血小板顆粒釋放機制及其對標本檢驗前變異影響研究進展

張式鴻， 房邦仁， 葉曼曼， 鄧冠華

（1.中山大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510080；2.廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司廣東省醫(yī)用材料血液相容性研究企業(yè)重點實驗室，廣東 廣州 510530）

血液標本檢驗前變異是臨床醫(yī)學檢驗需要加以注意并控制的重要環(huán)節(jié)。導致血液標本檢驗前變異因素有很多，其中血小板活化及其內(nèi)容物釋放對血液標本的檢測影響很大，一方面可改變血清與血漿成分，另一方面可通過對血細胞代謝的影響，進一步改變血清、血漿及血細胞原始狀態(tài)，最終影響檢驗結果。了解血小板釋放機制、調(diào)節(jié)因素及影響因素，能為正確處理標本提供理論依據(jù)，指導檢驗人員盡可能在檢驗前維持標本的原始狀態(tài)，最大限度地減少檢驗前變異，提升檢驗結果的準確性。本文對血小板釋放的機制和調(diào)節(jié)因素及其與標本檢驗前變異的關系進行綜述。

1 血小板釋放的物質(zhì)基礎

血小板直徑為1～3 μm，是血液中體積最小的血細胞，對生理止血、維持毛細血管通透性、完整性及促進凝血等功能的發(fā)揮至關重要。血小板能執(zhí)行這些功能的關鍵在于血小板釋放，而胞質(zhì)內(nèi)含有的α顆粒、致密顆粒、溶酶體顆粒是促進血小板釋放的物質(zhì)基礎[1]。

血小板胞質(zhì)內(nèi)含有的3種顆粒中，α顆粒含量最多、體積最大[1]。通過透射電鏡中可觀察到α顆粒結構從外向內(nèi)依次是：顆粒外膜、管道支持結構、低電子密度區(qū)和高電子密度類核區(qū)。致密顆粒是血小板中含量第二豐富、體積最小的顆粒，每個血小板有3～8個致密顆粒，直徑約為150 nm[2]。溶酶體顆粒體積比α顆粒小，在人體血小板中含量非常低，結構和內(nèi)容物一般是由單層膜包被的圓形顆粒[3]。

2 血小板釋放的機制

血小板釋放的具體機制仍在探索之中，較被認可的說法是1993年S?LLNER等[4]在研究神經(jīng)遞質(zhì)分泌機制過程中提出的膜融合假說，該假說主要由膜融合“引擎”——可溶性N-乙基-馬來酰亞胺敏感因子結合蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive attachment protein receptor，SNARE）蛋白介導。但還需其他分子如Sec1/Munc18（SM）蛋白、N-乙基-馬來酰亞胺敏感融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein，NSF）和可溶性NSF接觸蛋白（soluble NSF attachment protein，SNAP）的協(xié)助才能完成膜融合[4]。SNARE是小分子膜結合蛋白超家族成員，根據(jù)功能不同可分為囊泡膜SNARE和靶膜SNARE。單體囊泡膜SNARE與靶膜SNARE結構上是未折疊的，雖也能自發(fā)結合，但這種結合不穩(wěn)定，需SM蛋白協(xié)助才能形成穩(wěn)定“拉鏈狀”三聯(lián)復合體，稱為Trans-SNARE復合體或SNAREpin。該復合體釋放的大量能量足以克服膜之間的能量和水合力量，實現(xiàn)膜靶向接觸并發(fā)生融合，然后三聯(lián)復合體在NSF、SNAP的幫助下發(fā)生結構變化，形成Sis-SNARE復合體并很快解體，SNARE重新投入下一個循環(huán)。

有研究表明，SNARE介導膜融合機制也是血小板顆粒釋放的主要機制，并與神經(jīng)遞質(zhì)分泌過程有許多相似之處，如分泌機制的啟動信號均為細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，細胞內(nèi)囊泡或顆粒均通過依賴SNARE途徑被“分泌”至細胞膜外[5]。血小板中囊泡膜SNARE包括囊泡相關膜蛋白（vesicle-associated membrane protein，VAMP）-2、VAMP-3、VAMP-7和VAMP-8，靶膜SNARE包括syntaxin-2、syntaxin-4、syntaxin-6、syntaxin-7、syntaxin-11、syntaxin-12、syntaxin-16、syntaxin-17和syntaxin-18[6-8]。KOSEOGLU等[9]發(fā)現(xiàn)，VAMP-7主要分布在擴張血小板外圍，而VAMP-8主要集中在血小板顆粒區(qū)。BANERJEE等[10]的研究表明，VAMP-3在α顆粒內(nèi)吞途徑中發(fā)揮重要作用，而在血小板胞吐作用中發(fā)揮的作用較小。FENG等[11]在體外利用針對VAMP家族、syntaxin-2、SNAP-23單抗也證明SNARE是血小板顆粒分泌途徑中必不可少的因素。GOLEBIEWSKA等[12]在研究血小板膜融合時發(fā)現(xiàn)，syntaxin-8缺失與致密顆粒胞吐作用缺陷有關。

