稻蝦共育田酰胺類除草劑脅迫對(duì)克氏原螯蝦幼蝦生長(zhǎng)發(fā)育的影響

王守紅，吳雷明，楊顯祥，韓光明，張家宏，*，寇祥明，王曙光，李兵

1. 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225007 2. 揚(yáng)州市水產(chǎn)生產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，揚(yáng)州 225003 3. 江蘇普興循環(huán)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，揚(yáng)州 225654 4. 揚(yáng)州市龍道生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，揚(yáng)州 225615

稻田養(yǎng)漁最早記載于1 700年前的中國(guó)，目前已經(jīng)成為中國(guó)、印度、日本及很多東南亞國(guó)家食物保障的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖模式之一[1]。稻田養(yǎng)漁是種植業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)有機(jī)結(jié)合的高效生態(tài)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式，是以提高稻田產(chǎn)出率并保持稻田良性生態(tài)環(huán)境為目的的一種生產(chǎn)模式。目前，我國(guó)是世界上稻田養(yǎng)漁面積最大的國(guó)家，并逐步出現(xiàn)了集約化、規(guī)?；I(yè)化、產(chǎn)業(yè)化、品牌化、產(chǎn)品向綠色、有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品方向發(fā)展的趨勢(shì)[2]。水稻與魚類互利互惠的生態(tài)學(xué)原理是稻田養(yǎng)漁復(fù)合系統(tǒng)的基礎(chǔ)，兩者結(jié)合促進(jìn)了系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益的提升[3-4]。稻田綜合種養(yǎng)模式與當(dāng)?shù)氐奈幕?、?jīng)濟(jì)以及生態(tài)環(huán)境相結(jié)合，在保護(hù)當(dāng)?shù)厣锒鄻有院途S持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面扮演著重要角色[5]。

水稻種植與水產(chǎn)養(yǎng)殖互利共惠的同時(shí)，兩者不同的生產(chǎn)要素和需求無(wú)可避免會(huì)產(chǎn)生矛盾，稻田農(nóng)藥的環(huán)境行為就是其中之一[6-7]。水產(chǎn)動(dòng)物的生命活動(dòng)對(duì)水稻的病蟲(chóng)草害有一定的生物防治效果。稻漁綜合種養(yǎng)模式中稻飛虱和紋枯病病株發(fā)病率分別降低44.74%和54.35%[8]，稻蟹綜合種養(yǎng)模式對(duì)雜草的防控效率為26.53%～44.33%[9]。在旱改水的稻蝦共作模式下，通過(guò)蝦群活動(dòng)控制田間雜草的危害，總體效果可達(dá)94.03%，而在水稻連作模式下的稻蝦共作直播田，雜草發(fā)生量大，特別是千金子的危害難以控制[10]。綜上所述，稻漁綜合種養(yǎng)模式下，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物并不能完全起到防控病蟲(chóng)草害的作用，仍需輔助化學(xué)防除、物理防控和生態(tài)防控等預(yù)防措施[11]。

稻田-克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)生態(tài)種養(yǎng)模式，是我國(guó)克氏原螯蝦主要養(yǎng)殖方式之一[12]。如何解決水稻病蟲(chóng)害防治與克氏原螯蝦養(yǎng)殖之間的矛盾[13]，即如何預(yù)防常用農(nóng)藥對(duì)克氏原螯蝦的毒性效應(yīng)是確保稻蝦綜合種養(yǎng)模式正常生產(chǎn)的關(guān)鍵之一。酰胺類除草劑發(fā)展迅速，產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)，在各類除草劑中名列第4位，僅排在氨基酸類、磺酰脲類和有機(jī)磷除草劑之后[14-15]。丙草胺和丁草胺作為稻田廣泛應(yīng)用的酰胺類芽前除草劑，主要用于防除禾本科雜草，具有高效性、選擇性[7]。本文以克氏原螯蝦幼蝦為試驗(yàn)對(duì)象，研究了丙草胺和丁草胺2種酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期全面評(píng)價(jià)酰胺類除草劑在稻蝦綜合種養(yǎng)模式中的環(huán)境安全，并指導(dǎo)農(nóng)藥合理使用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)對(duì)象

克氏原螯蝦幼蝦來(lái)源于江蘇普興循環(huán)農(nóng)業(yè)有限公司。選擇規(guī)格整齊、附肢齊全、活動(dòng)能力強(qiáng)的克氏原螯蝦幼蝦為試驗(yàn)對(duì)象，其平均體質(zhì)量為(4.84±0.46) g。

