茶樹(shù)內(nèi)生菌的研究進(jìn)展

張華琳，王科翰，陳雪冰，李東育，張欣欣

（信陽(yáng)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000）

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是一類(lèi)生活在健康植株的各種組織或器官中的微生物，這些微生物不會(huì)導(dǎo)致宿主植物產(chǎn)生明顯的病害癥狀，能夠與宿主植物互惠共生、協(xié)同進(jìn)化。常見(jiàn)的植物內(nèi)生菌類(lèi)群主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌。自從第一株植物內(nèi)生菌被分離鑒定出來(lái)以后，植物內(nèi)生菌就作為一類(lèi)重要的微生物資源受到了廣泛地關(guān)注。大量研究發(fā)現(xiàn)，許多內(nèi)生菌能夠穩(wěn)定存在宿主植物內(nèi)部組織或器官中，在植物體內(nèi)完成獨(dú)立分裂繁殖，表現(xiàn)出豐富的群落多樣性。

茶葉作為一種十分重要的經(jīng)濟(jì)作物，由于保健功能以及獨(dú)特的香氣影響著人們的生活。茶樹(shù)內(nèi)生菌主要是指生長(zhǎng)在茶樹(shù)組織或器官內(nèi)不會(huì)引發(fā)茶樹(shù)病變的微生物。茶樹(shù)內(nèi)生菌由于生長(zhǎng)在茶樹(shù)的組織和器官內(nèi)，通過(guò)與茶樹(shù)之間的相互作用，影響著茶樹(shù)的生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)狀況、代謝產(chǎn)物以及茶葉的風(fēng)味。因此，研究茶樹(shù)內(nèi)生菌的分離鑒定、分布和生物學(xué)功能等問(wèn)題十分重要。本文對(duì)茶樹(shù)內(nèi)生菌多種研究?jī)?nèi)容進(jìn)行分析和總結(jié)，為茶樹(shù)內(nèi)生菌的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供一定的參考和思路。

1 茶樹(shù)內(nèi)生菌的分離和鑒定

茶樹(shù)內(nèi)生菌的分離和鑒定是研究茶樹(shù)內(nèi)生菌的基礎(chǔ)。茶樹(shù)內(nèi)生菌能否成功分離的關(guān)鍵是茶樹(shù)組織塊的表面消毒，依據(jù)茶樹(shù)組織器官、內(nèi)生菌類(lèi)型以及分離效果等差異，茶樹(shù)組織塊的消毒方式也不盡相同。目前已有大量研究，基于傳統(tǒng)的分離方式，通過(guò)不斷優(yōu)化分離的方法，已經(jīng)達(dá)到了比較好的分離效果，分離得到的內(nèi)生菌一般會(huì)依據(jù)形態(tài)特征和核酸分析等方法進(jìn)行初步鑒定。

劉詩(shī)詩(shī)[1]對(duì)茶樹(shù)桂香18號(hào)的根、莖、葉進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離純化，共分離出內(nèi)生真菌24株，并對(duì)24株內(nèi)生真菌進(jìn)行7種常見(jiàn)植物病原菌的抑菌活性檢測(cè)，其中從莖中分離的J-7內(nèi)生真菌具有較強(qiáng)的廣譜抑菌性，且抑菌效果明顯，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法，鑒定該菌株屬于鐮刀菌屬（Fu‐sarium.sp）。李方舟[2]利用培養(yǎng)依賴(lài)型的方法對(duì)新鮮普洱茶葉片內(nèi)生菌進(jìn)行分離、純化，得到32株內(nèi)生細(xì)菌和14株內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌FZ06為芽孢桿菌屬貝萊斯芽孢桿菌種，命名為Bacillus velezensis FZ06。單文娜[3]等人通過(guò)對(duì)福建茶樹(shù)內(nèi)生放線菌的研究，從16個(gè)茶樹(shù)品種的根、莖、葉中分離獲得46株內(nèi)生放線菌，鑒定為11個(gè)科，13個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)菌株為鏈霉菌屬。此外，研究也表明了茶樹(shù)內(nèi)生放線菌具有廣泛抑菌、抗菌和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的活性。茶樹(shù)內(nèi)生放線菌同茶樹(shù)內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌一樣具有巨大的資源開(kāi)發(fā)價(jià)值。然而，現(xiàn)階段對(duì)于茶樹(shù)內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌的分離和鑒定研究很多，而對(duì)內(nèi)生放線菌的研究很少。

