常用肝纖維化實驗動物模型研究進展

王奎淞，趙鯤鵬，張秋菊

肝纖維化(HF)是慢性肝損傷導致肝內膠原纖維異常增生的病理過程。HF如未得到及時治療，會發(fā)展成肝硬化甚至肝癌，嚴重影響人類健康[1]。HF動物模型是HF研究的必要工具，目前其模型制備方法較多，為了方便科研工作選擇HF模型制備方法，本文將目前常用的制備方法做一介紹。

1 化學損傷HF模型

化學損傷HF模型是用化學藥物進入肝細胞產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物造成持續(xù)性肝損傷，誘導形成HF。常用肝毒性化學試劑有四氯化碳(CCl4)、二甲基亞硝胺(NDMA)和硫代乙酰胺(TAA)。

1.1CCl4誘導的HF模型 四氯化碳(CCl4)是具有微甜氣味，無色透明易揮發(fā)的脂溶性有機化合物，可選擇性損害肝細胞。當CCl4隨血液循環(huán)進入到肝細胞后，會在肝細胞色素P450作用下，產(chǎn)生一系列自由基使細胞膜、內質網(wǎng)膜等發(fā)生氯烷基化和脂質過氧化，損傷膜的結構和功能，導致肝細胞死亡。CCl4造模法由于價格低廉、可靠性高、可重復性好的優(yōu)勢成為了目前使用最多的HF動物造模方法。適用于急性、亞急性、慢性肝損傷及肝纖維化、肝硬化的研究，且致病原因和病理表現(xiàn)適合用于反映中醫(yī)濕熱、氣滯以及陰虛的病機，能為相關疾病的研究提供適宜動物模型[2]。CCl4誘導HF造模法選用的實驗動物多為大小鼠，給藥多采用灌胃和腹腔注射。腹腔注射法造模成功率高，造模周期短，但動物死亡率高；灌胃法操作簡單，動物耐受性好，但造模周期長，造模成功較困難[3]。故目前多選腹腔注射方式造模。

1.1.1單純CCl4誘導的HF模型：CCl4制備HF動物模型時，多選用200 g大鼠以50%CCl4油溶液腹腔注射或灌胃給藥。單次給藥劑量為1 ml/kg，每周2次，給藥總劑量達1.6 ml時即可得到穩(wěn)定的HF動物模型。一般給藥4周后可觀察到HF樣改變，給藥8周可持續(xù)觀察到穩(wěn)定的HF樣改變[4]。

CCl4制備HF小鼠模型時多選用25 g小鼠，腹腔注射50%CCl4油溶液，單次給藥劑量2 ml/kg，每周2次，為期6周，給藥總劑量達0.6 ml時可得到穩(wěn)定的HF模型；或選用50%CCl4油溶液，單次給藥劑量0.5 ml/kg，每周2次，為期12周，給藥總劑量達0.3 ml時可得到穩(wěn)定的HF模型[5]。

1.1.2CCl4聯(lián)合誘導的HF模型：目前CCl4聯(lián)合苯巴比妥或乙醇制備HF動物模型已較成熟。苯巴比妥可提高細胞色素P450活性，增強肝細胞對CCl4的敏感度，加劇CCl4的毒性作用；乙醇能損傷肝細胞線粒體，加劇CCl4的肝毒性，促進肝損傷，最終形成穩(wěn)定的HF模型[6]。但因CCl4給藥劑量和干預時間不易控制，2種聯(lián)合造模法常使實驗動物進展為肝硬化甚至產(chǎn)生腹水，導致造模失敗，故現(xiàn)多用于制備肝硬化和肝硬化腹水的動物模型[7]。

1.2NDMA誘導的HF模型 NDMA是能同時溶于水和乙醇的有機溶劑，可經(jīng)消化道、呼吸道迅速吸收，進入體內可經(jīng)多途徑誘導肝損傷。此時，廣泛的全小葉和多小葉壞死能喚醒靜息的肝星狀細胞轉化為肌成纖維細胞，并開始廣泛合成結締組織蛋白，從而引起膠原纖維在肝細胞外基質沉積，導致HF[8]。選用NDMA作為HF動物模型造模試劑時，多選擇大鼠，常用0.9%氯化鈉注射液稀釋0.5%NDMA溶液后以2 ml/kg劑量腹腔注射，每周連續(xù)注射3 d，3～4周造模成功[9]。雖NDMA誘導HF模型法穩(wěn)定、成功率高，但因NDMA是有較強肝毒性的致癌物，近年被國家列為管制藥物，且價格昂貴，不適合用于HF動物模型造模。