1.2 試驗(yàn)藥品

丙草胺有效成分含量為500 g·L-1，助劑成分為乳油，凈含量0.07 L，生產(chǎn)廠家為先正達(dá)(蘇州)作物保護(hù)有限公司；丁草胺有效成分含量為50%，助劑成分為乳油，凈含量0.26 L，生產(chǎn)廠家為山東勝邦綠野化學(xué)有限公司。

1.3 養(yǎng)殖管理

幼蝦暫養(yǎng)10 d，使其適應(yīng)小水體環(huán)境，降低應(yīng)激反應(yīng)。試驗(yàn)采取靜水試驗(yàn)法[16]，即采用一次性投藥，不更換藥水方式。設(shè)置對(duì)照組、丙草胺和丁草胺3個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)投放15尾。試驗(yàn)過(guò)程中丙草胺和丁草胺藥物制劑濃度按照稻田常規(guī)劑量計(jì)算(丙草胺0.0021 mL·L-1；丁草胺0.0045 mL·L-1)，藥物有效含量分別為1.05×10-3g·L-1和0.0023 mL·L-1。為降低殘餌和糞便對(duì)養(yǎng)殖水體的污染，正式試驗(yàn)開(kāi)展前1 d，停止投喂，于第6天取樣結(jié)束后開(kāi)始恢復(fù)投喂，按照幼蝦體質(zhì)量的1%計(jì)算投喂量(少量投喂)，投喂頻率為每3 d投喂1次。如養(yǎng)殖過(guò)程中存在少量殘餌，禁止撈出，減少試驗(yàn)藥品投入總量的損失。日常記錄幼蝦死亡、蛻殼等情況。養(yǎng)殖水族箱容量為70 L，養(yǎng)殖水體為10 L，持續(xù)增氧。

1.4 樣品采集

取樣時(shí)間點(diǎn)為1、3、6、11和17 d。每個(gè)處理隨機(jī)選取6只幼蝦，首先采用電子天平測(cè)量體質(zhì)量，隨后立即進(jìn)行解剖，取幼蝦肝胰腺樣品急凍低溫保存。樣品加0.85%生理鹽水進(jìn)行冰浴勻漿離心，取上清液，于4 ℃下保存用于后續(xù)分析，樣品于24 h內(nèi)分析完成。一部分用于測(cè)定胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，另一部分用于測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性及總抗氧化力(T-AOC)。取樣前24 h停止投喂飼料，使腸道內(nèi)容物排空。消化酶和抗氧化酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)及多重比較(Duncan)等分析，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響

酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響如圖1所示。第1天至第6天，丙草胺組和丁草胺組克氏原螯蝦體質(zhì)量與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第11天和第17天，對(duì)照組克氏原螯蝦體質(zhì)量顯著高于丙草胺組和丁草胺組(P<0.05)。丙草胺組與丁草胺組克氏原螯蝦體質(zhì)量在各取樣時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。丙草胺組和丁草胺組克氏原螯蝦體質(zhì)量顯著低于初始值的時(shí)間為第11天(P>0.05)，對(duì)照組為第17天。丙草胺組和丁草胺克氏原螯蝦蛻殼累計(jì)次數(shù)分別為5次和4次，對(duì)照組幼蝦無(wú)蛻殼現(xiàn)象。整個(gè)試驗(yàn)養(yǎng)殖過(guò)程中，除丁草胺組1只幼蝦因蛻殼被殘食外，各組幼蝦均無(wú)死亡個(gè)體。

圖1 酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦幼蝦生長(zhǎng)的影響注：不同小寫字母表示同一時(shí)間不同處理組差異顯著(P<0.05)； 不同大寫字母表示同一處理組不同時(shí)間差異顯著(P<0.05)。Fig. 1 Effect of amide herbicide on growth of Procambarus crustacean juvenileNote: Different lowercase letters mean significant differences among different treatments at the same time (P<0.05); different uppercase letters mean significant differences among the same treatments at different time (P<0.05).

