球蘭屬內(nèi)生菌研究進展

王玉芬

（大同市城市園林綠化研究中心，山西大同 037000）

1 球蘭屬植物

球蘭屬（Hoya）是蘿藦科（Asclepaidaceae）中牛奶菜族（Marsdensieae）的一個屬，球蘭屬植物在中國的分布區(qū)域有廣東、云南、貴州、西藏、海南、廣西、福建和臺灣等（P.T.Li et al.，1997）。

《全國中草藥匯編》中，記錄民間使用球蘭一般取其莖、葉或全株入藥，或絞汁或水煎服用，外用時搗爛敷于患處，球蘭之所以能起到治療疾病的效用，與球蘭中含有的有效化學成分密切相關(guān)。球蘭屬植物含有多種化學成分，包括孕（甾）烷、孕（甾）糖苷脂類、甾醇、黃烷醇、三萜、倍半萜等。Kyogoku 研究了日本廣島市民的疾病治療中出現(xiàn)的球蘭過敏引發(fā)的職業(yè)性哮喘，在球蘭中發(fā)現(xiàn)了2 種螨致敏的過敏原；Alen 等發(fā)現(xiàn)H.diversifolia的甲醇提取物對松材線蟲具有體內(nèi)抗癌活性；球蘭屬植物葉片中含有植物甾醇和α-谷甾醇具有較強的抗炎、消炎等生物活性的作用。

2 球蘭屬植物內(nèi)生菌的鑒定

真菌的鑒定主要依托于其形態(tài)學特征，但對于內(nèi)生真菌而言，特殊的生活環(huán)境決定了它與常規(guī)的植物病原菌鑒定不同，一是內(nèi)生真菌在與宿主植物長期的共同進化過程中，為了適應其內(nèi)生的環(huán)境，某些形態(tài)特征發(fā)生改變；二是用來培養(yǎng)繁殖內(nèi)生菌的培養(yǎng)基自身具有選擇性，也不能正常還原其真實的生存環(huán)境，培養(yǎng)過程本來就是一個重新選擇的過程，具有大概率的不確定性，結(jié)果無法真實反映原始群落結(jié)構(gòu)。

在內(nèi)生菌中有一些菌株不產(chǎn)孢，給內(nèi)生菌的鑒定帶來了困難，例如一些寄生于植物體內(nèi)的炭角菌很難產(chǎn)生有性或無性孢子，不易從形態(tài)學上去鑒定。常規(guī)的研究是根據(jù)不產(chǎn)孢株在培養(yǎng)基上的形態(tài)特征將其劃分為不同的形態(tài)型（morphotype），但是這種形態(tài)型不具有真正的分類意義，在調(diào)查油松內(nèi)生真菌的過程中，將分離到的不產(chǎn)孢菌株根據(jù)它們的培養(yǎng)特征劃分為74 個形態(tài)型，然后通過rDNA 中的ITS 和5.8S 基因序列分析，發(fā)現(xiàn)74 個形態(tài)型菌株屬于擔子菌綱和子囊菌綱中的64 個分類單元，與形態(tài)型的劃分存在一定的差異。

隨著分子生物學技術(shù)的成熟，利用分子生物學手段進行分類已經(jīng)廣泛應用，該法可信度高，比較常用的分子生物學方法包括DNA 指紋技術(shù)、分子雜交、rDNA序列分析等。對于真菌物種鑒定來說，僅使用形態(tài)學方法面臨一些問題，形態(tài)學鑒定耗時較多，有些類群缺乏足夠的鑒定特征，例如單細胞和不產(chǎn)孢的類群。目前學者們親睞于使用DNA 序列分析的方法推斷類群間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，同時結(jié)合形態(tài)學特征進行物種鑒定，既可靠又節(jié)約時間。

目前最廣泛用于分子系統(tǒng)學研究的基因片段是ITS 區(qū)，該基因片段在真菌的分子系統(tǒng)學研究中有著舉足輕重的作用。迄今為止，基于ITS 區(qū)序列分析，已成功地界定了多種真菌類群及其若干個體。然而，ITS序列變異位點不夠多并不能用來區(qū)分所有的種，早前對鏈格孢5 個種菌株的18S rDNA、5.8S rDNA 及ITS1、ITS2 進行了序列分析就證明，基于ITS 序列不適合用于部分類群的區(qū)分。

RPB2 是一個具有較快的進化速率的單拷貝基因，同時該種RNA 聚合酶亞基在細胞發(fā)揮的作用很難受細胞結(jié)構(gòu)或者生理學的影響。前人通過比較油桐葉枯病病原菌的培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征并結(jié)合分析核糖體rDNA ITS 序列以及RPB2 序列和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系鑒定病原菌；RPB1、RPB2 這2 個蛋白編碼基因在研究擔子菌的系統(tǒng)發(fā)育學關(guān)系中，解決很多rDNA 解決不了的問題，線粒體Cytb 基因應用于真菌種內(nèi)和種間的分類、鑒定，同時是作為進化和系統(tǒng)發(fā)生分析方面理想的分子標記，在國際上已經(jīng)得到了很高的評價。

