衍生化技術(shù)在MALDI質(zhì)譜成像中的應(yīng)用進展

王珊珊，張 強，郭寅龍

(1.長安大學(xué)理學(xué)院，陜西 西安 710064；2.河南警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系，河南 鄭州 450046；3.中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所，金屬有機化學(xué)國家重點實驗室，上海有機質(zhì)譜中心，上海 200032)

質(zhì)譜成像技術(shù)可以原位測定樣本切片表面分子相對含量分布，與其他生物成像技術(shù)相比，該技術(shù)可以在單次質(zhì)譜成像實驗中獲得多個目標化合物相對含量分布的可視化圖像，具有靈敏度高、無需標記等優(yōu)點。質(zhì)譜成像技術(shù)有不同的離子化方式，目前最常見的有次級離子質(zhì)譜(secondary ion mass spectroscopy, SIMS)成像[1-5]、解吸電噴霧離子化(desorption electrospray ionization, DESI)質(zhì)譜成像[6-8]以及基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜成像(MALDI MSI)[9]。其中，MALDI MSI由范德堡大學(xué)的Richard Caprioli教授等[10]于1997年提出后，現(xiàn)已成為應(yīng)用廣泛且較為成熟的質(zhì)譜成像技術(shù)。MALDI MSI具有較高的靈敏度及空間分辨率，相比于DESI和SIMS質(zhì)譜成像，其可以耐受一定濃度的鹽和緩沖溶液，實現(xiàn)較寬質(zhì)量區(qū)間的化合物成像分析。另外，MALDI MSI的成像空間分辨率可以低至10 μm，對于不同類型的樣本，例如植物組織[11-12]、動物組織[13-14]、毛發(fā)樣本[15-17]、指紋樣本[18-19]等均能實現(xiàn)目標分析物的成像分析。

雖然MALDI MSI的優(yōu)勢突出，但是仍有自身的局限性。首先，MALDI MSI檢測靈敏度有限，只能應(yīng)用于組織中相對高豐度、高離子化效率的化合物的成像，例如脂質(zhì)[20-22]和蛋白[23-25]等；對于脂肪酸、氨基酸及一些小分子藥物等豐度低、離子化效率低的化合物的成像分析仍然極具挑戰(zhàn)。另外，MALDI MSI中應(yīng)用的基質(zhì)所產(chǎn)生的信號峰還會對小分子化合物的成像分析產(chǎn)生極大的干擾，因此通過在樣本上預(yù)先對待分析物進行原位衍生化后再成像分析是非常必要的。

衍生化方法是一種通過將目標化合物與衍生化試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而為響應(yīng)較差的目標化合物帶上性質(zhì)修飾基團，進而改變化學(xué)性質(zhì)，并將其定量轉(zhuǎn)化為信號響應(yīng)較強的化合物?；瘜W(xué)衍生化方法可以追溯到20世紀60年代，對于氨基酸的快速乙?；磅セ磻?yīng)的應(yīng)用，該衍生化反應(yīng)的目的是為了改善氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析中蛋白、多肽中氨基酸的定性問題，其中三氟乙酸酐和甲醇作為衍生化試劑用于氨基酸的快速乙?；王セ磻?yīng)[26]。經(jīng)過多年的發(fā)展，衍生化方法已在GC-MS[27-28]、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatograph-mass spectrometer, LC-MS)[29-31]和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI MS)[32-34]中得到了廣泛應(yīng)用，尤其是對于離子化效率低、豐度低的目標化合物的定性定量分析展示了其獨特的優(yōu)勢。將衍生化方法應(yīng)用于MALDI MSI中，用于改善目標化合物的質(zhì)譜響應(yīng)，對于克服MALDI MSI應(yīng)用中的局限性，拓展其應(yīng)用范圍具有重要意義。

本文將綜述MALDI質(zhì)譜成像的原理、前處理方法及近年來開發(fā)的針對不同活性基團的衍生化方法，并總結(jié)該研究方向面臨的挑戰(zhàn)以及未來的發(fā)展趨勢。

1 MALDI MSI的基本原理

MALDI的解吸離子化機理示于圖1。激光照射到樣品表面，樣品吸收激光發(fā)生能量傳遞，并將分析物濺射到氣相中實現(xiàn)離子化。由于很多樣品分子不吸收激光，所以在樣品前處理時會預(yù)先將目標分析物與具有紫外吸收的化合物(基質(zhì))混合，共結(jié)晶后進行目標分析物的解吸離子化，在此過程中，基質(zhì)起到了吸收激光、傳遞能量和輔助離子化的作用。