1.3TAA誘導的HF模型 TAA是具有肝毒性的有機化合物，能影響肝細胞蛋白合成，并于DNA、RNA及蛋白合成酶上產(chǎn)生毒性作用，誘導肝代謝紊亂及血小板降低[10]。TAA誘導的HF動物模型在血流動力學、生化指數(shù)改變及形態(tài)學方面與人類HF表現(xiàn)極相似[11]。用TAA制備HF實驗動物模型時，一般選用嚙齒類動物，采用灌胃、皮下或腹腔注射方式，將3%TAA溶液按150～200 mg/kg劑量給藥，每周2～3次，造模周期一般>4周[12]。

飲用TAA溶液也可誘導HF形成，且模型持久性與TAA灌胃無差別[13]，但灌胃法誘導HF周期更短，造模用試劑攝入量更加可控，也不會出現(xiàn)拒飲情況，杜絕了因飲水量減少造成采血難度加大、飲水量不足導致的死亡；灌胃法還能有效杜絕因多次注射引發(fā)的局部感染，腹腔注射引起的腹腔內臟粘連或硬結形成，且更加接近人類HF形成途徑[14]。

MATSUO等[15]為更加貼近臨床，選用食蟹獼猴作為造模動物，將3%TAA溶液按100 mg/kg劑量皮下注射，每周3次，持續(xù)8周造模，給藥4周后可觀察到HF樣改變，給藥8周后可觀察到纖維變性惡化，且通過組間對比，認為TAA優(yōu)于CCl4，因其既可誘導HF進展，又能惡化殘余的肝功能，且只有TAA給藥能使吲哚菁綠清除功能惡化。但因模型動物的個體差異，非人靈長類動物(NHPs)對TAA的反應可能比嚙齒類動物低得多，故需單獨修改試劑給藥方案，繼續(xù)探索建立適宜所有NHPs的可用模型制備方案。但此方案只需8周就能建立HF模型，為現(xiàn)有NHPs模型中所需時間最短的。

2 膳食模型

許多疾病都受到飲食因素的影響，模擬日常生活膳食有助于制備的動物模型更加貼近人類疾病的臨床表現(xiàn)。

2.1酒精誘導的HF模型 酗酒已是全球性醫(yī)療保健問題，全球超過5%的疾病是由酗酒引起[16]。肝臟是乙醇代謝的主要場所，乙醇代謝產(chǎn)物乙醛能誘導肝臟氧化應激，使線粒體和微管系統(tǒng)受損，線粒體功能損傷、內質網(wǎng)應激和免疫/炎癥反應等引起肝損傷，故長期和(或)短期內大量酗酒會產(chǎn)生廣泛的肝臟病變，使得酒精性肝病(ALD)發(fā)病率升高。

ALD的特征性表現(xiàn)是脂肪變性、肝炎和纖維化/肝硬化。脂肪變性是大量飲酒損傷肝臟后出現(xiàn)的最早征象，特征是脂肪在肝細胞內沉積。脂肪變性可繼發(fā)為脂肪性肝炎，同時細胞外基質會出現(xiàn)蛋白過度沉積，甚至可能觀察到過度的肝臟瘢痕組織形成和血管改變。瘢痕組織可減緩血液通過肝臟的流速，增加門靜脈壓力及毒素蓄積，導致肝衰竭[17]。

研究表明，由食用白酒替代醫(yī)用乙醇溶液后，實驗動物拒飲水現(xiàn)象減少[18]。故可用52°白酒灌服制備小鼠急性酒精性肝損傷模型，劑量12 ml/kg，每日1次，6～12 d可制備成功[19]。孫福榮[20]研究顯示，單次狂飲比長期規(guī)律適量飲酒更易出現(xiàn)肝臟脂肪變，成為ALD的主要誘因。王秋艷等[21]研究也認為短期內大量飲酒會對肝臟組織造成損傷。故可選用12 ml/kg一次性灌服50%乙醇溶液來制備小鼠急性酒精性肝損傷模型，16 h便可建模成功。

2.2高脂飲食誘導的HF模型 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)主要包括肝脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[22]。NASH最常見纖維化征象[23]，故可用高脂飲食誘導建立HF模型。雖誘發(fā)NAFLD的機制及如何發(fā)展為NASH的機制目前尚未完全闡明，但有學者認為是多因素導致，如胰島素促進葡萄糖攝取和利用率下降，脂肪在肝細胞內積累，細胞內脂肪空泡增多，線粒體β氧化能力降低，誘導內質網(wǎng)發(fā)生應激和肝細胞凋亡[24]。

目前，多使用含約40%脂肪和約0.2%膽固醇固定配比飼料放任模型大鼠隨意飲食或選用高脂日糧，造模周期12周[25]，8～12周得到穩(wěn)定脂肪性HF動物模型[26]，在此基礎上添加果糖、游離膽固醇或CCl4能使實驗動物模型在表現(xiàn)NAFLD某些特征時更為明顯和突出[27]。高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性HF模型與人類營養(yǎng)代謝紊亂相關的非酒精性肝炎致HF的病理過程最為貼近，該HF模型已較成熟，可為NAFLD相關疾病的HF樣改變研究提供必要的工具。但因動物攝食量、時間等不易控制，使制備的HF模型個體差異較大。