3 血小板釋放的調(diào)節(jié)因素

血小板釋放受多個環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)，起主導作用的是膜融合和活化。其中膜融合環(huán)節(jié)中主要是SM蛋白、Rab蛋白、細胞骨架和膜成分等發(fā)揮主要作用，而血小板表面膜受體、信號通路相關分子、鈣結合類蛋白在活化環(huán)節(jié)中占主導作用。

3.1 膜融合環(huán)節(jié)對血小板釋放的調(diào)節(jié)

3.1.1 SM蛋白的調(diào)節(jié) CARDENAS等[13]在研究SM蛋白在血小板分泌中作用時發(fā)現(xiàn)，缺乏Munc18-1和Munc18-3對血小板胞吐作用沒有影響，但Munc18-2缺乏則可完全抑制α顆粒、致密顆粒、溶酶體顆粒釋放，并削弱血小板聚集和體外血栓形成。

3.1.2 Rab蛋白的調(diào)節(jié) 目前在人體血小板中發(fā)現(xiàn)超過40個Rab蛋白成員[14]，主要通過影響膜融合而調(diào)節(jié)血小板活化及分泌；JALAGADUGULA等[15]的研究結果顯示，因轉(zhuǎn)錄因子RUNX1缺失而導致Rab1B下調(diào)會改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基復合體早期囊泡運輸，最終導致α顆粒中血管性血友病因子含量降低。

3.1.3 細胞骨架的調(diào)節(jié) 與微絲或微管相關類蛋白在血小板內(nèi)顆粒物、囊泡釋放或靶向運輸?shù)冗^程中發(fā)揮非常重要作用，這類蛋白主要包括微管蛋白、肌動蛋白[16-17]等。BEGLEY[16]采用紫杉醇和拉春庫林A分別阻斷凝血酶和驚厥毒素誘導血小板中二磷酸腺苷-核糖基化因子6（adenosine diphosphate-ribosylation factor 6，ARF6）活化后，發(fā)現(xiàn)微管分解和肌動蛋白組裝在血小板激活關鍵信號因子ARF6的激活中發(fā)揮重要作用。GE等[17]的研究表明，細胞骨架F-肌動蛋白通過物理屏障作用來調(diào)節(jié)血小板致密體分泌。

3.1.4 膜成分的調(diào)節(jié) 磷脂酸等脂膜成分和脂膜代謝產(chǎn)物在S N A R E介導膜融合過程發(fā)揮重要作用，但其中脂膜結構變化的機制尚不清楚[18-19]。ZHUKOVSKY等[20]的研究結果顯示，磷脂酸是膜融合過程中酶活化生成的脂質(zhì)底物，且通過生成負膜曲率、與膜融合所需相關蛋白的相互作用和激活與膜重排相關的酶等機制來影響膜融合。

3.2 活化環(huán)節(jié)對血小板釋放的調(diào)節(jié)

3.2.1 血小板表面膜受體的調(diào)節(jié) 根據(jù)功能不同，血小板表面膜受體主要分為活化受體和黏附受體，前者典型代表有血栓素受體、二磷酸腺苷受體和凝血酶受體，后者主要以膠原受體、糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ復合體為代表。有研究表明，血小板膜受體并不均勻分布于膜上，而是常聚集于表面的一些被稱為“脂質(zhì)筏”的微小結構域[21]。任何受體結構或功能異常均可導致血小板對刺激信號不應答或應答不足從而影響釋放。巨大血小板綜合征[22]是一種先天性出血性疾病，其根本原因是血小板表面GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復合體缺失或功能障礙導致血小板聚集功能障礙，致使血小板無法對相應刺激信號，如血管性血友病因子和凝血酶作出有效反應。

3.2.2 信號通路相關分子的調(diào)節(jié) Ca2+、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸、肌醇三磷酸等[23-24]信號分子在血小板分泌中發(fā)揮信號傳遞作用，如這些信號分子工作異常，信號傳遞通路可被阻斷進而影響血小板功能或行為。