2 茶樹(shù)內(nèi)生菌的分布特點(diǎn)

茶樹(shù)內(nèi)生菌種類(lèi)豐富，具有多樣性。主要表現(xiàn)在：不同茶樹(shù)品種其內(nèi)生菌組成具有明顯差異，同種茶樹(shù)不同組織器官中的內(nèi)生菌種類(lèi)和數(shù)量也存在明顯差異。汪立群[4]等人對(duì)處于同一栽培管理水平下種植的紫娟和云抗10號(hào)的內(nèi)生菌的多樣性進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明：不同茶樹(shù)品種間內(nèi)生菌群落組成存在較大差異。從紫娟中分離得到內(nèi)生真菌5株，分屬于4個(gè)屬，從云抗10號(hào)中分離得到內(nèi)生真菌共12株，分屬于4個(gè)屬?，F(xiàn)階段可以利用Ⅰllumina MiSeq測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同茶樹(shù)品種的內(nèi)生菌群落進(jìn)行分析，研究不同茶樹(shù)品種對(duì)其內(nèi)生菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響。此外，也可以研究地理位置、氣候變化、茶葉葉齡、樣品采摘時(shí)間等多種因素對(duì)茶樹(shù)內(nèi)生菌分布的影響，并進(jìn)一步探究這些因素是如何影響茶樹(shù)內(nèi)生菌群落分布的。

3 茶樹(shù)內(nèi)生菌的生物學(xué)作用

茶樹(shù)內(nèi)生菌存在于健康茶樹(shù)的各種組織和器官內(nèi)部，與茶樹(shù)互惠互利，在一定程度上對(duì)茶樹(shù)的生長(zhǎng)具有直接影響，通過(guò)影響茶樹(shù)的代謝產(chǎn)物及進(jìn)程，進(jìn)而影響茶樹(shù)的品質(zhì)以及茶葉的風(fēng)味。而茶樹(shù)內(nèi)生菌的存在，不僅能夠促進(jìn)茶樹(shù)的生長(zhǎng)，而且在提升茶樹(shù)對(duì)Al3+耐受力，降解茶樹(shù)植株中積累的農(nóng)藥，防治茶樹(shù)病原微生物，促進(jìn)茶葉成分轉(zhuǎn)化等方面也發(fā)揮了重要的作用。

3.1 促進(jìn)茶樹(shù)的生長(zhǎng)

在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，宿主植物與內(nèi)生菌相互作用，促進(jìn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素的合成，通過(guò)直接作用促進(jìn)植株的生長(zhǎng)。曾秀麗[5]等人用分子遺傳學(xué)方法，證實(shí)了從紫娟茶樹(shù)中分離得到的水生草螺菌在茶樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中具有多條生長(zhǎng)素合成途徑。合成的生長(zhǎng)素對(duì)茶樹(shù)的生長(zhǎng)具有一定的調(diào)節(jié)作用，具有顯著的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)在重金屬脅迫下，茶樹(shù)內(nèi)生菌可以通過(guò)改變土壤根系環(huán)境的pH值，釋放胞外酸性磷酸酶，溶解磷酸鹽，通過(guò)螯合、離子交換等多種方式，提高植物對(duì)于磷、鉀土壤肥料的吸收和利用，間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)[6]。

3.2 促進(jìn)茶樹(shù)對(duì)鋁的耐受力

在酸性土壤條件下，鋁毒是限制植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一。土壤中Al3+的過(guò)量累積，對(duì)植物的影響主要表現(xiàn)在：破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響酶活性和礦質(zhì)元素的吸收，抑制遺傳物質(zhì)的合成，抑制根、莖、葉的生長(zhǎng)等。

