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    SARS-CoV-2核酸檢測的現(xiàn)狀和問題

    2021-12-07 11:30:47張春燕潘柏申王蓓麗
    檢驗醫(yī)學 2021年5期
    關(guān)鍵詞:載量靶標核酸

    黃 斐, 張春燕, 郭 瑋, 潘柏申, 王蓓麗

    (1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科,上海 200032;2. 復旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科,福建 廈門 361005)

    截至2021年4月30日,嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)全球累計確診超過15 000余萬例。經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播是SARS-CoV-2主要的傳播途徑。多個研究團隊估算SARS-CoV-2基本再生率(basic reproductive rate,R0)為1.8~6.47,遠高于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(R0為2.0~3.0)和其他流感病毒,提示SARSCoV-2的人際傳播速度更快[1-2]。無癥狀感染者和輕型COVID-19患者具有一定傳染性,若未及時檢出并加以控制,會加速病毒傳播。

    我國《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》指出,SARS-CoV-2核酸檢測是確診COVID-19的金標準[3]。準確的實驗室核酸檢測結(jié)果在病毒感染診斷和疫情防控中起著重要的作用。然而與臨床癥狀、影像學特征不相符的SARS-CoV-2核酸檢測假陰性結(jié)果會影響臨床診療,延誤疫情防控。相較于假陰性結(jié)果,假陽性結(jié)果較少見。假陽性結(jié)果不僅浪費醫(yī)療資源,還會引起不必要的社會恐慌。本文圍繞SARS-CoV-2核酸檢測的影響因素,探討其在臨床檢測實踐中存在的問題,以期能幫助臨床實驗室規(guī)范和精準地開展SARS-CoV-2核酸檢測。

    1 分析前

    分析前階段影響因素是臨床檢測錯誤的主要來源,錯誤率約占檢測全過程全部錯誤的46.0%~68.2%[4]。樣本類型、樣本采集和樣本滅活等分析前因素對檢測結(jié)果會產(chǎn)生一定的影響。

    1.1 樣本類型

    呼吸道(上/下呼吸道)樣本是最常用于診斷COVID-19和療效監(jiān)測的樣本類型。有研究從糞便樣本中不僅檢出SARS-CoV-2核酸,同時分離培養(yǎng)出活SARS-CoV-2[5]。有薈萃分析發(fā)現(xiàn),約43.7%的COVID-19患者的糞便中可檢出SARSCoV-2核酸,其中包括部分無胃腸道癥狀的患者[6-7]。此外,唾液也被證實可作為SARS-CoV-2核酸檢測可靠的樣本類型[8]。

    樣本中的病毒載量與采集部位有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),下呼吸道樣本的核酸檢測陽性率和病毒載量遠高于上呼吸道樣本,不同樣本類型SARS-CoV-2核酸檢測陽性率一般為肺泡灌洗液>痰液>鼻咽拭子>口咽拭子[9],呼吸道樣本的核酸檢測陽性率和病毒載量遠高于非呼吸樣本[10]。

    不同部位(類型)樣本病毒載量的動態(tài)變化與疾病進程有關(guān)。SARS-CoV-2通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)受體和跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2)侵入宿主細胞[11]。SUNGNAK等[12]對不同器官組織的單細胞RNA測序圖譜進行分析,發(fā)現(xiàn)ACE2受體和TMPRSS2在鼻杯狀細胞和纖毛細胞中高表達,證實鼻腔是感染發(fā)生的初始部位,這也解釋了鼻拭子中病毒載量顯著高于咽拭子的原因。COVID-19患者在出現(xiàn)癥狀的1周內(nèi),上呼吸道樣本中的病毒載量達峰值;下呼吸道樣本中的病毒載量達峰值稍晚(癥狀發(fā)作2周內(nèi)),但病毒持續(xù)時間長,且病毒載量遠高于上呼吸道樣本;糞便樣本中的病毒載量在病程后期(癥狀發(fā)作后3~4周)達峰值(癥狀發(fā)作后3~4周),但其病毒持續(xù)時間(22 d)顯著長于上/下呼吸道樣本(18 d)。對不同患者的分層分析發(fā)現(xiàn),重型和危重型COVID-19患者呼吸道樣本中病毒的持續(xù)時間顯著長于輕型和普通型COVID-19患者,但病毒載量無顯著差異[13]。因此,對于急性期COVID-19患者應采集其呼吸道樣本;重型及危重型COVID-19患者優(yōu)先采集其下呼吸道樣本;疾病后期可附加采集糞便樣本(用于監(jiān)測疾病恢復情況);對于無癥狀感染者和普通人群篩查建議優(yōu)先采集鼻咽拭子,口咽拭子次之。多類型(部位)樣本聯(lián)合檢測能更有效地避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

