǎn)物，也是尿液中經(jīng)過β-葡萄糖醛酸水解后含量最高的代謝產(chǎn)物。WOHLFARTH等[43]通過人肝細(xì)胞模型對(duì)1-（5-氟戊基）-3-（2，2，3，3-四甲基環(huán)丙甲?；┻胚幔?F-UR-144，XLR-11）進(jìn)行代謝表征，共得到了14 個(gè)Ⅰ相代謝產(chǎn)物和16 個(gè)Ⅱ相代謝產(chǎn)物，主要是羥基化、羧酸化、半縮酮和半縮醛的代謝產(chǎn)物，根據(jù)質(zhì)譜峰面積確定的主要代謝產(chǎn)物為2’-羧基-XLR-11、1-戊基-3-（2，2，3，3-四甲基環(huán)丙甲酰基）吲哚（UR-144）、N-（5’-羥基）-UR-144、羥基-XLR-11 葡萄糖醛酸結(jié)合物和2’-羧基-UR-144 戊酸，其中尿液經(jīng)檢測(cè)后的主要代謝產(chǎn)物是UR-144 戊酸和N-（5’-羥基）-UR-144。TRUVER 等[44]利用人肝細(xì)胞模型和高分辨質(zhì)譜技術(shù)獲得了2-[1-（5-氟戊基）-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（5F-MDMB-PICA）的代謝產(chǎn)物共22 種，在該模型中主要的代謝途徑包括酯水解和酯基水解結(jié)合氧化脫氟，而根據(jù)尿液中的代謝數(shù)據(jù)推測(cè)這些代謝產(chǎn)物可能會(huì)成為篩查5F-MDMB-PICA中毒的代謝標(biāo)志物。

人肝細(xì)胞約占肝總體積的80%，通過該體外模型可以得到豐富的代謝物數(shù)據(jù)，目前已經(jīng)通過現(xiàn)代冷凍保存技術(shù)商品化[69]。但低溫保存的人肝細(xì)胞比人肝微粒體的成本高，而且肝細(xì)胞活性會(huì)受到反復(fù)凍融的影響，應(yīng)嚴(yán)格按照要求在-80 ℃中進(jìn)行保存，解凍后應(yīng)該先檢查肝細(xì)胞的活性。

3.1.2 人肝微粒體模型

人肝微粒體是指肝組織經(jīng)勻漿離心，除去細(xì)胞核和線粒體后，離心、沉淀得到的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡碎片，藥物直接接觸人肝微粒體中的代謝酶（主要含有細(xì)胞色素氧化酶、尿苷二磷酸葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶和酯酶等），不需要穿過細(xì)胞膜，就像在肝細(xì)胞中代謝一樣。研究[45]結(jié)果表明，藥物在人肝微粒體中的生物轉(zhuǎn)化率比人體內(nèi)更高，也比原生肝細(xì)胞高。人肝微粒體模型常被用于預(yù)測(cè)新型合成大麻素在人體內(nèi)的代謝情況。SOBOLEVSKY等[46]采用人肝微粒體模型和液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜、高分辨質(zhì)譜對(duì)萘甲酰基吲哚類合成大麻素AM-2201的代謝途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)，共得到7種代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)該體外模型中的主要代謝反應(yīng)為單羥基化、雙羥基化、N-脫烷基化和二氫二醇的形成，結(jié)合尿液數(shù)據(jù)驗(yàn)證體外數(shù)據(jù)后推薦單羥基化代謝產(chǎn)物為AM-2201 的代謝標(biāo)志物。APIRAKKAN 等[47]利用人肝微粒體模型、高分辨質(zhì)譜對(duì)5F-NNEI［即萘甲?；胚犷惡铣纱舐樗?-（5-氟戊基）-N-（萘-1-基）-1H-吲哚-3-甲酰胺（5F-MN-24）］的代謝途徑進(jìn)行了模擬預(yù)測(cè)，共檢出9 種Ⅰ相代謝產(chǎn)物，主要的代謝途徑包括羥基化和氧化作用，與MINAKATA等[48]報(bào)道的人體尿液和血清中5F-NNEI（即5F-MN-24）的體內(nèi)代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)一致，主要是代謝產(chǎn)物的豐度存在差異，可能與孵育時(shí)間有關(guān)。