茶樹(shù)作為Al3+的高富集植物，Al3+主要積累在根部。研究表明，內(nèi)生菌可提高茶樹(shù)對(duì)鋁的耐受性。可以采用平板對(duì)峙等鑒定方法從茶樹(shù)中分離并篩選出提高茶樹(shù)耐鋁性的內(nèi)生菌，然后對(duì)其進(jìn)行Al3+吸附實(shí)驗(yàn)，探究分離鑒定出的內(nèi)生菌是否具有提高茶樹(shù)對(duì)鋁的耐受力的能力。武平安[7]以小麥、茶樹(shù)為材料探究茶樹(shù)內(nèi)生青霉菌的耐鋁特性，證明了青霉菌對(duì)于植物解除鋁脅迫具有一定的作用，茶樹(shù)內(nèi)生青霉菌在PDA培養(yǎng)基上可耐受200 mmol/L Al3+。由此可見(jiàn)，茶樹(shù)抗鋁毒的特性與其內(nèi)生菌有著密切聯(lián)系，但是茶樹(shù)內(nèi)生菌是如何提高茶樹(shù)對(duì)鋁的耐受力的機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步深入研究探討。

3.3 降解茶樹(shù)中積累的農(nóng)藥

茶葉是我國(guó)重要的出口產(chǎn)品，近年來(lái)隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民的生活質(zhì)量不斷提升，食品安全問(wèn)題成為關(guān)注的焦點(diǎn)。茶葉的農(nóng)藥殘留問(wèn)題受到高度的重視，農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為限制我國(guó)茶葉出口的一個(gè)關(guān)鍵因素之一。據(jù)調(diào)查得知，各地區(qū)茶葉農(nóng)藥殘留檢出率普遍較高，目前關(guān)于茶樹(shù)內(nèi)生菌降解農(nóng)藥的生物降解方法鮮有報(bào)道。

王曉霞[8]等人從龍井茶葉片中篩選分離得到能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥的內(nèi)生真菌ES-4，并且，研究發(fā)現(xiàn)主要是由于內(nèi)生真菌ES-4產(chǎn)生的降解酶能夠?qū)τ袡C(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行有效降解，證明了茶樹(shù)中存在能夠降解農(nóng)藥的功能性?xún)?nèi)生真菌。所以可以針對(duì)多種不同的農(nóng)藥，設(shè)計(jì)試驗(yàn)分離鑒定篩選對(duì)各種農(nóng)藥起降解作用的茶樹(shù)內(nèi)生菌，并探究其降解農(nóng)藥的機(jī)制，為茶葉農(nóng)藥殘留問(wèn)題提供一種新的解決思路。

3.4 防治茶樹(shù)病原微生物

在茶樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中，茶樹(shù)能夠與其內(nèi)生菌相互作用，提高茶樹(shù)對(duì)病原微生物的抗性。李雪嬌[9]從油茶健康的葉片上，通過(guò)平板對(duì)峙、16SrDNA測(cè)序等鑒定方法，分離鑒定得到一株對(duì)油茶軟腐病病菌具有顯著抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌，編號(hào)為L(zhǎng)46的淀粉芽孢桿菌，此細(xì)菌通過(guò)導(dǎo)致軟腐病菌菌絲畸變，使細(xì)胞破碎死亡，抑制其生長(zhǎng)，達(dá)到病害的防治作用。黃曉琴[10]等人采用同樣的分離鑒定方法，從茶樹(shù)健康組織上篩選得到能夠顯著抑制冰核細(xì)菌生長(zhǎng)的內(nèi)生菌，鑒定為解淀粉芽孢桿菌Y1，防治茶樹(shù)霜凍害。張林平[11]等人通過(guò)平板對(duì)峙、發(fā)酵復(fù)篩的方法，從健康油茶葉片中分離鑒定得到6株內(nèi)生細(xì)菌菌株，其對(duì)油茶炭疽病具有較強(qiáng)的拮抗作用，其中3株為芽孢桿菌屬，3株為梭形芽孢桿菌屬，其抑菌率可高達(dá)82.4%，最低為66.0%。因此，利用茶樹(shù)內(nèi)生菌自身優(yōu)勢(shì)，能夠最大限度的發(fā)揮生物防治作用，有效減少病菌對(duì)茶樹(shù)的侵害作用，幫助茶樹(shù)抵抗脅迫環(huán)境，對(duì)于茶的生產(chǎn)和發(fā)展具有重要的意義和價(jià)值。

