4種唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的急性毒性及其致毒機理

劉敏，覃禮堂,2,*，莫凌云,2，梁延鵬,3，曾鴻鵠,2

1. 桂林理工大學環(huán)境科學與工程學院，桂林 541004 2. 桂林理工大學，廣西環(huán)境污染控制理論與技術重點實驗室科教結合科技創(chuàng)新基地，桂林 541004 3. 桂林理工大學，廣西環(huán)境污染控制理論與技術重點實驗室，桂林 541004

各類化學污染物一旦排入水體環(huán)境將不可避免地殘留其中，進而引起水環(huán)境的污染[1]。唑類殺菌劑是一類具有抗真菌性質的化學物質，被廣泛用作農業(yè)、畜牧業(yè)和人類真菌病的抗真菌藥物[2-3]。它們化學性質穩(wěn)定，容易在環(huán)境中積累，從而殘留在水體、食物、農作物和土壤中[4-6]。唑類殺菌劑在水體中檢出頻率和檢出濃度較高，特別是三唑醇，檢出濃度達到幾十納克每升[7]，三唑酮在我國九龍江檢出濃度最高達到12 μg·L-1[8]，克霉唑和氯咪巴唑也同時在魚類中檢出[5]。唑類殺菌劑的大量使用不可避免地隨降雨和地表徑流進入水體，從而對水生生物產生威脅[9]，進一步影響人類及其他生物的健康[2]。

考慮到殺菌劑在生活和農業(yè)實踐中的廣泛應用，需要進行更多有關唑類殺菌劑對水生生物潛在毒性的研究，以充分評估其對水環(huán)境的生態(tài)風險[10]。研究表明，三唑醇和三唑酮能夠影響青蛙在水體中的活動，對超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)有不同程度的影響，對青蛙的肝臟組織和甲狀腺激素水平的影響也因性別存在差異[11]。同時，三唑酮對枝角類浮游動物種群表現(xiàn)出明顯的抑制作用[12]，低劑量長期暴露下對水生生物的繁殖能力造成一定的損傷[13]。水蚤(Daphniasimilis)、渦蟲(Dugesiajaponica)和多齒新米蝦(Neocaridinadenticulate)3種水生生物在克霉唑和氯咪巴唑的48 h暴露下，氯咪巴唑對3種實驗物種的急性毒性均>1 mg·L-1，克霉唑對水蚤的毒性最大，48 h-LC50為0.08 mg·L-1[10]。因此，有必要開展唑類殺菌劑對水生生物的生態(tài)毒性研究。

綠藻作為水生生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產者，在水生生態(tài)系統(tǒng)的氧氣生產中起著至關重要的作用[14]。其中，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)是單細胞綠藻，在水體中分布均勻，且繁殖速度快，易于培養(yǎng)，是一種理想的毒理學指示生物[15]。據報道，綠藻在農藥刺激下能夠產生活性氧(ROS)[16]，ROS能通過抑制和干擾與光合過程及相關蛋白質合成等抑制葉綠體代謝，干擾光合裝置的功能，最終影響細胞的生長[13]，同時激活細胞的抗氧化酶如SOD和CAT，以防止自由基在氧化應激下對細胞產生損傷[14]。目前對綠藻的毒性研究大部分是采用標準的96 h綠藻急性微板毒性測試考察單一物質的毒性效應[17]，例如，采用微板毒性實驗分析法系統(tǒng)測定三嗪類農藥對蛋白核小球藻的毒性效應[18]；曾莎莎等[19]在96 h的急性暴露下進行了5種有機磷農藥對蛋白核小球藻的毒性相互作用研究等，但是唑類殺菌劑對綠藻的致毒機理卻鮮有報道。

本文研究了4種唑類殺菌劑(三唑醇、三唑酮、克霉唑和氯咪巴唑)對蛋白核小球藻的急性毒性及其毒性機制。通過評估唑類殺菌劑對蛋白核小球藻生長率的影響，判斷其96 h急性毒性，并結合葉綠素和總蛋白(TP)含量、氧化損傷(ROS和丙二醛(MDA))、抗氧化損傷能力(SOD和CAT)和細胞凋亡相關的生理生化指標，揭示唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的致毒機理，為全面準確評價唑類殺菌劑在環(huán)境中的潛在風險提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 目標污染物及試劑