    1.2 樣本采集

    由不規(guī)范的采樣程序(如使用錯誤的拭子、采樣部位不準確、分泌物吸取量不足,交叉污染等)獲得的不合格呼吸道樣本是產(chǎn)生假陰性核酸檢測結(jié)果的重要原因。

    美國疾病預防控制中心建議采用塑料桿的滌綸或人造棉拭子(如聚酯纖維拭子)采集鼻咽和口咽樣本,藻酸鈣或木桿拭子會使病毒失活或抑制聚合酶鏈反應[14]。采樣人員應根據(jù)患者類型做好相應的個人防護,對疑似和確診COVID-19患者應采取三級生物安全防護,對一般患者可采取二級生物安全防護,嚴格遵守生物安全要求。樣本采集前的準備工作極為重要,正確的準備工作可減少黏液和其他干擾物對后續(xù)檢測結(jié)果的影響。鼻咽樣本采集前,被采集人員需用紙巾清除鼻腔內(nèi)多余分泌物,拭子進入方向與上顎平行,到達鼻咽底部輕輕旋轉(zhuǎn)1周后緩慢取出;口咽樣本采集前,被采集人員需用0.9%NaCl溶液漱口,拭子用無菌0.9%NaCl溶液濕潤后越過舌根,在雙側(cè)咽扁桃體和咽后壁擦拭至少3次。鼻咽和口咽拭子采集后均需保存于含2~3 mL病毒保存液的螺口管中。采樣人員應經(jīng)專業(yè)培訓,確保熟練掌握規(guī)范采樣技術(shù),為開展準確的SARS-CoV-2核酸檢測奠定基礎(chǔ)。

    1.3 樣本滅活

    為保證操作人員的安全,《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南(第二版)》建議在檢測前對各類臨床樣本進行預滅活[15]。常見的預滅活方式包括熱滅活和化學滅活。在臨床實踐過程中,學者們對臨床樣本是否需要預滅活以及如何預滅活產(chǎn)生了爭議。多項研究結(jié)果顯示,預滅活是造成核酸檢測結(jié)果假陰性的原因之一[16-19]。PAN等[17]研究了熱滅活(56 ℃ 30 min)對病毒核酸檢測結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)低病毒載量的樣本(循環(huán)閾值值為33.37~36.89)對熱滅活敏感,46.7%的弱陽性樣本經(jīng)熱滅活后轉(zhuǎn)為陰性[17]。低溫熱滅活也會破壞單鏈RNA的完整性,導致產(chǎn)生假陰性或假性減低的結(jié)果。滅活有效性取決于病毒能否復制。JUREKA等[18]通過病毒空斑試驗發(fā)現(xiàn),56 ℃ 30 min無法完全滅活高病毒載量樣本中的病毒(1×106pfu/mL),通過延長滅活時間(1 h)才能達到滅活要求。但延長滅活時間至1 h,會增加2.3%的假陰性結(jié)果[19]。化學滅活(含胍鹽)被證實能有效滅活病毒,且對檢測結(jié)果影響較小,但該滅活程序?qū)⑾拗坪罄m(xù)核酸檢測方法的選擇,并會造成環(huán)境污染[17]。

    預滅活會對檢測結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響。臨床實驗室采取切實有效的個人防護措施比檢測樣本的預滅活更為重要。世界衛(wèi)生組織強調(diào),正確使用生物安全柜是開展SARS-CoV-2檢測實驗室生物安全防護的核心要求。在二級生物安全實驗室中,采取適當?shù)娜墏€人防護,如連體防護服、護目鏡(面罩)、N95口罩、手套等裝備,嚴格在生物安全柜中進行高風險操作,可完全保障操作人員的安全。世界衛(wèi)生組織同時建議,檢測實驗室可選擇附移液功能的封閉式自動化核酸抽提儀,減少人工操作。因缺乏防護物資,選擇檢測樣本預滅活方式的實驗室,建議制定實驗室檢測樣本預滅活方式的標準化操作流程,完成相應的性能驗證(即使是有文獻報道的預滅活程序),確保實驗室了解預滅活程序?qū)z測結(jié)果的影響[20]。

    2 分析中

    盡管目前臨床實驗室選用的檢測試劑盒都是獲得管理部門批準的,但選用前仍需比較不同品牌試劑盒的檢測靶標和檢測方法,完成詳盡的性能驗證。檢測過程中的全流程質(zhì)量管理、日常質(zhì)量控制和定期室間質(zhì)量評價也是保證檢測質(zhì)量的關(guān)鍵。