2.2 酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦消化酶活性的影響

酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦幼蝦消化酶活性的影響如表1所示。第1天時(shí)，丁草胺組克氏原螯蝦胰蛋白酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，至第3天時(shí)兩者無(wú)顯著性差異(P>0.05)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，丙草胺組幼蝦胰蛋白酶活性與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各組克氏原螯蝦胰蛋白酶活性隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)均呈顯著性降低趨勢(shì)(P<0.05)。第1天時(shí)，丙草胺組克氏原螯蝦淀粉酶活性顯著低于對(duì)照組和丁草胺處理組(P<0.05)。第3天時(shí)，丙草胺組克氏原螯蝦淀粉酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而與丁草胺組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。丁草胺組幼蝦淀粉酶活性始終與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第6天時(shí)，丙草胺組克氏原螯蝦淀粉酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，丁草胺組淀粉酶活性顯著高于丙草胺組(P<0.05)。各組克氏原螯蝦淀粉酶活性隨養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后降低的趨勢(shì)。第6天時(shí)，丙草胺組克氏原螯蝦脂肪酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)各組克氏原螯蝦幼蝦脂肪酶活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各組克氏原螯蝦脂肪酶活性隨養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化規(guī)律。至11 d時(shí)，丙草胺組幼蝦各消化酶活性與對(duì)照組之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，至3 d時(shí)，丁草胺組幼蝦各消化酶活性與對(duì)照組之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.3 酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦抗氧化酶活性的影響

酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦幼蝦抗氧化酶活性的影響如表2所示。第1天時(shí)，丙草胺組克氏原螯蝦SOD活性顯著高于對(duì)照組和丁草胺組(P<0.05)，后兩者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第3天時(shí)，丁草胺組克氏原螯蝦SOD活性顯著高于對(duì)照組和丁草胺組(P<0.05)，后兩者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第6天時(shí)，對(duì)照組、丙草胺組和丁草胺組之間克氏原螯蝦SOD活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

丙草胺組、丁草胺組和對(duì)照組之間克氏原螯蝦CAT活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)，僅丁草胺組在第11天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。第1天時(shí)，丙草胺組和丁草胺組克氏原螯蝦MDA含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，至第3天開(kāi)始，3組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，僅丙草胺組在第11天時(shí)顯著高于對(duì)照組和丁草胺組(P<0.05)。

第1天時(shí)，丙草胺組和丁草胺組克氏原螯蝦GPx活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，第3天時(shí)，兩者顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，至第6天時(shí)，三者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第11天和第17天時(shí)，丁草胺組克氏原螯蝦GPx活性均顯著高于對(duì)照組和丙草胺組(P<0.05)，而后兩者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

丙草胺組克氏原螯蝦T-AOC在第1天和第3天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而丁草胺組至第11天時(shí)仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，第17天時(shí)，丙草胺組、丁草胺組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。至17 d時(shí)，丙草胺組、丁草胺組和對(duì)照組之間，除丁草胺組幼蝦GPx活性外，各抗氧化酶活性均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦幼蝦消化酶活性的影響Table 1 Effects of amide herbicides on digestive enzyme activities of Procambarus crustacean juvenile

3 討論(Discussion)

營(yíng)養(yǎng)不足會(huì)影響魚類正常生理代謝水平，造成機(jī)體能量供應(yīng)不足，并導(dǎo)致其生長(zhǎng)率下降[17-18]。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不足會(huì)導(dǎo)致克氏原螯蝦體質(zhì)量顯著下降，同時(shí)，在丙草胺和丁草胺脅迫下，克氏原螯蝦幼蝦體質(zhì)量損失率顯著增大，相對(duì)于對(duì)照組，丙草胺組和丁草胺組克氏原螯蝦幼蝦體質(zhì)量顯著低于初始值的時(shí)間提前了6 d。甲殼類能量收支模型為：攝食能=生長(zhǎng)能+糞便能+蛻殼能+排泄能+代謝能[19]。丙草胺組和丁草胺組克氏原螯蝦均有多次蛻殼現(xiàn)象發(fā)生，同時(shí)在藥物因素脅迫下，蛻殼能和代謝能等方面的能量消耗增加，導(dǎo)致2組幼蝦少量的攝食能不足以滿足正常生命活動(dòng)需求和抵抗環(huán)境脅迫(藥物、饑餓)，從而造成幼蝦體質(zhì)量迅速下降。