人肝微粒體模型的主要缺點(diǎn)是和真實(shí)尿樣中的主要代謝產(chǎn)物存在一定的差異，是由于缺少醛氧化酶、N-乙?；D(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和磺基轉(zhuǎn)移酶等其他酶[70]，如5F-AKB48［即N-（1-金剛烷基）-1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰胺（5F-APINACA）］和AM-2201 的代謝[34]。AM-2201 在人肝微粒體中的代謝情況不能完全匹配真實(shí)尿樣中的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)，原因可能是人肝微粒體中不存在氧化脫氟的相關(guān)酶，在人肝微粒體孵育過程中主要產(chǎn)生N-脫氟戊基、單羥基化、雙羥基化和二氫二醇代謝產(chǎn)物。一位研究員服用5 mg的AM-2201后檢測(cè)尿液中的主要代謝物[15]，共鑒定出4 種主要代謝產(chǎn)物，分別是N-（5’-羥基戊基）-JWH-018、N-戊酸-JWH-018、6’-羥基-吲哚-AM-2201 和N-（4’-羥基戊基）-AM-2201，濃度最高的代謝產(chǎn)物是N-戊酸-JWH-018 和N-（5’-羥基戊基）-JWH-018。而AM-2201 和JWH-018 有相同的代謝產(chǎn)物N-（5’-羥基戊基）-JWH-018 和N-戊酸-JWH-018。因此，僅根據(jù)尿液中這兩種代謝產(chǎn)物鑒別AM-2201 和JWH-018 的攝入具有一定難度，還需要代謝產(chǎn)物6’-羥基-吲哚-AM-2201和N-（4’-羥基戊基）-AM-2201 的數(shù)據(jù)加以區(qū)分。MOGLER 等[71]研究了合成大麻素5-戊基-2-（2-苯基丙-2-基）-2，5-二氫-1H-吡啶[4，3-b]吲哚-1-酮（CUMYL-PEGACLONE）在人肝微粒體和尿液之間的差異，所有人的尿液（n=30）中均未檢出合成大麻素原體，共檢出22 種Ⅰ相代謝產(chǎn)物，經(jīng)人肝微粒體孵育后的單羥基代謝產(chǎn)物濃度最高，主要的代謝途徑包括單羥基化、雙羥基化、脫氫、N-脫烷基化、β-氧化（戊基側(cè)鏈氧化為丙酸代謝產(chǎn)物）、戊基側(cè)鏈羰基化等。其中含量最高的兩種代謝物是戊基側(cè)鏈單羥基化和進(jìn)一步羰基化的代謝產(chǎn)物，可以將這兩種主要代謝產(chǎn)物作為鑒別是否攝入CUMYL-PEGACLONE 的代謝標(biāo)志物。與人肝細(xì)胞模型不同的是，涉及人肝微粒體模型研究的相關(guān)人員要有藥物代謝方面的基礎(chǔ)知識(shí)，特別是代謝途徑和所涉及的酶未知的情況下，還需要確定在人肝微粒體模型中必需輔助因子的信息。

在臨床前毒理學(xué)研究中使用肝微粒體模型而不是肝細(xì)胞模型，是造成c-Met抑制劑SGX-523開發(fā)終止的主要原因[34]。SGX-523 在人體內(nèi)的主要代謝途徑是經(jīng)過醛氧化酶氧化生成2-喹啉酮-SGX-523，其在尿液中的溶解度遠(yuǎn)低于SGX-523，該物質(zhì)可能是造成肝毒性的主要原因。在藥物研究前期，研究人員[72]首先對(duì)肝微粒體進(jìn)行了物種間的比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤導(dǎo)了研究小組將大鼠和狗作為體外毒理學(xué)研究模型，由于醛氧化酶在大鼠和狗體內(nèi)幾乎沒有表達(dá)，不產(chǎn)生毒性代謝物，因此忽略了對(duì)人體的潛在毒性。

