尿源性干細胞外泌體對高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

莊靖銘 高 鵬 尹 爍 吳復(fù)躍 侯劍剛△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院泌尿外科 上海 200040；2上海睿泰再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用研究院 上海 200040）

糖尿病是一種發(fā)病率很高的嚴重的代謝疾病，影響全球超過3 億人，預(yù)計2023年的患病人數(shù)將達到5.92 億[1］。它是由復(fù)雜病因引起的以高血糖為特征的代謝綜合征[2］。 2 型糖尿病占糖尿病的90%，其發(fā)病率和死亡率遠遠高于1 型糖尿病。心臟、腦、腎臟和視網(wǎng)膜的血管并發(fā)癥是2 型糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥。且患者血管疾病預(yù)后與其能否維持正常血糖水平之間存在明顯關(guān)聯(lián)[3］。與血管平滑肌細胞不同，內(nèi)皮細胞不能調(diào)節(jié)內(nèi)在葡萄糖水平，可能導(dǎo)致葡萄糖及其衍生物的積累，引起代謝紊亂。因此內(nèi)皮功能障礙是高血糖的直接結(jié)果，也是2 型糖尿病血管并發(fā)癥的關(guān)鍵步驟[4］。本課題組在研究男性勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）時發(fā)現(xiàn)，與一般人群相比，糖尿病患者的ED 發(fā)病較早，患病率較高，是非糖尿病患者的3 倍，綜合患病率＞35%，且年齡越大，嚴重程度越高[5］。盡管發(fā)病率很高，但與其他糖尿病并發(fā)癥相比，它往往被忽視。從機制上講，性沖動信號通過副交感神經(jīng)傳遞，引起內(nèi)皮和神經(jīng)末梢釋放一氧化氮（nitric oxide，NO），推動陰莖海綿體平滑肌松弛，海綿體血流量增多，從而導(dǎo)致勃起。糖尿病患者體內(nèi)長期高糖環(huán)境對海綿體內(nèi)皮細胞有較大的損傷作用，NO 產(chǎn)量急劇減少，出現(xiàn)勃起障礙[6］。因此，內(nèi)皮細胞是防止ED 在內(nèi)多種糖尿病血管并發(fā)癥的潛在靶標，也是我們研究的重點。

尿源性干細胞（urine-derived stem cells，USCs）是從尿液中分離出來的細胞亞群，與間充質(zhì)干細胞具有類似的表面標記物，包括CD44、CD73、CD90 和CD105等。這些細胞具有干細胞的生物學(xué)特性，并且能夠在特殊的誘導(dǎo)培養(yǎng)中分化為骨骼、肌肉和脂肪等多種細胞[7］。與其他類型的干細胞相比，USC 的使用具有可連續(xù)性，用非侵入性、簡單且低成本的方法即可獲得[8］。已有研究報道，USC 來源的外泌體（USC-Exo）可預(yù)防糖尿病性腎病，改善糖尿病性ED[8-9］，還可以在后肢缺血中促進血管生成和肌肉再生[10］。國內(nèi)外學(xué)者普遍使用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）體外研究人內(nèi)皮細胞功能。本課題組于新鮮臍帶中提取HUVEC，并將其暴露于高濃度葡萄糖環(huán)境中，以模擬糖尿病患者體內(nèi)的內(nèi)皮損傷，多方面驗證USC-Exo在內(nèi)皮細胞損傷過程中的作用。

材料和方法

主要材料本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會批準[2021 臨審第（009）號］。臍帶取自當(dāng)日剖宮產(chǎn)健康嬰兒的新鮮臍帶（來源于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院婦產(chǎn)科），產(chǎn)婦及家屬對于實驗研究均知情同意，并簽署知情同意書。尿液由3 名平均年齡為25歲的男性志愿者提供。其他材料包括：EGM-2 培養(yǎng)基、REGM 培養(yǎng)基（瑞士LONZA 公司）；PBS、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（美國GIBCO 公司）；Ⅰ型膠原酶（美國Sigma 公司）；鼠抗 人CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD133、CD146、HLA-DR 多克隆流式抗體（美國Biolegend 公司）；鼠抗人vWF 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；山羊抗鼠二抗AF488（美國Thermo Fisher 公司）；含DAPI 抗熒光淬滅封片液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；超濾管（美國Millipore 公司）；cell counting kit-8 試劑盒（CCK-8；日本同仁公司）；Matrigel 基質(zhì)膠（美國Corning 公司）；紅色熒光標記的人源乙?；兔芏戎鞍譡human DiI-acetylated low density lipoprotein，Human DiIAc-LDL；翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；TRIzol試劑（美國Thermo Fisher公司）。