    2.1 檢測靶標

    檢測目標區(qū)域的選擇對SARS-CoV-2核酸檢測至關(guān)重要。SARS-CoV-2含有約29 000個堿基,有12個蛋白編碼區(qū)/開放讀碼框(open reading frame,ORF),包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13、14,其中ORF 1ab為RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)基因所在區(qū)域,編碼RNA聚合酶,負責病毒核酸復制;S區(qū)編碼棘突蛋白,與病毒感染能力相關(guān);E區(qū)編碼囊膜蛋白,負責病毒包膜及病毒顆粒的形成;M區(qū)編碼膜蛋白;N區(qū)編碼核衣殼蛋白,可與病毒基因組宿主RNA互相識別。SARS-CoV-2的RdRp基因在進化樹上與嚴重呼吸綜合征冠狀病毒顯著不同,且N和S基因與其他蝙蝠相關(guān)病毒的同源性低,因此這些基因可作為特異性標志物[16]。E基因與其他冠狀病毒高度相似,僅可作為篩查標志物[21]。

    常見的臨床檢測試劑可分為單靶標和多靶標(雙靶標和三靶標)2種。單靶標使用1組引物和探針靶向SARS-CoV-2單個基因區(qū)域,而多靶標則使用多組引物和探針檢測多個基因區(qū)域。我國獲批的檢測試劑盒主要針對ORF1ab、N和E基因。大部分獲批試劑盒使用內(nèi)標監(jiān)控質(zhì)量,內(nèi)標主要包括人源性內(nèi)標(內(nèi)源性)和合成假病毒內(nèi)標(外源性)。內(nèi)源性內(nèi)標優(yōu)于外源性內(nèi)標,前者可用于監(jiān)控從樣本采集到檢測的全過程,后者只能監(jiān)控抽提和熒光定量檢測的步驟。

    由于SARS-CoV-2 RNA屬于易發(fā)生變異的單鏈RNA,增加檢測靶標數(shù)量能提高檢測準確性。但多種未經(jīng)修飾的引物和探針在單孔檢測體系中會相互干擾,反而會降低擴增效率和檢測敏感性。臨床實驗室應根據(jù)檢測目的選擇檢測靶標,聯(lián)合人源性內(nèi)標監(jiān)控從采樣到檢測的全過程。

    2.2 檢測方法

    在疫情初期,二代測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS)在病毒的鑒定中發(fā)揮了重要作用,憑借NGS技術(shù),僅5 d便獲得了病毒全基因組序列[22],為后續(xù)核酸檢測試劑盒研發(fā)、混合感染鑒別、病毒溯源進化分析、傳播模式預測、突變位點發(fā)現(xiàn)等奠定了重要基礎(chǔ)。多篇基于NGS的文獻證實SARS-CoV-2與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒有79.5%的共同序列[23],發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與蝙蝠相關(guān)冠狀病毒ZC45和ZXC21的同源性約為88%[24]。盡管NGS具備上述優(yōu)勢,也被列入幾個版本的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》,但其檢測周期長、流程復雜、未標準化、缺乏生物信息分析專業(yè)人員、測序深度不足(綜合成本和時間)等問題,使其很難成為臨床實驗室常規(guī)開展的檢測方法。

    實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)是目前臨床上廣泛應用于SARS-CoV-2核酸檢測的方法,具有檢測時間較短、操作便捷、特異性及重復性更好的特征[25]。我國有多家企業(yè)研發(fā)了RT-PCR檢測試劑盒,目前已有17個基于RT-PCR的檢測試劑盒獲得審批。2020年3月,全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質(zhì)量評價報告顯示,已獲批的試劑對2個弱陽性樣本(3.2×103拷貝/mL和640拷貝/mL)的平均檢出率分別為87.8%和77.9%[26]。不同檢測試劑的檢測能力略有差異,因此應盡可能采用不同品牌的檢測試劑對疑似樣本進行復檢,以保證結(jié)果的準確性。疫情初期,緊急獲批的試劑盒研發(fā)時間短,質(zhì)量良莠不齊,因此臨床實驗室應在臨床應用前完成性能驗證,同時在檢測過程中做好質(zhì)量控制,對可疑結(jié)果應及時與臨床溝通。

    由于實驗室硬件、軟件和人力資源有限,加之檢測需求激增,簡便、有效的檢測技術(shù)更受青睞。病毒核酸免抽提法應需而生,但其無法用于檢測胍鹽滅活樣本和混檢篩查[27-29]。等溫擴增技術(shù)在SARS-CoV-2核酸檢測中具有良好的應用前景,包括環(huán)介導等溫擴增[30]、依賴核酸序列擴增[31]、滾環(huán)擴增[32]以及一系列由等溫擴增技術(shù)衍生的方法(如等溫擴增聯(lián)合CRISPRCas13)[33-34]。SARS-CoV-2核酸檢測設(shè)備也在向小型化、自動化、快速簡便的方向發(fā)展,基于整合微流控和恒溫擴增等技術(shù)的集成化的即時檢驗(point-of-care testing,POCT)產(chǎn)品,實現(xiàn)了分子診斷去中心化,可用于基層疫情防控。然而,等溫擴增及其衍生技術(shù)和POCT存在靈敏度不足的缺陷,因此仍需不斷優(yōu)化。