研究選取4種唑類殺菌劑為目標污染物，三唑醇(CAS No. 55219-65-3)，純度為98.9%；三唑酮(CAS No. 43121-43-3)，純度為97.7%；克霉唑(CAS No. 23593-75-1)，純度為98.0%；氯咪巴唑(CAS No. 38083-17-9)，純度為98.0%。其中，三唑醇購自Dr. Ehrenstorfer GmbH，三唑酮和氯咪巴唑購自CATO Research Chemicals Inc.，克霉唑購自Toronto Research Chemicals。

TP定量試劑盒、CAT試劑盒、SOD試劑盒、微量MDA試劑盒、ROS試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。95%乙醇(分析純)和98%冰醋酸(分析純)購自西隴科學股份有限公司。

1.2 受試生物及藻種培養(yǎng)

受試生物蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)，其編號為[FACHB]-5，使用BG11培養(yǎng)基進行培養(yǎng)[20]。

在無菌的超凈工作臺中將蛋白核小球藻純藻種轉移至裝有100 mL新鮮配制的BG11培養(yǎng)基的250 mL無菌錐形瓶內，封好瓶口，放置在光照培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 ℃，光照條件2 000～3 000 lx，光暗周期12 h∶12 h[21]。每天定時搖動3～4次，并隨機調換位置，每隔2～3 d接種一次，接種時間應在藻類細胞代謝最旺盛時期(上午10:00—11:00左右)，至綠藻基本達到同步生長，取對數生長期的綠藻進行試驗，試驗前并在顯微鏡觀察試驗藻液是否被污染[22]。

1.3 綠藻毒性測試

先將4種目標污染物標準品分別用BG11培養(yǎng)基[20]溶解，配制成高濃度的儲備液，三唑醇、三唑酮、克霉唑和氯咪巴唑的儲備液的濃度分別為6.76E-05、6.81E-05、2.31E-05和2.73E-05 mol·L-1。實驗時將儲備液按照0.5和0.2的稀釋因子逐級稀釋，得到一系列所需濃度的試驗液。在預實驗的基礎上每種目標污染物共設置7個實驗組和1個對照組，每組設置3個平行。其次，在無菌條件下將處于對數生長期、初始密度約為4×105個cell·mL-1的蛋白核小球藻均勻藻液，分裝于250 mL的錐形瓶中，每瓶20 mL藻液。再次，向各錐形瓶中依次添加對應劑量的目標污染物并補培養(yǎng)基至總體積為100 mL。加入目標污染物后，將蛋白核小球藻置于原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每天定時搖動3～4次[22]，連續(xù)培養(yǎng)至96 h。每24 h在681 nm下用紫外可見分光光度計(中國上海元析儀器有限公司，UV-9000S)測定藻液吸光度OD681[16]。并計算不同濃度暴露后的生長抑制率，計算公式如下[23]：

I=1-(ODti-ODt0)/(OD0i-OD00)

(1)

式中：ODti為第i時刻污染物處理組藻液的OD值，OD0i為i時刻空白對照組藻液的OD值。

1.4 濃度-抑制率數據擬合

采用經典的兩參數非線性函數Weibull(式(2))、Logit(式(3))和Hill(式(4))對濃度-抑制率數據進行非線性最小二乘擬合[24]，選擇確定系數(R2)最大或均方根誤差(RMSE)最小者為最優(yōu)擬合函數[25]。式(2)～(4)可以計算出不同濃度下所對應的效應值，同樣可以利用函數的反函數計算出不同效應下所對應的濃度[26]。

E=1/(1+exp(-α-βlog10(c)))

(2)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(3)

E=(α×c)/(β+c)

(4)

式(2)和(3)中α、β是Weibull和Logit的位置與斜率參數，式(4)中α、β是Hill的最大效應和EC50；式(2)、(3)和(4)中E為效應，即污染物對綠藻的生長抑制率，c是單個污染物或混合物的濃度。

1.5 蛋白核小球藻生理生化指標的測定。

1.5.1 TP含量、抗氧化酶活性和MDA含量的測定

蛋白核小球藻暴露96 h后，取30 mL均勻藻液，依次進行冷凍離心洗滌，研磨破碎的步驟獲取粗酶液。將粗酶液作為待測樣品采用考馬斯亮藍法[27]、鉬酸銨法[28]、羥胺法[29]和硫代巴比妥酸(TBA)法[30-31]分別測定并計算TP、CAT、SOD和MDA的含量。根據公式(5)計算抑制率。