細胞培養(yǎng)HUVEC 的分離和培養(yǎng)過程參照文獻[11］。取符合要求的臍帶，剖腹產(chǎn)4 h 內(nèi)運送至實驗室進行操作，全程保證無菌。使用1×PBS 從一端沖洗臍靜脈，直到另一端流出的緩沖液透明或略帶粉紅色以確保無紅細胞。用止血鉗夾閉臍靜脈一端，從另一端注射0.2% 的Ⅰ型膠原酶溶液，灌滿后立即止血鉗夾閉。放入37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱消化10 min。取出并打開止血鉗，用40 mL 1×PBS 沖洗靜脈，收集細胞，加入5 mL FBS 終止消化。收集細胞于50 mL 離心管中，室溫750×g離心10 min 棄上清，加EGM-2 培養(yǎng)基重懸細胞沉淀于6孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱，每2 天換液一次。USC 的分離和培養(yǎng)過程參考文獻[12］。每次至少收集志愿者中段尿200 mL，分裝后室溫400×g離心10 min。棄上清，保留1～2 mL液體。收集各管沉淀，加入PBS 定容至40 mL。再次以相同條件離心10 min，保留約300 μL 沉淀，使用12 mL REGM 培養(yǎng)基重懸細胞。接種至明膠預(yù)先包被30 min 的6 孔板。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱，每2.5 天換液一次。

流式鑒定細胞表面標記物取第3 代HUVEC和USC，0.25% 胰蛋白酶消化后制成細胞懸液。400×g離心5 min，PBS 清洗后計數(shù)。調(diào)整細胞量為5×106/管，以100 μL PBS 溶解，并加入流式細胞抗體，混勻后室溫避光孵育30 min。PBS 清洗2 遍后使用300 μL PBS 溶解上機檢測分析。

免疫熒光鑒定胞內(nèi)標記物將第3 代HUVEC鋪于96 孔板，PBS 清洗3 次后用4% 多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗。使用0.5% Triton X-100 室溫破膜20 min，PBS 清洗后正常山羊血清室溫封閉30 min。加入5% BSA-PBS 配制的一抗4 ℃孵育過夜。第2 天PBS 清洗后加入熒光標記的二抗室溫避光孵育1 h。PBS 清洗3 次后加入適量抗熒光淬滅封片液（含DAPI）孵育10 min。置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

USC‐Exo 分離純化與鑒定取處于對數(shù)生長期的第2～5 代USC，細胞生長匯合至80%～90% 后，用去除外泌體的FBS 配置完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集上清液。在4 ℃下以2500×g離心20 min，棄沉淀。使用0.22 μm 滅菌過濾器過濾，以去除殘留的細胞和細胞碎片。 將上清液轉(zhuǎn)移到超濾管中，在4 ℃下以100000×g離心70 min，棄上清液。 用PBS 重懸沉淀USC-Exo，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

透射電子顯微鏡觀察USC‐Exo 形態(tài)將USCExo 固定于2.5% 戊二醛-多聚甲醛混合固定液中，取10 μL 滴于透射電鏡專用覆膜銅網(wǎng)上，靜置2 min后用濾紙吸去液體。 滴加2% 醋酸雙氧鈾染色5 min，去除液體，晾干。置于透射電子顯微鏡觀察。USC-Exo 粒徑分布分析：納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)QNano 平臺檢測USC-Exo 顆粒直徑與密度。

增殖實驗每孔取相同起始量的HUVEC（密度為3×103/孔）鋪于96 孔板，培養(yǎng)液為100 μL，在37 ℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)2 h 后細胞貼壁。細胞貼壁后棄去初始培養(yǎng)基，換為各組對應(yīng)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。根據(jù)參考文獻[13］以及我們前期篩選實驗的結(jié)果，將細胞分為6 組培養(yǎng)：正常濃度葡萄糖（5.5 mmol/L）、正常濃度葡萄糖+USC-Exo（1×108、1×109particles/mL）、高濃度葡萄糖（33 mmol/L）和高濃度葡萄糖+ USC-Exo（1×108、1×109particles/mL）。每組5 個孔，于37 ℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液孵育2 h 后，使用多功能酶標儀測定各孔450 nm 波長下的吸光度。