線粒體基因組具有自己特定基因組成、遺傳密碼和復制方式。真菌線粒體基因組中的編碼蛋白基因均是線粒體自身特有的與氧化磷酸化和線粒體蛋白質(zhì)的合成相關(guān)的基因，構(gòu)建線粒體基因的系統(tǒng)進化樹能夠為真菌的鑒定提供參考，糾正部分真菌分類學的錯誤（張波，2007）。秦培剛等（2011）對水稻絲核菌AGIIA的線粒體ATP6 基因和Cytb 基因以及從NCBI/Genbank 中各真菌的對應基因進行同源性比對，構(gòu)建了ATP6 基因和Cytb 基因的系統(tǒng)進化樹從而為水稻絲核菌的分類鑒定提供依據(jù)。賀丹（2007）擴增線粒體Cytb基因發(fā)現(xiàn)該基因分析能夠糾正并完善真菌地霉、粘束孢霉及相關(guān)菌株一些形態(tài)學鑒定和分類上的不確切之處。線粒體Cytb 基因應用于真菌種內(nèi)和種間的分類、鑒定，同時是作為進化和系統(tǒng)發(fā)生分析方面理想的分子標記，在國際上已經(jīng)得到了很高的評價。

3 炭角菌的研究進展

在真菌索引上，炭角菌屬名下有700 多個混名，是炭角菌科中最大的一個屬。炭角菌的主要特征有：圓柱形的子囊，深色的單細胞有裂縫的子囊孢子，成熟的炭角菌有垂直的，圓柱形的或是棍棒狀的子座，分生孢子分布于稠密的柵欄組織。較多的炭角菌分離自螞蟻、白蟻的巢穴。在俄羅斯分離到3 個炭角菌，鑒定為新種，分別是Xylaria lepidota、X.sibirica和X.primorskensis。

早期對炭角菌的研究集中于昆蟲巢穴以及根部腐爛的研究；然而，炭角菌分類混亂，近年來較多的研究集中在炭角菌系統(tǒng)發(fā)育方面，通過β-微觀蛋白、RPB2、α-肌動蛋白序列研究炭角菌屬同白蟻蟻穴炭角菌屬和Xylarioideae的亞科之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

鄧叔群在《中國的真菌》中描述了52 種國產(chǎn)炭角菌，其中分布最廣的有6 個種，它們大多生于腐木或木材上，黑柄炭角菌（X.nigripes） 和巴西炭角菌（X.brasiliensis）生于地上，果生炭角菌（X.carpophila）生于楓香的落果上。炭角菌中研究最多的當屬黑柄炭角菌（X.nigripes），其菌核又名烏苓參、烏麗參、雷震子和吊金針等。它生長于地下2～20m 的土棲白蟻廢棄的蟻巢上，研究表明，烏靈菌粉具有調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)靜安眠、腦保護、抗疲勞、耐缺氧、抗衰老、利尿、降低血清尿素氮的作用等。

前人對炭角菌科的次級代謝產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)已經(jīng)進行了廣泛的研究。研究發(fā)現(xiàn)一些代謝物具有藥理學作用，例如抑菌特點、抗癌性、抗癌抗菌素等。從Palicourea marcgravii分離到的Xylaria sp.顯示出抗菌活性；Xylaria sp.BCC4297 產(chǎn)生的一個新的復合物對癌細胞株具有細胞毒性作用；大部分的Xylariaceous真菌已經(jīng)被證實有很強的降解纖維素和木質(zhì)素能力，造成生理學上的腐爛，有效地降解了擔子菌的基質(zhì)，目前促進衰退作用的酶類已經(jīng)被大規(guī)模地開發(fā)。

用于研究細胞骨架的第一個藥物是細胞松弛素B（Cytochalasins B），它是真菌分泌的生物堿，在細胞內(nèi)同微絲的正端結(jié)合，可以引起F-肌動蛋白解聚，進而阻斷亞基的聚合。把細胞松弛素加到活細胞以后，肌動蛋白纖維骨架消失，會導致動物細胞的各種活動癱瘓，包括細胞的移動、吞噬作用、胞質(zhì)分裂等，它對微管不會起作用，也不抑制肌收縮，炭角菌在生長過程中或是在代謝過程中可分泌細胞松弛素，從而為人類提供了開發(fā)可利用的天然藥物資源。

Abate et al（1997）從X.obovata ADA-228 的代謝產(chǎn)物中分離得到可用作驅(qū)蟲劑的Clonostachydiol，同時發(fā)現(xiàn)這種菌類在發(fā)酵后期會形成許多的被氧化的細胞松弛素；Pittayakhajonwut 等從X.mellisii BCC 培養(yǎng)物中分離到了細胞松弛素C 和細胞松弛素D，Isaka 等對菌株Xylaria sp.BCC 21097 次級代謝產(chǎn)物的研究表明該菌次級代謝產(chǎn)物可以抵抗幾種癌細胞系；劉小莉（2007)評價銀杏內(nèi)生菌Xylaria sp.子實體的抗氧化活性認為Xylaria sp.是一種潛在的抗氧化劑，胡志鈺（2008）從Xylaria sp.NCY-2 菌株液體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中分離并鑒定了21 種化合物，對分離得到的新化合物進行了抗菌和抗腫瘤活性測定，結(jié)果表明它們具有抗菌和抗腫瘤的活性。從研究中可以發(fā)現(xiàn)，炭角菌屬類的真菌具有大量的活性物質(zhì)，而且它的一級以及次級代謝產(chǎn)物可以產(chǎn)生許多抑菌、抗腫瘤、抗氧化等較罕見的化合物，對今后研究具有藥用價值的代謝產(chǎn)物或者具有抗癌性等天然產(chǎn)物具有較高的引導性。