I=1-(cti/c0i)

(5)

式中：cti為第i時刻污染物處理組藻液各項生理指標的濃度，c0i為i時刻空白對照組的藻液各項生理指標的濃度。

1.5.2 ROS含量的測定

蛋白核小球藻暴露96 h后取5 mL均勻藻液，依次經過冷凍離心洗滌、藻細胞染色、37 ℃避光孵育、洗滌過濾的步驟獲取待測藻液，用流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，524C CytoFLEX)檢測。上述具體方法參照南京建成生物工程研究所提供的方法以及Knauert和Knauer[32]采用的化學熒光法，并略有改進。根據公式(5)計算其抑制率。

1.5.3 葉綠素含量的測定[33]

蛋白核小球藻暴露96 h后，取30 mL均勻藻液，依次通過冷凍離心、超聲破碎、95%乙醇提取和冷凍離心等步驟后取上清液，用紫外分光光度計(中國上海元析儀器有限公司，UV-9000S)在470、649和665 nm波長下進行測定，計算公式如下：

Chla=13.59×OD665-6.88×OD649

(6)

Chlb=24.96×OD649-7.32×OD665

(7)

類胡蘿卜素= (1000×OD470-2.05×OD665-114.8×OD649)/245

(8)

1.5.4 細胞凋亡的測定

蛋白核小球藻暴露96 h后取5 mL均勻藻液，依次經過冷凍離心、洗滌濃縮、Annexin V-FITC染色、避光孵育和碘化丙啶(PI)染色獲得染色藻液。過濾后用流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，524C CytoFLEX)檢測。以上所述的具體方法參照南京建成生物工程研究所提供的方法。根據式(5)計算細胞凋亡率。

2 結果(Results)

2.1 4種唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的96 h急性毒性

4種唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的96 h急性毒性的濃度-效應數據的線性函數擬合結果列于表1，其濃度-效應曲線繪于圖1。由表1可知，Weibull、Logit或Hill函數能較好地擬合這4種目標污染物對蛋白核小球藻96 h急性毒性的濃度-效應數據，R2均>0.981，RMSE均<0.039。不同污染物對蛋白核小球藻的毒性大小不同，以半數效應濃度的負對數(pEC50)評估毒性大小，4種目標污染物96 h時毒性大小為：氯咪巴唑>克霉唑>三唑醇>三唑酮，其中克霉唑和氯咪巴唑的毒性明顯大于三唑醇和三唑酮。藻類對不同種污染物敏感程度差異很大，造成這種毒性差異的主要原因可能與污染物自身的結構性質有關[34]。

由圖1可知，4種目標污染物對蛋白核小球藻的毒性效應均表現(xiàn)為抑制作用，蛋白核小球藻的生長抑制率隨著污染物濃度的增大而增大。在96 h的暴露下，4種唑類殺菌劑中抑制率最大的為氯咪巴唑。

2.2 唑類殺菌劑對蛋白核小球藻細胞中葉綠素含量的影響

葉綠素作為光合系統(tǒng)的重要組成部分，不僅吸收光能，保證光合作用的穩(wěn)定運行，而且能反映環(huán)境脅迫狀況，較好地反映藻類的生長發(fā)育狀況[35-36]。如圖2所示，蛋白核小球藻在4種唑類殺菌劑暴露96 h后，隨著污染物濃度的升高，葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)含量明顯降低，三者抑制率的變化趨勢與生長抑制率的變化趨勢相似，呈現(xiàn)出良好的正相關(P<0.01)，表明唑類殺菌劑對蛋白核小球藻葉綠素的合成具有濃度依賴毒性。如圖2(b)所示，三唑酮在低濃度下對蛋白核小球藻葉綠素的合成有促進作用，抑制率分別為-9.08%、-9.86%和-8.95%。這可能是蛋白核小球藻在環(huán)境脅迫下做出的一種自我保護的反應。值得注意的是，如圖2(c)和2(d)所示，克霉唑和氯咪巴唑能夠顯著降低藻類的葉綠素含量，但是隨著暴露濃度的增加，對Chla和Chlb的抑制作用均沒有明顯的增加，這與TP含量的變化情況相似。這可能是因為葉綠素在植物體中大多與蛋白質結合在一起，蛋白質受到破壞必定會對葉綠素產生影響，兩者息息相關[16]。