劃痕遷移實驗為了研究USC-Exo 對HUVEC在高葡萄糖濃度下細胞遷移的作用，參考文獻進行了體外劃痕實驗[14］。將1×105個細胞接種至24 孔板，等待細胞貼壁24 h。按各組條件處理48 h 后，使用無菌的200 μL 移液槍頭尖端由上至下刮去細胞單層，并用PBS 洗滌以除去細胞碎片。在刮擦后0、4、6 h 使用倒置光學(xué)顯微鏡進行拍攝。 并使用Image J 軟件分析遷移面積。遷移速率計算如下：遷移區(qū)域（%）=（A0-AT）/A0×100%，其中A0表示初始傷口的面積，AT表示在該時間點傷口的剩余面積。

成管實驗用正常濃度葡萄糖、高濃度葡萄糖和USC-Exo 在6 孔板中進行分組預(yù)處理HUVEC 48 h。將Matrigel 基質(zhì)膠按每孔200 μL 加入24 孔板中，使用預(yù)冷的槍頭冰上操作。放入37 ℃培養(yǎng)箱包被30 min。將來自不同處理組的細胞消化后計數(shù)，每孔按1×105個溶于500 μL 培養(yǎng)基后，覆蓋到24 孔板的Matrigel 上。37 ℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)16 h后，使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察管狀結(jié)構(gòu)，拍攝照片。

HUVEC 攝取Dil‐Ac‐LDL 的功能 分析為了檢測內(nèi)皮細胞的功能，使用紅色熒光標記的人源乙?；兔芏戎鞍祝℉uman DiI-Ac-LDL）來測量其對低密度脂蛋白（LDL）的攝取。將3×103個細胞鋪在96 孔板中，每孔培養(yǎng)基100 μL，37 ℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)24 h。將Human DiI-Ac-LDL 用培養(yǎng)基稀釋至30 μg/mL。 去除初始培養(yǎng)基，將細胞與含Dil-Ac-LDL 的培養(yǎng)基在37 ℃孵育4 h。 除去Dil-Ac-LDL 溶液，PBS 洗滌細胞，在預(yù)冷的4% 多聚甲醛溶液中固定20 min。加入適量抗熒光淬滅封片液（含DAPI）孵育10 min。使用熒光顯微鏡觀察并進行拍攝。

qRT‐PCR 檢測使用Trizol 試劑從各組細胞中分離總RNA，promega GoScript RT System 試劑盒將RNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 為cDNA。 使 用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 系 統(tǒng) 在20 μL 反應(yīng)體系中進行qRT-PCR：GoScript qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物每條0.4 μL（10 μmol/L），cDNA 模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃反應(yīng)10 min 預(yù)變性，95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)1 min，共40 個循環(huán)。引物序列見表1。采用ΔΔCt 法檢測各組細胞中基因的表達水平，每組3 個復(fù)孔，擴增后目的基因相對表達量=2-（目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）。

表1 qRT‐PCR 的基因引物序列Tab 1 Prime sequences in qRT‐PCR

統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA 方法進行檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

HUVEC 和USC 細胞的形態(tài)學(xué)觀察與鑒定HUVEC 鋪板后第2 天即可出現(xiàn)貼壁細胞團，匯合的內(nèi)皮細胞出現(xiàn)接觸抑制后，顯微鏡下呈現(xiàn)“鋪路石樣”外觀（圖1A）。選取P2～P5 代進行實驗，傳代后細胞形態(tài)無較大改變。從尿液樣品中分離出細胞培養(yǎng)3～5 天，會出現(xiàn)細長的小型細胞團，定時半換液，接觸抑制后細胞呈現(xiàn)梭形外觀（圖1B）。HUVEC 流式檢測顯示99.1%的測試細胞具有CD31表面標記物（圖1C），免疫熒光染色結(jié)果顯示胞內(nèi)標記物vWF 呈陽性（圖1D），該結(jié)果證實本次實驗提取的HUVEC 純度高，符合實驗要求。USC 流式檢測結(jié)果如下，經(jīng)檢測USC 表達了間充質(zhì)干細胞的常見表面標記物，包括CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133，陽性率較高。造血干細胞標記物CD45 表達低。HLA-DR 表達低代表USC的低免疫原性。CD146腎周細胞標記物表達高。符合USC 目前主要的鑒定標準。

圖1 HUVEC 和USC 細胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定Fig 1 Observation and identification of HUVEC and USC

USC‐Exo 的觀察與鑒定通過透射電子顯微鏡，觀察負染的USC-Exo 樣本形態(tài)。 結(jié)果顯示，USC-Exo 是直徑約100 nm 的球形囊泡，大小不均，有完整的膜結(jié)構(gòu)（圖2A）。進一步對分離的USCExo 進行納米顆粒蹤跟分析（圖2B），顯示USC-Exo顆粒的粒徑為（66.66±11.70）nm，符合外泌體的標準。

圖2 USC‐Exo 的電鏡圖片以及粒徑報告Fig 2 Electron micrograph and particle size report of USC‐Exo