圖1 MALDI原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of MALDI

MALDI MSI是在MALDI MS基礎(chǔ)上進一步發(fā)展的技術(shù)，其基本原理是通過在切片樣本的每個像素點進行MALDI MS分析，得到一張平均質(zhì)譜圖，然后通過質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)的整合和處理，獲得數(shù)據(jù)的可視化圖像。

MALDI MSI在數(shù)據(jù)采集過程中，首先將涂覆好基質(zhì)的切片樣本網(wǎng)格化為微米級的像素點，然后在每個像素點中獲得一張平均質(zhì)譜圖，圖中目標分析物的峰強度在經(jīng)過提取后可以與色彩強度一一對應(yīng)，對應(yīng)后的目標分析物峰強度分布以圖像的形式呈現(xiàn)出來，從而得到目標分析物在樣本表面相對含量分布的可視化圖像。由于一張質(zhì)譜圖中包含不止一種化合物的信號峰，所以單次質(zhì)譜成像實驗便可同時獲得多個目標化合物在樣本表面相對含量分布的可視化圖像。這是質(zhì)譜成像技術(shù)相比于其他生物成像技術(shù)的獨特優(yōu)勢。

2 衍生化技術(shù)在MALDI MSI中的應(yīng)用流程

傳統(tǒng)的MALDI MSI實驗通常包括樣本冷凍切片、基質(zhì)沉降共結(jié)晶及成像數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理與呈現(xiàn)等過程。衍生化結(jié)合的MALDI MSI實驗相比于傳統(tǒng)的MALDI MSI實驗，增加了衍生化試劑的涂覆步驟及一定的衍生化孵育時間(incubate time)。在衍生化試劑涂覆后，有時還需要將樣本切片在甲醇蒸汽存在的密閉容器中孵育一定時間，以提高衍生化反應(yīng)的產(chǎn)率。樣本上原位衍生化相結(jié)合的MALDI MSI實驗流程示于圖2，其中對于衍生化試劑與基質(zhì)的涂覆方式，不同的樣本和衍生化反應(yīng)會有較大區(qū)別。后續(xù)將對含有氨基、羧基、醛基和碳碳雙鍵等不同活性基團的目標分析物所對應(yīng)的不同類型的原位衍生化方法進行詳細介紹。

MALDI MSI中的衍生化需要直接將衍生化試劑涂覆在組織樣本上，并對樣本中的分子進行原位快速衍生化，相比于溶液相的衍生化反應(yīng)，MALDI MSI對于衍生化反應(yīng)的條件要求更加苛刻，這就需要研究人員精準優(yōu)化及調(diào)控衍生化反應(yīng)的溫度、衍生化時間及衍生化試劑的用量等，盡可能的縮短衍生化時間、降低目標分析物的移位和離子抑制現(xiàn)象。

3 成像基質(zhì)的選擇

成像基質(zhì)的選擇主要由樣本類型及目標分析物的分子質(zhì)量等因素決定。衍生化相結(jié)合的質(zhì)譜成像實驗中的基質(zhì)除了需要具備吸收激光、傳遞能量、輔助離子化的作用外，還需要滿足以下條件：1) 不抑制或參與衍生化反應(yīng)；2) 基質(zhì)峰對衍生化產(chǎn)物峰的干擾??；3) 可以在真空中長時間穩(wěn)定存在。在衍生化結(jié)合的質(zhì)譜成像實驗中，大多使用MALDI MS中常用的傳統(tǒng)有機基質(zhì)。例如，2、5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、α-氰基-4羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)、芥子酸(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, SA)等，這些基質(zhì)所適用的分析物類型也基本與MALDI MS一致。例如，對于脂肪酸及脂質(zhì)衍生化后的成像分析常選用DHB作為基質(zhì)，而對于神經(jīng)遞質(zhì)、多肽、蛋白[35]等常選擇CHCA或SA作為基質(zhì)。其中在MALDI MS中應(yīng)用較多的無機納米基質(zhì)(如氧化石墨烯以及離子液體基質(zhì)等)，而在衍生化結(jié)合的MALDI MSI中較少使用。