圖1 4種唑類殺菌劑對蛋白核小球藻96 h的 生長抑制率曲線Fig. 1 Growth inhibition of Chlorella pyrenoidosa for 96 h exposure to four azole fungicides

表1 4種唑類殺菌劑對蛋白核小球藻96 h的濃度-效應曲線擬合參數Table 1 Fitting parameters of concentration-effect curve of four single azole fungicides on Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

圖2 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和類胡蘿卜素(Car)含量的影響Fig. 2 Effects of four azole fungicides on the chlorophyll a (Chl a)、chlorophyll b (Chl b) and carotenoid (Car) content of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

2.3 唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的氧化損傷

2.3.1 對TP含量的影響

唑類殺菌劑對蛋白核小球藻TP含量的影響如圖4所示。在4種唑類殺菌劑的作用下，蛋白核小球藻的TP含量表現(xiàn)出明顯的濃度-效應關系，即隨著污染物濃度的升高，TP含量的抑制率也隨之升高，而且TP含量與污染物的濃度呈現(xiàn)良好的正相關(P<0.01)。其中，克霉唑對蛋白核小球藻的TP含量的影響存在著“低促高抑”的現(xiàn)象，最低濃度的促進作用達到28.6%。根據藻細胞的生長抑制率和TP含量變化的結果，蛋白核小球藻的氧化應激隨污染物濃度的增加明顯增強。

圖3 毒性機理圖Fig. 3 Toxicity mechanism diagram

圖4 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻生長和總蛋白(TP)含量的影響Fig. 4 Effects of four azole fungicides on the growth and total protein (TP) content of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

2.3.2 蛋白核小球藻對唑類殺菌劑的氧化應激反應

MDA的含量可以反映機體脂質過氧化的程度，間接反映出細胞的損傷程度[39]。由圖5可知，蛋白核小球藻暴露于4種唑類殺菌劑96 h后，MDA的含量均隨著污染物濃度的升高而升高。但是在低濃度下，MDA的產生受到抑制，這可能與ROS的產生受到抑制有關系。高濃度的污染物暴露下，MDA大量產生，尤其是三唑醇和氯咪巴唑2種污染物對MDA產生的促進作用分別達到131.98%和136.34%。這與最近的一些研究結果相似[43]，蛋白核小球藻細胞中MDA的大量產生表明機體在唑類殺菌劑的刺激下產生氧化應激反應。

圖5 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 5 Effects of four azole fungicides on the reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) content of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

CAT是生物體內另一種抗氧化酶，是防止細胞免受氧化應激損傷的第二道防線，CAT可以將H2O2還原為H2O和O2[41]。由圖6可知，隨著污染物濃度的升高，促進了CAT的產生，尤其是三唑醇、三唑酮和氯咪巴唑對CAT產生的促進作用明顯，大小順序為氯咪巴唑>三唑醇>三唑酮。但在氯咪巴唑高濃度作用下，CAT的促進作用逐漸減小，這可能與ROS產生受到的抑制變大有關。在中低濃度作用下，克霉唑對蛋白核小球藻細胞的CAT產生有抑制作用，但隨著污染物濃度的升高，抑制作用降低，在最高濃度時出現(xiàn)促進。這可能因為在污染物刺激下ROS大量產生從而激發(fā)CAT合成酶的活性。

2.4 唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的凋亡損傷

如圖7所示，經過4種唑類殺菌劑處理96 h后，蛋白核小球藻出現(xiàn)不同程度的凋亡，而且隨著污染物濃度的升高，毒性越大，細胞凋亡的程度越嚴重。這說明，唑類殺菌劑能夠誘導蛋白核小球藻的凋亡，而且呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應關系。由細胞凋亡率曲線可知，4種污染物的毒性大小為三唑醇>克霉唑>氯咪巴唑>三唑酮。

3 討論(Discussion)