CCK‐8測定各組細胞活力用正常（5.5 mmol/L）或高濃度（33 mmol/L）的葡萄糖處理HUVEC，與不同濃度（1×108或1×109個/mL）的USC-Exo 組合。孵育48 h 后測量各組OD 值。與對照組相比，高葡萄糖處理的HUVEC 的OD 值顯著降低（圖3）。此外，1×108個/mL USC-Exo 對正常的HUVEC 沒有顯著的影響，而1×109個/mL USC-Exo 對正常細胞則有一定增殖作用。此外，USC-Exo 顯著逆轉(zhuǎn)了高葡萄糖對HUVEC 的有害影響，且1×109個/mL 優(yōu)于1×108個/mL。因此，在后續(xù)實驗選擇濃度為1×109個/mL的USC-Exo 作為實驗組。

圖3 CCK‐8 法檢測各組細胞處理后吸光度Fig 3 Cell viability of each group detected by CCK‐8

劃痕實驗觀察各組細胞的遷移功能為了揭示USC-Exo 對HUVEC 遷移能力的影響，我們進行了體外劃痕試驗（圖4A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對比正常葡萄糖濃度的培養(yǎng)環(huán)境（5.5 mmol/L），高濃度的葡萄糖（33 mmol/L）對內(nèi)皮細胞遷移有抑制作用，且短時間（4 h、6 h）即可出現(xiàn)差異（圖4B、4C）。 而 在33 mmol/L 葡萄糖的條件下，同時加入USC-Exo 則可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，促進內(nèi)皮細胞遷移。

圖4 HUVEC 不同狀態(tài)下不同時間點的遷移率Fig 4 The migration rate of HUVEC at different time points in different states

成血管實驗檢測各組細胞功能孵育16 h 后，對照組管腔均勻，血管連接節(jié)點多，分支多且長；相比之下，高糖處理組血管形成少，管腔較薄，大且不規(guī)則，有較多未連接區(qū)域，成血管能力受損；高糖處理同時加入USC-Exo 則逆轉(zhuǎn)了高糖誘導(dǎo)的這種損傷，形成了較多完整且均勻的管腔，在連接點和分支數(shù)上也恢復(fù)到了正常水平（圖5）。

圖5 HUVEC 不同狀態(tài)下的成血管功能Fig 5 Capillary‐like structure formation in HUVECs under different conditions

檢測LDL 攝取確定內(nèi)皮細胞功能LDL 攝取是內(nèi)皮細胞功能的另一個重要表現(xiàn)。通過不同預(yù)處理后的各組細胞與Human DiI-Ac-LDL 共孵育，應(yīng)用免疫熒光法檢測不同組攝取LDL 的情況。所得結(jié)果證實了HUVEC 在正常濃度葡萄糖中對LDL 的吸收能力，并在高糖預(yù)處理后吸收能力顯著降低。高糖預(yù)處理時同時加入USC-Exo 則可以恢復(fù)一定的攝取功能，稍弱于對照組（圖6）。

圖6 HUVEC 不同狀態(tài)下的攝取LDL 的功能Fig 6 LDL uptake analysis by Dil‐AcLDL assay under different conditions

細胞凋亡和氧化相關(guān)mRNA 的表達水平qRT-PCR 結(jié)果顯示，與正常對照組相比，33 mmol/L高糖處理后HUVEC 促凋亡因子BAX 表達上調(diào)，抗凋亡因子Bcl-2、抗氧化因子SOD2 表達下降。而在高糖處理同時添加USC-Exo，可以使BAX 表達下調(diào)，Bcl-2、SOD2 上調(diào)（圖7）。表明USC-Exo 具有改善高糖誘導(dǎo)細胞氧化，緩解凋亡的作用。

圖7 qRT‐PCR 分析各組HUVEC 處理后相關(guān)基因的mRNA 表達Fig 7 qRT‐PCR analysis of mRNA of related genes in each group after treatment