3.2 體內(nèi)代謝模型

3.2.1 大鼠體內(nèi)模型

缺乏合成大麻素的臨床前毒理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)，在一定程度上阻礙了對(duì)其的臨床研究。在新型合成大麻素源源不斷涌入市場(chǎng)的棘手情況下，對(duì)每一種新型合成大麻素開展臨床研究不切實(shí)際。因此，研究人員會(huì)選擇體內(nèi)代謝模型系統(tǒng)研究合成大麻素在體內(nèi)的藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)，但研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)代謝模型之間的代謝情況也會(huì)存在一定的差異，如AM-2201 在大鼠和人體內(nèi)產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物既有相同之處也有不同之處[73]。大鼠尿液經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶水解后的主要代謝產(chǎn)物是N-戊酸-JWH-018 和6’-羥基-吲哚-AM-2201，還包括兩個(gè)次要代謝產(chǎn)物N-（5’-羥基戊基）-JWH-018 和N-（4’-羥基戊基）-AM-2201[15]。這些代謝產(chǎn)物的相對(duì)豐度在人和大鼠的尿液中存在較大差異，人尿液中的主要代謝產(chǎn)物是N-戊酸-JWH-018 和N-（5’-羥基戊基）-JWH-018，而代謝產(chǎn)物N-（4’-羥基戊基）-AM-2201 和6’-羥基-吲哚-AM-2201 的相對(duì)豐度較低。KEVIN 等[74]對(duì)大鼠體內(nèi)模型中萘甲?；胚犷惡铣纱舐樗?-戊基-N-（萘-1-基）-1H-吲唑-3-甲酰胺（MN-18）的代謝途徑進(jìn)行了研究，向SD 大鼠的腹腔注射3 mg/mL 的MN-18，于注射后8 h 和24 h 采集尿樣，經(jīng)過分離和鑒別后尿液中的主要代謝產(chǎn)物是萘甲酰單羥基代謝產(chǎn)物。

采用大鼠體內(nèi)模型進(jìn)行人體內(nèi)代謝研究相對(duì)容易，且成本低廉、取材方便，還可以提供代謝物參考標(biāo)準(zhǔn)，如果大鼠尿液中存在人體的主要代謝物，研究人員就可以用真實(shí)尿樣來分離和鑒別代謝物，提供合成大麻素的代謝標(biāo)志物。嚙齒類動(dòng)物模型的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)可以觀察到動(dòng)物的行為特征和生理變化，檢測(cè)到合成大麻素的毒性，但在代謝方面也存在物種差異性。

3.2.2 斑馬魚模型

20 世紀(jì)80 年代，STREISINGER 等[75]首次將斑馬魚作為動(dòng)物模型應(yīng)用到遺傳學(xué)研究中，此后斑馬魚被廣泛用于藥物的篩選和毒性研究。斑馬魚是一種生活在淡水中的小型硬骨魚，具有易于飼養(yǎng)、發(fā)育快速、性成熟期短、體積小、養(yǎng)殖成本低、繁殖率高等優(yōu)點(diǎn)，主要含有Ⅰ相代謝酶CYP450 和Ⅱ相代謝酶尿苷二磷酸葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶等，目前主要用于體內(nèi)藥效、毒性和安全性的評(píng)價(jià)。也有研究[76-77]評(píng)估了不同生長階段斑馬魚幼體產(chǎn)生相應(yīng)代謝物的能力，成年斑馬魚體內(nèi)的代謝與人體相似。

YUE 等[49]采用斑馬魚模型模擬了合成大麻素3，3-二甲基-2-[1-（4-氟丁基）吲哚-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（4F-MDMB-BICA）的代謝情況，將斑馬魚置于2.5 μg/mL 的4F-MDMB-BICA 水箱中浸泡24 h，結(jié)合LC-HRMS 對(duì)其代謝物進(jìn)行鑒定和結(jié)構(gòu)表征，共得到14種Ⅰ相代謝產(chǎn)物和4種Ⅱ相代謝產(chǎn)物，主要的代謝途徑包括N-脫烷基化、N-脫烷基后羥基化、酰胺水解、氧化脫氟、羧酸化、羥基化、酯水解、脫氫、葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)和硫酸化反應(yīng)，其中酯水解的代謝產(chǎn)物是斑馬魚中含量最豐富的代謝物，可以用于監(jiān)測(cè)實(shí)際案例中真實(shí)頭發(fā)樣本中4F-MDMB-BICA 的使用情況。XU 等[50]采用斑馬魚模型和人肝微粒體模型系統(tǒng)研究了AMB-FUBINACA 的代謝特征，發(fā)現(xiàn)人肝微粒體中產(chǎn)生的17種代謝產(chǎn)物中有16種都在斑馬魚模型中被鑒別出來，主要的代謝途徑包括酯水解、甲基化、羥基化、烷基鏈水解和葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)等。