消化酶活性與水生動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育有著極其緊密的關(guān)系，是反映水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理的重要指標(biāo)，其活性變化可反映水生動(dòng)物在環(huán)境中的生理狀態(tài)和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性[20-21]。研究證實(shí)，低濃度的丁草胺暴露對(duì)胡子鯰(Clariasfuscus)淀粉酶活性有一定的提高，脂肪酶活性隨著暴露時(shí)間及濃度的增加顯著降低[22]。本研究結(jié)果顯示，丙草胺和丁草胺對(duì)克氏原螯蝦消化酶活性產(chǎn)生了抑制作用，無(wú)誘導(dǎo)升高現(xiàn)象，且丙草胺對(duì)克氏原螯蝦消化酶活性影響程度大于丁草胺。隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，克氏原螯蝦胃腸組織胃蛋白酶和肝胰臟脂肪酶活性呈逐漸降低的趨勢(shì)，其胃腸淀粉酶活性則隨饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)[23]。本研究結(jié)果顯示，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，丙草胺和丁草胺對(duì)克氏原螯蝦幼蝦消化酶活性的影響逐漸消失，后期幼蝦消化酶活性變化可能是由于營(yíng)養(yǎng)缺乏所致，與上述文獻(xiàn)結(jié)果相似。

養(yǎng)殖水體環(huán)境多源性污染物對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象健康存在較大威脅，微囊藻毒素[24]、硝態(tài)氮和氨態(tài)氮[25]和重金屬離子[26]等均可誘導(dǎo)養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生強(qiáng)弱程度不一的氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD、CAT和MDA是幾種經(jīng)典的反映機(jī)體氧化脅迫狀況的生理指標(biāo)，被較多地應(yīng)用在外源污染物對(duì)水生動(dòng)物的氧化應(yīng)激損傷研究中[27]。斑馬魚(Brachydaniorerio)暴露于丙草胺，其肝臟SOD、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性先誘導(dǎo)后抑制，CAT活性受到抑制，MDA含量升高[28]。毒死蜱對(duì)鋸齒新米蝦(Neocaridiandenticulate)的毒性顯著高于Cu2+[29]，毒死蜱較低濃度組鋸齒新米蝦SOD表現(xiàn)為“抑制-誘導(dǎo)”的變化趨勢(shì)，隨著毒死蜱濃度增加，MDA含量呈逐漸上升的趨勢(shì)[30]。本研究結(jié)果顯示，丙草胺和丁草胺對(duì)克氏原螯蝦幼蝦抗氧化酶活性存在顯著影響，SOD活性呈誘導(dǎo)-抑制變化規(guī)律，CAT活性與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，而MDA含量顯著降低后與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，GPx活性呈誘導(dǎo)-抑制變化規(guī)律，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，藥物對(duì)其抗氧化酶活性的影響逐漸消失。魏華等[27]研究了溴氰菊酯對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺氧化脅迫效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)SOD和CAT活性呈抑制-誘導(dǎo)-抑制的變化規(guī)律，MDA含量則一直高于對(duì)照組。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)結(jié)果不盡相同，可能與試驗(yàn)過(guò)程中選取的藥物種類、試驗(yàn)對(duì)象、取樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)以及藥物毒性機(jī)理差異有關(guān)，但結(jié)果均表明所選藥物對(duì)受試對(duì)象的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了顯著影響。

表2 酰胺類除草劑對(duì)克氏原螯蝦幼蝦抗氧化酶活性的影響Table 2 Effects of amide herbicides on antioxidant enzyme activities of Procambarus crustacean juvenile

本研究結(jié)果表明，丙草胺組和丁草胺組克氏原螯蝦抗氧化酶活性在第6天(除T-AOC外)和第17天(除GPx外)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，而在第11天時(shí)，丙草胺組(MDA)和丁草胺組(GPx、CAT、T-AOC)抗氧化酶活性均顯著高于對(duì)照組。研究證實(shí)，饑餓顯著影響克氏原螯蝦抗氧化酶活性[31]，因此，本文上述現(xiàn)象可能是由營(yíng)養(yǎng)不足和藥物雙重脅迫因素累積疊加造成的，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

稻田除草劑丙草胺和丁草胺可以誘導(dǎo)克氏原螯蝦蛻殼，短時(shí)間內(nèi)可以影響幼蝦消化酶和抗氧化酶活性，幼蝦體質(zhì)量損失率增大，經(jīng)短期少量投喂養(yǎng)殖后，負(fù)面效應(yīng)逐漸消失。為避免飼料對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，本研究試驗(yàn)對(duì)象處于營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)，對(duì)于正常投喂養(yǎng)殖條件下，丙草胺和丁草胺對(duì)幼蝦生長(zhǎng)發(fā)育是否仍存在上述影響，有待進(jìn)一步研究和探索。