唑類殺菌劑的高穩(wěn)定性使其在環(huán)境中長期暴露，這對水生生物及人體健康造成了潛在的威脅。本研究根據唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的96 h急性毒性，進一步揭示了不同污染物對蛋白核小球藻的致毒機理。4種唑類殺菌劑在96 h暴露下對蛋白核小球藻的毒性大小存在差異，根據生長抑制率曲線擬合得到的pEC50，判斷其毒性大小為：氯咪巴唑>克霉唑>三唑醇>三唑酮。同時，本實驗還通過檢測細胞凋亡來判斷唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的急性毒性，其毒性大小為：三唑醇>克霉唑>氯咪巴唑>三唑酮。產生這種差異的原因可能與綠藻細胞的“休眠”有關，即綠藻細胞受到污染物刺激時形成的一種自我保護機制[46-47]。休眠狀態(tài)下，綠藻細胞是完整的，只是將各種機能消耗降到最低，而PI染料可以染色喪失細胞膜完整性的細胞，無法染色保持了完整細胞膜的綠藻細胞。因此，相較于分光光度法，采用細胞凋亡檢測方法判斷蛋白核小球藻的細胞活性更加準確。

圖6 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig. 6 Effects of four azole fungicides on the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

圖7 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻細胞凋亡的影響Fig. 7 Effects of four azole fungicides on the cell apoptosis of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

通過研究蛋白核小球藻對唑類殺菌劑的氧化應激反應發(fā)現(xiàn)，不同污染物對同一生物氧化抗氧化系統(tǒng)的影響不同。4種唑類殺菌劑在低濃度暴露下，ROS、CAT、SOD和MDA的產生均呈現(xiàn)不明顯的抑制狀態(tài)，說明在低濃度下，蛋白核小球藻可能通過其他的機制來耐受污染物，或者由于產生的ROS量過低，不能影響綠藻的正常代謝，不足以刺激抗氧化系統(tǒng)來清除ROS[48]。但是隨著污染物濃度的升高，ROS的含量、MDA的含量以及抗氧化酶SOD和CAT的活性均出現(xiàn)了不同程度的促進或者抑制作用。在氯咪巴唑的暴露下，隨污染物濃度的升高，ROS產生的抑制率先降低后升高，這可能是因為隨污染物濃度的升高，ROS積累量增加，促進了MDA的大量產生，從而放大了ROS的作用，促進了抗氧化酶SOD和CAT的合成，加速了ROS的清除。當三唑醇、三唑酮和克霉唑作用于蛋白核小球藻時，污染物濃度的升高促進了ROS和MDA的大量產生，從而激發(fā)機體的抗氧化機制，SOD和CAT的活性增強，以清除多余的ROS。而隨著三唑醇和克霉唑濃度的增加，SOD的產生受到抑制，抑制率與三唑醇和克霉唑的濃度正相關，這與郭慶亮[49]的研究結果相似。這可能是因為在高濃度暴露下SOD合成酶的活性并不能被成功激活，從而導致SOD的產生受到抑制。

蛋白質不僅是構成細胞的結構材料和各種反應進行的催化劑，也是植物體代謝變化的重要指標[35]。研究發(fā)現(xiàn)，4種唑類殺菌劑的暴露濃度越高，TP產生的抑制率升高，即TP含量降低。蛋白核小球藻對污染物的耐受能力有限，隨著污染物濃度的升高，代謝能力降低，蛋白質分解，最終導致蛋白質含量降低。這種情況的產生與葉綠素含量的降低密切相關，葉綠體中光合作用產生的能量和有機物是植物體正常進行各種代謝活動的重要保證[31]。本研究也證明，隨著污染物濃度的升高，產生了對Chla、Chlb和Car的抑制。其中，Chla是主要的光合色素，Chlb是植物體普遍存在的輔助色素[50]，2種光合色素含量的降低必定會阻礙光合作用的正常進行。在植物體中，Car的積累和固定發(fā)生在葉綠體中，負責吸收光能傳遞給葉綠素，推動光化學過程。同時，Car還與葉綠素的結合蛋白有關，它的降低同樣對蛋白質的合成產生影響[51]。

本實驗進行了單一污染物對綠藻的急性毒性及其致毒機理的研究，然而環(huán)境中的農藥是以各種形式和濃度共存，形成復雜的混合物并產生聯(lián)合毒性[52]。因此，未來需要關注環(huán)境濃度下的唑類殺菌劑與其他污染物對藻類的聯(lián)合毒性效應，并揭示其毒性機制，這將會對地表水體中唑類殺菌劑的生態(tài)風險評價及防治提供重要的依據。