在生物學(xué)上，斑馬魚基因與人類基因有一定的相似性，基因同源性高達(dá)87%，并且早期胚胎發(fā)育與人類極為相似，是一種可預(yù)測(cè)代謝物的脊椎動(dòng)物模型[78]，其包含的Ⅰ相代謝酶CYP450 和Ⅱ相代謝酶尿苷二磷酸葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶和磺基轉(zhuǎn)移酶對(duì)于研究合成大麻素在生物檢材中的代謝情況至關(guān)重要，但目前在傳統(tǒng)法醫(yī)和臨床實(shí)驗(yàn)室采用斑馬魚模型進(jìn)行研究的較少，而且藥物代謝研究通常需要養(yǎng)殖斑馬魚數(shù)天之后才能采集養(yǎng)殖池中的樣本。另外，斑馬魚和人的代謝之間存在種屬差異，進(jìn)一步限制了該模型的廣泛應(yīng)用。

3.2.3 真菌秀麗線蟲模型

真菌秀麗線蟲模型也是一種研究合成大麻素代謝物的新方法[79-80]，具有Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶。一份關(guān)于真菌秀麗線蟲代謝模型的研究報(bào)告[79]表明，該模型和人體在藥物代謝方面具有高度相似性，主要的代謝途徑包括羥基化、羧酸化、生成二氫二醇、氧化脫氟、N-脫烷基化、葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)、硫酸化等反應(yīng)。

WATANABE等[51-52，81-82]利用真菌秀麗線蟲模型在代謝方面做了很多研究，并且對(duì)該孵育系統(tǒng)和人體內(nèi)產(chǎn)生代謝物的相似性進(jìn)行了評(píng)估。在對(duì)真菌秀麗線蟲和人體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)其代謝途徑有相似之處，但又存在一定的差異。如JWH-018 在合成大麻素吸食者尿液中的兩種主要代謝產(chǎn)物分別是N-（4’-羥基戊基）-JWH-018 和N-戊酸-JWH-018，而在真菌秀麗線蟲模型中N-（4’-羥基戊基）-JWH-018 是主要的代謝產(chǎn)物，而N-戊酸-JWH-018 是次要代謝產(chǎn)物[52]；AM-2201 在人體內(nèi)產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物是6’-羥基-吲哚-AM-2201 和N-（4’-羥基戊基）-AM-2201。雖然在真菌秀麗線蟲模型中也檢出了這些代謝產(chǎn)物，但信號(hào)相對(duì)較低，可能是由于缺乏氧化脫氟酶或其活性太低導(dǎo)致，人肝微粒體模型中同樣缺乏氧化脫氟酶。通過該模型主要得到的是Ⅰ相代謝產(chǎn)物，而Ⅱ相代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)往往有限，但可以作為一個(gè)補(bǔ)充模型研究人體的合成大麻素代謝，對(duì)代謝情況進(jìn)行表征。

真菌秀麗線蟲模型為藥物代謝研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室提供了一種高通量、簡(jiǎn)便快捷、成本低的用于預(yù)測(cè)合成大麻素代謝途徑的體內(nèi)代謝模型，對(duì)養(yǎng)殖人員的專業(yè)程度要求低，且相關(guān)質(zhì)譜碎片信息豐富，有利于對(duì)代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[83]，是生產(chǎn)和分離代謝產(chǎn)物的有效模型。但在難以形成代謝參考標(biāo)準(zhǔn)的情況下，研究人員僅利用高分辨質(zhì)譜的數(shù)據(jù)可能無法判斷羥基在吲哚或吲唑上的具體位置。在培育孵化樣本之前，該真菌模型中的藥物代謝研究需要花費(fèi)較長時(shí)間，而且大多數(shù)法醫(yī)和臨床實(shí)驗(yàn)室沒有配備真菌秀麗線蟲模型平臺(tái)并且缺乏相關(guān)培育經(jīng)驗(yàn)。盡管該模型中存在一些和人體相似的CYP450 酶，但在代謝方面還是存在一定的差異，這在一定程度上限制了真菌秀麗線蟲模型的廣泛應(yīng)用。