3.2.3 鈣結合類蛋白的調(diào)節(jié) 血小板釋放會促進血小板內(nèi)鈣離子濃度升高，同樣細胞內(nèi)鈣離子濃度上升也會促進血小板分泌顆粒物，鈣結合類蛋白通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣水平來控制血小板分泌[25]。

4 血小板釋放對標本檢驗前變異的影響

平均血小板體積是臨床上廣泛應用的血常規(guī)指標，常用于反映血小板體積大小、預測凝血活性和血小板活化。有研究表明，血小板聚集增強和黏附分子表達增加可增大其活力和體積并使其釋放更多的血栓素A2和β血小板球蛋白[26]。外界環(huán)境某些刺激可能改變離體血小板形態(tài)、體積，并使其活化和釋放，而后可能對標本檢驗前變異造成影響[27-28]。另外，外部剪切力是影響血小板聚集和活化因素之一。LEE等[29]的研究表明，在更大剪切力作用下膠原表面血小板聚集更顯著。DENG等[30]的研究表明，高剪切力作用下血小板激活需通過細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應來實現(xiàn)。RAHMAN等[31]的研究結果顯示，增大上游剪切力可增強下游血小板活化程度；另外，溫度也會影響血小板的活化和分泌。HORIOK等[32]用-20 ℃低溫處理小鼠后，發(fā)現(xiàn)低溫可激活脾臟中的血小板，并使其釋放顆粒中的血小板第4因子（platelet factor 4，PF4）和前血小板堿性蛋白。WOOD等[33]的研究表明，低溫存儲后血小板表面膜糖蛋白（GPⅠb、GPⅨ、GPⅡb和GPⅣ）表達會下降，而血小板活化標志物PF4、P-選擇素表達會增加。JOHNSON等[34]的研究表明，與室溫儲存的血小板相比，低溫和冷藏保存的血小板中微顆粒含量明顯升高，且凝血酶生成速度更快。此外，標本儲存容器及添加物也會致使血小板活化，并影響其釋放血小板源性微顆粒、可溶性P-選擇素、血小板反應蛋白（thrombospondin，TSP）。MUSSBACHER等[35]在常溫下采用不同抗凝劑（[檸檬酸-茶堿-腺苷-雙嘧達莫（citrate-theophylline-adenosinedipyridamole，CTAD）、酸檸檬酸-右旋糖（acid-citrate-dextrose，ACD）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、檸檬酸鹽、肝素）抗凝并分離血漿，監(jiān)測血小板中儲存因子，結果顯示CTAD和ACD抗凝血漿標本常溫儲存6 h內(nèi)，其PF4和TSP-1含量最低、變化最??；他們還發(fā)現(xiàn)在4 ℃條件下制備的血漿標本中，CTAD抗凝標本中PF4和TSP-1含量在24 h內(nèi)最穩(wěn)定。MANNU?等[36]在研究EDTA、檸檬酸鈉、硫酸鎂抗凝效果時發(fā)現(xiàn)，在相同血小板體積范圍內(nèi)，EDTA抗凝血漿標本中血小板活化產(chǎn)物P-選擇素表達最高。呂明恩等[37]研究原發(fā)性血小板減少癥出血患者出血風險與血小板活化相關性時，發(fā)現(xiàn)血小板活化前、后α顆粒分泌的P-選擇素的表達和比值與血小板計數(shù)顯著相關。

5 小結與展望

綜上所述，血小板釋放反應在血小板參與的各種反應中占重要地位。體內(nèi)許多因素，如炎癥、肺部疾病、心肌梗死等能導致血小板異常激活而釋放顆粒內(nèi)容物，使血漿環(huán)境里物質(zhì)種類和濃度發(fā)生變化，物質(zhì)代謝、信號通路等受到干擾，導致機體止凝血功能改變，并產(chǎn)生相應的臨床癥狀。體外由于儲血材料的介入，血小板激活釋放過程更復雜。這就意味著，實驗室獲得的看似穩(wěn)定的血清或血漿標本實際上可能并不穩(wěn)定，這樣的標本將無法保證檢測項目的準確性和重復性。

未來的研究如能詳細闡明血小板釋放內(nèi)容物在血漿中的代謝機制及其與其他細胞或可溶性物質(zhì)發(fā)生反應的機制，并建立準確評價血小板釋放的方法和體系，將能為臨床實驗室提供控制檢驗前變異因素的理論依據(jù)，為生物醫(yī)用材料血液相容性研究提供新思路，也能為制藥工程研究提供新方向。