3.5 促進(jìn)茶葉成分轉(zhuǎn)化

我國(guó)對(duì)茶的種植可以追溯到漢朝時(shí)期，茶樹(shù)是一種良好的經(jīng)濟(jì)作物，含有多種藥用成分，葉片制成的茶為一種健康的飲料。茶樹(shù)與其內(nèi)生菌相互作用，能夠有效促進(jìn)茶葉成分的轉(zhuǎn)化從而改善茶葉的品質(zhì)，形成獨(dú)特的風(fēng)味。發(fā)酵是形成茶色、茶香、茶味特征的關(guān)健工藝，在多種制茶過(guò)程中，往往需要進(jìn)行一定程度的發(fā)酵，而發(fā)酵很大程度是多種微生物和茶樹(shù)共同作用的結(jié)果，茶樹(shù)內(nèi)生菌也在發(fā)酵過(guò)程中起到重要作用。

路偉堯[12]通過(guò)對(duì)普洱茶生長(zhǎng)環(huán)境的空氣微生物、茶葉中的內(nèi)生菌、制作發(fā)酵過(guò)程中的微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同品種普洱茶制備過(guò)程中存在的微生物不同，普洱茶獨(dú)特風(fēng)味及品質(zhì)與茶樹(shù)內(nèi)生菌的代謝活動(dòng)有著直接關(guān)系。多酚氧化酶在茶樹(shù)生長(zhǎng)代謝過(guò)程及茶葉制作加工中發(fā)揮極大的作用。所以，可以采用鑒別培養(yǎng)基篩選法，以酚類(lèi)物質(zhì)為底物，從茶樹(shù)內(nèi)生菌中篩選得到產(chǎn)多酚氧化酶的內(nèi)生菌菌株，探究其促進(jìn)茶葉成分轉(zhuǎn)化的機(jī)制。一些內(nèi)生菌還可能產(chǎn)生天然色素，所以可以探究這些內(nèi)生菌產(chǎn)生的微生物色素能否影響茶的成色。

3.6 影響茶樹(shù)次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生

茶樹(shù)作為多年生常綠木本植物，次級(jí)代謝產(chǎn)物含量豐富，如茶多酚、表兒茶素、咖啡堿、茶氨酸等具有降脂、抗氧化、消炎抑菌、緩解心理壓力等多種功效。研究表明，內(nèi)生菌能夠參與宿主植物體內(nèi)的次生代謝途徑，誘導(dǎo)合成多種代謝產(chǎn)物。

常慢慢[13]以茶和油茶組織培養(yǎng)苗為材料，對(duì)分離得到的內(nèi)生菌進(jìn)行UPLC-MS/MS鑒定，證明了茶樹(shù)內(nèi)生菌能夠以氨基酸為底物高效合成茶氨酸，當(dāng)以賴(lài)氨酸為底物時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高。所以，可以通過(guò)茶樹(shù)內(nèi)生菌與茶樹(shù)組培苗共培養(yǎng)方法，分離篩選得到能夠促進(jìn)茶樹(shù)組培苗生長(zhǎng)的內(nèi)生菌，并探究這些內(nèi)生菌是否可以影響宿主茶樹(shù)代謝產(chǎn)物，如茶多糖、咖啡堿以及兒茶素的含量。目前，內(nèi)生菌對(duì)茶樹(shù)有益代謝產(chǎn)物合成的促進(jìn)是提升茶葉品質(zhì)的一個(gè)重要方向，因此，徹底研究茶樹(shù)內(nèi)生菌與茶樹(shù)代謝產(chǎn)物積累的關(guān)系可提升茶葉的品質(zhì)進(jìn)而提升茶葉的經(jīng)濟(jì)效益。

4 展望

目前，關(guān)于禾本科植物內(nèi)生菌的研究較為豐富，但對(duì)茶樹(shù)內(nèi)生菌的研究較淺，多數(shù)研究都停留在茶樹(shù)內(nèi)生菌的分離和鑒定上，茶樹(shù)內(nèi)生菌對(duì)茶樹(shù)生命活動(dòng)影響的具體作用機(jī)制還不夠清晰。茶樹(shù)內(nèi)生菌由于生長(zhǎng)在茶樹(shù)的組織和器官內(nèi)，通過(guò)與茶樹(shù)之間的相互作用，影響著茶樹(shù)對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境的應(yīng)答、生長(zhǎng)狀況、代謝產(chǎn)物以及茶葉的風(fēng)味。因此，需要更加深入地研究，清晰內(nèi)生菌與茶樹(shù)之間相互作用的機(jī)制，為茶葉生長(zhǎng)和生產(chǎn)提供一定的指導(dǎo)，同時(shí)可以更好地開(kāi)發(fā)植物內(nèi)生菌的資源，創(chuàng)造一定的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。