綜上所述，體內(nèi)外代謝模型雖然可以模擬合成大麻素在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程，系統(tǒng)反映合成大麻素在生物體內(nèi)的代謝反應(yīng)，但由于和人存在物種差異性，涉及的代謝相關(guān)酶具有差異，其應(yīng)用具有一定的局限性。目前最常用和最成熟的體外孵育模型是人肝細(xì)胞和人肝微粒體模型，其具有高度的人體相關(guān)性，可以得到豐富的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)，人肝細(xì)胞模型相比于人肝微粒體模型可以系統(tǒng)反映化合物在人體肝內(nèi)的代謝情況，而合成大麻素在人肝微粒體模型中的生物轉(zhuǎn)化率比人體內(nèi)更高，也比原生肝細(xì)胞高。代謝軟件獲得的假陽性結(jié)果較多，需要相關(guān)研究人員具有一定的代謝理論知識(shí)和相關(guān)代謝經(jīng)驗(yàn)，可結(jié)合代謝模型的各自特點(diǎn)完善合成大麻素在人體內(nèi)代謝的指紋圖譜。而人肝微粒體模型獲取代謝數(shù)據(jù)簡(jiǎn)便快捷、成本低，已成為預(yù)測(cè)新型合成大麻素在人體內(nèi)代謝途徑的常見模型。

4 代謝物鑒定方法

4.1 氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spec?trometry，GC-MS）是鑒定合成大麻素常用的方法，常將氦氣作為載氣，采用程序升溫的方式將化合物進(jìn)行分離。其中氣相色譜-高分辨質(zhì)譜能夠測(cè)定目標(biāo)物質(zhì)的精確分子量，提供化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，對(duì)提取物中未知以及已知結(jié)構(gòu)的化合物及其相關(guān)代謝物進(jìn)行定性和定量分析。

GRIGORYEV 等[53]采用GC-MS 對(duì)金剛烷甲?；胚犷惡铣纱舐樗谹B-001 進(jìn)行了代謝位點(diǎn)和代謝途徑的分析，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了甲基化和三甲基硅烷化的衍生化處理，在尿液中初步鑒定出7 種代謝物，未檢出母體化合物，但綜合兩個(gè)單羥基代謝產(chǎn)物和兩個(gè)雙羥基代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)可以鑒別AB-001。SOBOLEVSKY 等[54]通過GC-MS 對(duì)金剛烷甲?；胚犷惡铣纱舐樗豊-（1-金剛烷基）-1-戊基吲哚-3-甲酰胺（APICA）在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了表征，結(jié)果表明，對(duì)于APICA 濫用檢測(cè)的首選化合物是雙羥基化和三羥基化的代謝產(chǎn)物。

4.2 LC-HRMS

合成大麻素類新精神活性物質(zhì)及其相關(guān)代謝物大部分都是通過LC-HRMS 進(jìn)行鑒別的，該技術(shù)同時(shí)結(jié)合了液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性。最常用的色譜柱是C18或C8柱，流動(dòng)相的水相為甲酸或甲酸鹽溶液，有機(jī)相為甲醇或乙腈，采用梯度洗脫程序。目前液相色譜法采用的分析柱內(nèi)徑一般為2～5 mm，內(nèi)部填料粒徑小于5 μm，相比于GCMS的樣品制備相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要衍生化處理，靈敏度更高，更加穩(wěn)定，分析范圍更廣。高分辨質(zhì)譜是目前最常用的工具，已成為表征不同生物基質(zhì)中小分子、藥物、代謝物結(jié)構(gòu)的首選方法。如四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和軌道離子阱質(zhì)譜儀是分析代謝物結(jié)構(gòu)的首選儀器，可以快速獲得高靈敏度的全掃描質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖，有助于研究人員推測(cè)化合物及其相關(guān)代謝物的質(zhì)譜裂解途徑，從而確認(rèn)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

ERRATICO 等[55]采用LC-HRMS 對(duì)N-（1-氨甲?；?2-甲基丙基）-1-（環(huán)己基甲基）吲唑-3-甲酰胺（AB-CHMINACA）及其代謝物進(jìn)行了分析鑒定，在體外模型人肝微粒體中共得到了26 種代謝產(chǎn)物，其中大部分也存在于AB-CHMINACA 吸食者的尿液中，這些代謝產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)可以通過高分辨質(zhì)譜進(jìn)行鑒別。CASTANETO 等[42]通過LC-HRMS 分析了人肝細(xì)胞模型中AB-FUBINACA及其代謝物，共鑒定出11種代謝產(chǎn)物（2 種葡萄糖醛酸結(jié)合物），在真實(shí)尿樣中進(jìn)行驗(yàn)證，共鑒定出10 種代謝產(chǎn)物，主要的代謝途徑是末端酰胺水解、?；咸烟侨┧峄桶毖趸⊥椴糠值牧u基化。M?LLER 等[56]開發(fā)了一種基于酶水解、液液萃取和液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析的常規(guī)篩選方法，并將該方法應(yīng)用于約7 500份尿樣的檢測(cè)，證明該方法能夠鑒別人尿液中的JWH-018及其代謝物。