除了使用這些傳統(tǒng)基質(zhì)外，在衍生化結(jié)合的質(zhì)譜成像研究中還衍生出另一類基質(zhì)，即反應(yīng)基質(zhì)[36-41]。反應(yīng)基質(zhì)在成像過程中除了作為衍生化試劑用于衍生化目標分析物，還可以作為成像基質(zhì)使用。反應(yīng)基質(zhì)的優(yōu)點是減少了基質(zhì)和過量的衍生化試劑的雙重干擾，省去了衍生化試劑或基質(zhì)的涂覆步驟，使得實驗流程更加簡便。由于反應(yīng)基質(zhì)的優(yōu)點突出，使其在不同類型的目標分析物中得到應(yīng)用，例如在兒茶酚胺[41]、脂質(zhì)雙鍵[40]、神經(jīng)遞質(zhì)[38]等，對應(yīng)的反應(yīng)基質(zhì)結(jié)構(gòu)列于表1。

4 衍生化試劑和基質(zhì)的涂覆裝置

衍生化試劑和基質(zhì)的涂覆方式不僅影響組織上原位衍生化反應(yīng)效率，還會對質(zhì)譜成像結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。如果衍生化試劑及基質(zhì)的沉降不均勻，將難以實現(xiàn)較高空間分辨率的成像，因此采用合適的涂覆裝置對于組織上原位衍生化結(jié)合的質(zhì)譜成像實驗至關(guān)重要。一般來說，基質(zhì)的涂覆裝置同樣適用于衍生化試劑的涂覆。用于質(zhì)譜成像的試劑涂覆裝置示于圖3。該裝置可分為兩大類：一類是有溶劑參與的，例如電噴霧類型的裝置；一種是無溶劑參與的升華裝置(圖3c)。由于衍生化反應(yīng)通常在有溶劑參與時的效率更高，所以衍生化試劑在涂覆時通常采用有溶劑參與的微小液滴沉降方式，其中在基質(zhì)涂覆中應(yīng)用較多的升華方式在衍生化試劑的涂覆中應(yīng)用較少。成像中試劑的涂覆最早采用移液槍點涂的方式[42]，在用于小分子分析時會造成嚴重的移位現(xiàn)象。近年來，用于MALDI MS的商品化和非商品化的基質(zhì)沉降裝置層出不窮[43-44]。商品化的裝置有氣動噴槍，示于圖3a，其優(yōu)點是價格低廉、操作簡便，在質(zhì)譜成像發(fā)展初期被廣泛使用。但是該裝置的缺點也很明顯，由于是手動噴涂，所以受環(huán)境和人為的影響較大，很難得到重現(xiàn)性較好的實驗結(jié)果，且結(jié)晶的晶體大小難以滿足較高空間分辨的成像分析。另外，商品化的基質(zhì)噴涂裝置，如布魯克公司的自動基質(zhì)噴霧儀ImagePrep(Bruker Daltonics)，示于圖3b[45-46]。該裝置可以實現(xiàn)基質(zhì)的自動化噴涂，是目前常用的基質(zhì)沉降裝置。自動化的基質(zhì)沉降裝置除了ImagePrep外，還有噴墨打印基質(zhì)噴涂裝置[47-48]。噴墨打印裝置的優(yōu)點是位置控制精準，但是噴頭容易堵塞，不易清洗。非商品化的裝置主要是基于電噴霧原理改裝的基質(zhì)噴涂裝置，示于圖3d[49-50]。電噴霧裝置在高電壓和輔助氣存在下，通過調(diào)整噴針尖端與組織表面的距離可以形成較好的噴霧液滴，通過優(yōu)化參數(shù)可以使基質(zhì)結(jié)晶不超過1 μm。目前用于成像中試劑涂覆的裝置主要向小型化、價格低廉、操作簡便、重現(xiàn)性好的方向發(fā)展，如聶宗秀課題組[51]使用價格低廉的霧化器用于基質(zhì)沉降，并將其成功用于腦組織成像，示于圖3f。霧化器的基質(zhì)噴涂裝置與ImagePrep相比，得到的分析物質(zhì)譜響應(yīng)更高，質(zhì)譜的成像空間分辨率更高。另外，Mackay課題組[52]將電噴霧與液相體系相結(jié)合，實現(xiàn)了基質(zhì)噴涂的自動化，且實驗裝置成本低廉。