    3 分析后

    《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第七版)》[3]指出,ORF1ab和N基因(或E基因)多個檢測通道同時陽性時,可判為陽性,但陰性結(jié)果不能排除感染,應考慮各環(huán)節(jié)中導致假陰性的因素以及檢測窗口期。對于單通道陽性結(jié)果,不僅要求重新采樣進行復檢,對結(jié)果判定也增加了新的要求,即重新采樣檢測結(jié)果仍為單通道陽性時,可判定核酸檢測結(jié)果為陽性;檢測2種類型樣本均得到單靶標陽性結(jié)果時,應判定核酸檢測結(jié)果為陽性。臨床上多見N基因單靶標陽性的可能原因有以下幾個:(1)試劑盒研發(fā)時,2個基因的檢測靈敏度存在差異;(2)SARS-CoV-2屬于巢病毒目,具有獨特的非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄模式,N基因處于3' 端,有更多轉(zhuǎn)錄機會;(3)N基因的保守度不及ORF1ab基因,與其他冠狀病毒存在交叉反應。

    4 混樣檢測

    2020年6月8日,我國國家衛(wèi)生健康委網(wǎng)站發(fā)布的《關(guān)于加快推進新冠病毒核酸檢測的實施意見》[35]指出,加強核酸檢測工作,做到“應檢盡檢、愿檢盡檢”,這是“外防輸入、內(nèi)防反彈”的重要措施。醫(yī)藥市場分析報告稱,截至2020年年底,我國有將近8億人次SARS-COV-2核酸檢測需求,對應的是超過100億元人民幣的市場規(guī)模[36]。面對龐大的檢測壓力和資源緊缺問題,應探尋有效的解決途徑。

    混檢是血站中篩查獻血人員獲得性免疫缺陷綜合征和丙型肝炎等傳染病時常用的一種檢測方法,分為混合采集、混合樣本和混合模板3種模式。有研究結(jié)果顯示,SARS-CoV-2感染的發(fā)生率<10%時,混檢在理論上可將總體檢測能力至少提高69%[37],但其產(chǎn)生的假陰性結(jié)果易造成負面的社會影響[38]?!蛾P(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測技術(shù)指引的通知》[29]規(guī)定了其適用范圍,規(guī)范了樣本混合流程,指出了具體的注意事項?!蛾P(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸10合1混采檢測技術(shù)規(guī)范的通知》[39]規(guī)范了混采流程,取消了對檢測試劑的方法學限制,提出“選擇檢測限低和靈敏度高的檢測試劑盒”的要求。然而混檢仍存在一些問題:(1)無法監(jiān)控采樣質(zhì)量。獲批試劑通過針對人核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)P基因監(jiān)控樣本采集、抽提和擴增全過程。在臨床實踐過程中,若未檢測到該探針信號,則檢測結(jié)果應被判“無效”,需重新采樣或檢測,而采取混檢方式時,其他樣本中的RNase P基因信號會掩蓋不合格樣本的信號缺如,得到假性“有效”結(jié)果。(2)混檢樣本的復雜性。單個樣本或不同患者存在異質(zhì)性,加之從采樣到檢測全過程中的人為操作影響,增加了混檢樣本的復雜性,可能發(fā)生優(yōu)勢樣本信號掩蓋其他混檢樣本信號,或擴增曲線異常等情況[40]。

    鑒于混檢具有上述缺陷,建議對于發(fā)熱門診有癥狀患者、密切接觸者等高風險人群,直接采用單人份核酸檢測;對低風險人群(感染率<1%)可考慮混檢。

    5 總結(jié)

    準確和快速地識別感染個體是防止SARSCoV-2傳播的重要措施。SARS-CoV-2核酸檢測是目前主要的篩查方法,但該技術(shù)存在漏檢的風險。開展SARS-CoV-2核酸檢測的實驗室應制定標準化操作流程,加強全過程質(zhì)量管理,嚴格執(zhí)行室內(nèi)質(zhì)量控制,定期參與室間質(zhì)量評價,以保障檢測質(zhì)量。

    聯(lián)合多種檢測技術(shù)進行動態(tài)監(jiān)測,才能更真實地反映患者體內(nèi)的SARS-CoV-2核酸載量。對SARS-CoV-2基因組特征、傳播方式和臨床特征進行深入研究,可從根源上了解病毒,促進核酸檢測技術(shù)的發(fā)展,為提高檢測準確性打下堅實的基礎(chǔ)。

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