LC-HRMS 可以準(zhǔn)確檢測(cè)離子峰的質(zhì)荷比，是質(zhì)譜檢測(cè)的目標(biāo)，也是質(zhì)譜定性的關(guān)鍵，其可以有效鑒別出合成大麻素及其相關(guān)的碎片離子，從而實(shí)現(xiàn)代謝物的鑒定。同時(shí)，基于LC-HRMS 的非靶向篩選方法為研究人員提供了一種可追溯的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存方式，是目前代謝物鑒別中最常用的方法。

5 合成大麻素類物質(zhì)的代謝規(guī)律

從合成大麻素的結(jié)構(gòu)中可見，新型合成大麻素結(jié)構(gòu)修飾的主要趨勢(shì)是戊基吲哚或吲唑環(huán)的戊基末端氟原子-氫原子置換，這大大提高了化合物的生物活性[79]。WOHLFARTH 等[39]認(rèn)為這些合成大麻素的代謝規(guī)律是相似的，就羥基化的代謝反應(yīng)來看，非氟取代的合成大麻素優(yōu)先在戊基側(cè)鏈的末端和4’位發(fā)生羥基化，而5-氟類似物在側(cè)鏈上的主要代謝反應(yīng)是脫氟氧化、進(jìn)一步羧酸化。然而，由于合成大麻素結(jié)構(gòu)的不斷修飾，這種代謝途徑不一定會(huì)發(fā)生?；谏鲜龃x模型的相關(guān)代謝數(shù)據(jù)，歸納出合成大麻素的代謝規(guī)律：

（1）羰基鍵。含有羰基的合成大麻素如圖1A 所示，發(fā)生的主要代謝途徑是戊基側(cè)鏈末端和4’位的羥基化，并進(jìn)一步羧酸化和羰基化，這些生物轉(zhuǎn)化也適用于含有脂肪族側(cè)鏈的化合物。而含有氟戊基側(cè)鏈的合成大麻素如圖1B 所示，主要代謝途徑是氧化脫氟、進(jìn)一步羧酸化，這些代謝產(chǎn)物與相應(yīng)的含有戊基側(cè)鏈合成大麻素的代謝產(chǎn)物相同，其中含氟的單羥基化代謝產(chǎn)物（主要是吲哚環(huán)或吲唑環(huán)或4’位）可考慮作為代謝標(biāo)志物。

（2）酯鍵。含有酯鍵的合成大麻素如圖1C 所示，發(fā)生的主要代謝反應(yīng)是酯水解，生成的羧酸化代謝產(chǎn)物豐度相對(duì)較高，戊基側(cè)鏈或氟戊基側(cè)鏈會(huì)進(jìn)一步發(fā)生氧化反應(yīng)，但氧化程度比有羰基鍵連接時(shí)低。對(duì)于含氟戊基吲哚環(huán)的合成大麻素如圖1D 所示，主要的代謝反應(yīng)也是酯水解，在側(cè)鏈上幾乎不會(huì)發(fā)生氧化脫氟反應(yīng)。

（3）酰胺鍵。含戊基側(cè)鏈的合成大麻素如圖1E所示，主要的代謝途徑是末端的酰胺水解為羧酸，并進(jìn)一步在戊基側(cè)鏈上羰基化。含氟戊基側(cè)鏈的合成大麻素如圖1F 所示，主要的代謝途徑是末端酰胺水解為羧酸和氟戊基側(cè)鏈的脫氟氧化，進(jìn)一步氧化為羧酸。

圖1 合成大麻素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和代謝模式Fig.1 Structural characteristics and metabolic patterns of synthetic cannabinoids

6 結(jié)論

我國已經(jīng)對(duì)合成大麻素進(jìn)行了整類列管，由于新出現(xiàn)的合成大麻素人體數(shù)據(jù)不易及時(shí)獲得，因此有必要通過代謝模型對(duì)合成大麻素及其相關(guān)代謝物進(jìn)行系統(tǒng)研究。本文基于合成大麻素的結(jié)構(gòu)和分類，代謝軟件預(yù)測(cè)的代謝物數(shù)據(jù)，并結(jié)合體內(nèi)外代謝模型、代謝物鑒定方法，總結(jié)出合成大麻素的相關(guān)代謝規(guī)律，以期為合成大麻素類新精神活性物質(zhì)的攝毒鑒定及毒理學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支撐。