討論

內(nèi)皮功能障礙的主要特征為氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。高糖毒性還會導(dǎo)致細胞活力降低并通過多個信號通路促進內(nèi)皮細胞的衰老，其潛在機制需要進一步研究。利用干細胞及其相關(guān)技術(shù)治療糖尿病是近年來大有前景的新方法。 已有多種干細胞[15-17］可在體內(nèi)或體外生成胰島素，或分化為胰島素分泌細胞，它們?yōu)楦我葝u素缺乏的糖尿病點燃了希望。而2 型糖尿病患者面臨長期難以逆轉(zhuǎn)的胰島素抵抗，緩解其血管并發(fā)癥完全靠再生療法可能作用有限。干細胞在糖尿病血管損傷的改善以及各類并發(fā)癥的治療上均有大量文獻報道。涉及到的干細胞包括多能干細胞[18］、間充質(zhì)干細胞[19］、脂肪干細胞[20］以及尿源性干細胞等。對各類并發(fā)癥均有緩解或改善作用，包括糖尿病腎病[20］、糖尿病傷口遷延不愈[21］、糖尿病引起的腦出血[22］等。細胞間的通訊是各種生理和病理過程所必需的。已有研究[23］證實，干細胞的許多功能是通過外泌體傳遞信息來達成的。外泌體是一種具有包膜的小囊泡，直徑為30～150 nm，可以直接轉(zhuǎn)移來源于供體細胞，作用于受體細胞的各種生物活性分子，包括mRNA，microRNA 和蛋白質(zhì)等。在多種疾病中的發(fā)生發(fā)展以及治療預(yù)防中，外泌體具有重要作用，包括促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[24］、減少心肌缺血-再灌注損傷[25］、調(diào)節(jié)巨噬細胞的表型以促進傷口愈合[26］等。已有研究表明，來自人臍帶間充質(zhì)干細胞的外泌體[27］和來自脂肪的間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基[28］具有保護內(nèi)皮細胞或足細胞免受高糖損害的潛力，這可能與外泌體內(nèi)含的相關(guān)生長因子或調(diào)控RNA 有關(guān)。

我們團隊前期對干細胞及其外泌體在糖尿病性ED 中的應(yīng)用進行了總結(jié)[29］，探討認為糖尿病性ED 治療的關(guān)鍵在于恢復(fù)海綿體內(nèi)皮細胞的功能，因此選用血管研究常用的HUVEC 作為造模材料。UCS 來源于泌尿系統(tǒng)[30］，我們在鑒定過程中也發(fā)現(xiàn)其同時具有間充質(zhì)干細胞和腎源細胞的細胞標志物，因此我們認為其修復(fù)泌尿系統(tǒng)的內(nèi)皮損傷可能更具有優(yōu)勢。在本研究中，我們成功地從人尿液中分離出了USC 并提取純化了其外泌體USC-Exo。除了證明USC-Exo 可以促進HUVEC 的增殖，改善高糖對細胞的增殖抑制之外，還可以增加體外毛細血管網(wǎng)的形成，逆轉(zhuǎn)高糖下內(nèi)皮細胞遷移減慢的趨勢。內(nèi)皮細胞遷移和體外成管的能力在各器官血管新生、傷口愈合等過程中起著重要的作用。這些結(jié)果表明USC-Exo 是血管生成的正向調(diào)節(jié)因子。脂蛋白脂肪酶的活性降低是糖尿病最嚴重的內(nèi)皮損傷之一，已有研究表明糖尿病患者的胰島素抵抗與它的失活高度相關(guān)[31］。 通過實驗我們證明了USC-Exo 通過增加內(nèi)皮細胞內(nèi)LDL 的熒光攝取，在高糖條件下對脂蛋白脂肪酶的激活起到了明顯的促進作用。另外從基因表達的層面，USC-Exo 下調(diào)了高糖影響下的促凋亡基因BAX，上調(diào)了抗氧化基因SOD2 的表達。 從這些結(jié)果可以推測USCExo 具有改善糖尿病血管氧化應(yīng)激的效果。

已有研究表明，外泌體中含有的microRNA 是其具有促進血管增殖的起效物質(zhì)，例如間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體通過miR-125a 降低血管生成抑制劑4（DLL4）促進內(nèi)皮細胞血管生成[32］；胚胎干細胞分泌的外泌體通過miR-200a 下調(diào)Keap1，激活Nrf2恢復(fù)衰老相關(guān)的血管生成功能障礙[13］等。 因此USC-Exo 在本研究中的血管修復(fù)功能是否也是通過其內(nèi)富含的某種microRNA 所完成的，后續(xù)又影響了下游的哪些調(diào)控因子和通路，都需要進一步的探究。課題組期待能夠以現(xiàn)有數(shù)據(jù)為依據(jù)，通過后續(xù)研究為糖尿病泌尿生殖相關(guān)并發(fā)癥的再生治療提供更多實驗依據(jù)。

作者貢獻聲明莊靖銘 采集樣本，細胞分離純化鑒定，表型與基因?qū)嶒?，?shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，論文撰寫和修訂。高鵬，尹爍 研究構(gòu)思和設(shè)計。吳復(fù)躍，侯劍剛 研究設(shè)計，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析指導(dǎo)，論文撰寫和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。