2.3蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飲食誘導的HF模型 長期營養(yǎng)不良或攝入不足會導致肝細胞損傷和脂肪變性，續(xù)而可發(fā)展為HF。經(jīng)控制飲食攝入不平衡或缺乏特定營養(yǎng)素引起肝細胞脂肪變性，使肝細胞對各種有害因素的抵抗力降低，或使細胞體積增大彼此擠壓并壓迫肝血竇，逐漸造成肝細胞凋亡或纖維組織增生，進而形成HF。蛋氨酸是構成機體的必需氨基酸，能參與蛋白質合成，因不能由動物自身生成，故MCD飲食可致HF。MCD會嚴重影響肝β氧化、減少極低密度脂蛋白合成，造成肝損傷[28]。MCD模型能很好地復制人體嚴重NASH臨床表征，且纖維化進展快[29]。

小鼠是MCD制備HF模型的首選，有關研究使用MCD飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠6周后發(fā)現(xiàn)小鼠體內PAI-1、TGF-β1、α-SMA等促纖維化蛋白和基因水平升高，提示HF形成[30]。胱氨酸、維生素等其他營養(yǎng)因素可引起肝細胞壞死，進而發(fā)展為肝硬化，也可用于制造HF動物模型[31]。值得注意的是，MCD造模方案雖會導致模型動物體質量下降，但未見血清胰島素、空腹血糖、瘦素和三酰甘油等降低[32]，和人類NASH表現(xiàn)還有一定差異，提示選用此造模方法尚需綜合考慮存活率和病理特征。有研究發(fā)現(xiàn)，MCD誘導的3～5周齡幼鼠已可為兒童NAFLD研究提供合適的動物模型[33]。

3 自身免疫性HF模型

自身免疫性肝炎可在免疫或病毒感染等因素影響下誘使免疫細胞攻擊自身肝細胞，致肝臟炎癥性壞死，繼而發(fā)展為HF、肝硬化等[34]。目前，該模型制備方法使用動物血清作為抗原反復注射引起肝細胞損傷或經(jīng)手術膽總管結扎法以激活造模動物自身免疫反應，制備自身免疫性HF模型。

3.1豬血清誘導HF模型 豬血清是自身免疫性HF模型制備中最常用的異種血清，當其注入模型動物體內后，會刺激產(chǎn)生抗體形成免疫復合物(IC)激活補體，長期抗原刺激形成的IC會沉積于血管壁，引起變態(tài)反應造成血管炎和血管周炎，導致肝損傷，形成廣泛的進行性慢性炎癥，如此反復的肝細胞變性、壞死和增生，逐漸發(fā)展為纖維化樣改變[35]。豬血清多為0.5 ml/只腹腔注射，每周2次，4周見HF指征，8周造模結束，12周時發(fā)現(xiàn)造模時間越久HF表現(xiàn)越明顯[36]。研究顯示，豬血清誘導的HF大鼠模型血液流變學表現(xiàn)十分符合中醫(yī)“血瘀證”血行不暢和血不循經(jīng)的特點[37]，這無疑為使用“活血化瘀”法治療HF提供了有力證據(jù)。

3.2膽汁淤積性HF模型 膽汁淤積性肝病可導致肝細胞壞死、細胞凋亡、進行性纖維化甚至終末期肝病[38]。制造膽汁淤積性HF動物模型時，常使用膽總管結扎造模法，即選用8～12周雄性小鼠經(jīng)手術激活其自身免疫反應制造HF模型。GARCIA-RUIZ等[39]使用2%異氟烷麻醉小鼠，沿腹中線開腹后鈍性分離膽總管與門靜脈及肝側壁，于近肝門處雙重結扎膽總管，并剪斷膽總管確保完全阻斷，生理鹽水沖洗腹膜腔，縫合腹壁并予止痛藥物。術后12、24 d取肝檢測，可觀察到丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶和總膽紅素升高，蘇木精-伊紅染色、Masson染色和天狼猩紅染色可觀察到壞死、炎性細胞浸潤、膽管增生和纖維化樣變。膽總管結扎造模法操作簡單，成模率高。但操作過程中需嚴格無菌操作，以避免術后感染，建議術中或術后予抗菌藥物預防感染；操作人員操作應熟練、細致，以避免人為操作失誤導致的膽汁或腸內消化液流入腹腔引發(fā)實驗動物死亡。

4 小結

每種HF模型制備方法都存在不同的優(yōu)缺點，需根據(jù)實驗目的和要求選擇合理的模型制備方法。因個體差異，模型動物對藥物劑量的敏感度不同，建議首先行預實驗摸索適宜劑量，切勿盲目模仿他人研究。因動物和人類必然存在生物學差異，動物模型永遠不能完全表現(xiàn)出人類疾病的臨床表現(xiàn)，但能幫助我們不斷接近疾病的根本病因，直至攻克疾病。