注：a.氣動噴槍；b.自動基質(zhì)噴霧儀；c.升華裝置；d.電噴霧基質(zhì)噴涂裝置；e.噴墨打??；f.迷你加濕器圖3 用于MALDI MSI的基質(zhì)噴涂裝置Fig.3 Instruments for the deposition of matrix in MALDI MSI experiment

5 不同活性基團化合物的衍生化

生物樣本中的化合物分子可以按照含有的活性基團進行劃分，例如含有氨基、羰基、醛基、羥基等的化合物。對于含有不同活性基團的化合物，衍生化試劑的設(shè)計及衍生化條件的選擇也有很大的區(qū)別。下面將對含有不同活性基團的化合物對應(yīng)的衍生化結(jié)合的MALDI MSI方法進行分類介紹。

5.1 氨基的衍生化

生物體內(nèi)含氨基的化合物眾多，例如神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸和多肽及一些外源的藥物分子等[53]。氨基類化合物在生物體內(nèi)的變化與很多疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。例如，神經(jīng)遞質(zhì)的變化與偏頭痛[54]、中風(fēng)[55]、抑郁癥[56]及阿爾茲海默癥[57]等疾病密切相關(guān)。因此，對含氨基類化合物進行成像分析，有利于理解這些疾病的病理生理特征。然而，一些含氨基類化合物的離子化效率較低，在成像過程中易受基質(zhì)峰的干擾，有必要對其衍生化后再進行成像分析。

對于含氨基類化合物的衍生化，最早是Fournier課題組[58]為了改善MALDI MSI對于蛋白“自下而上”的成像分析，首次將衍生化技術(shù)引入MALDI MSI，對組織上酶解后的多肽N端進行了化學(xué)衍生化。研究人員分別嘗試了通過衍生化反應(yīng)在多肽N端引入負電荷基團及正電荷基團。關(guān)于負電荷基團的引入，研究人員比較了異硫氰酸4-磺苯基酯(4-sulphophenyl isothiocyanate, 4-SPITC)及3-磺基苯甲酸(3-sulfobenzoic acid succinimidyl ester, 3-SBASE)兩種衍生化試劑，發(fā)現(xiàn)3-SBASE具有更高的衍生化效率，可以得到更豐富的碎片信息，而缺點是只有氣相堿度更高的N端為精氨酸的多肽在衍生化后能被檢測到。研究人員隨后又嘗試引入正電荷基團，采用(N-琥珀酰亞胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP)作為衍生化試劑，發(fā)現(xiàn)TMPP的優(yōu)勢在于反應(yīng)在室溫下即可發(fā)生，且衍生化的發(fā)生不依賴多肽N端的堿性氨基酸的存在。通過比較不同的衍生化方法，證實了衍生化具有改善MALDI-MSI蛋白“自下而上”分析的作用。

Caprioli課題組[59]在此基礎(chǔ)上提出使用1,1′-硫羰基二咪唑(1,1′-thiocarbonyldiimidazole, TCDI)對小鼠腎組織中的3-甲氧基水楊酰胺(3-methoxysalicylamine, 3-MoSA)進行衍生化后的質(zhì)譜成像，以克服3-MoSA在MALDI MSI檢測時易受基質(zhì)離子干擾和靈敏度低的問題。通過TCDI的衍生化，組織中3-MoSA的檢測限從200 pmol降至fmol級。隨后，Caprioli課題組[60]還將組織上原位衍生化方法應(yīng)用于抗結(jié)核藥物異煙肼的質(zhì)譜成像分析。對于異煙肼的衍生化，研究人員采用反式肉桂醛作為衍生化試劑，采用預(yù)先涂覆的方式，即先將衍生化試劑涂覆在氧化銦錫導(dǎo)電玻片上，再貼附組織樣本，不僅簡化了實驗步驟，還可以減少組織樣本中異煙肼的移位現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，研究人員通過比較10個化合物對于氨基代謝物的衍生化產(chǎn)物數(shù)量，選擇了一種內(nèi)源性氨基代謝物的衍生化試劑4-羥基-3-甲氧基肉桂醛(4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde, CA)。利用該衍生化方法結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜成功地對鼠腦組織中的內(nèi)源性氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)進行了衍生化后的質(zhì)譜成像分析及驗證[61]。郭帥等[62]受激光誘導(dǎo)正向傳輸(laser-induced forward transfer, LIFT)技術(shù)的啟發(fā)，開發(fā)了一種激光輔助組織傳輸(laser-assisted tissue transfer, LATT)技術(shù)用于組織上原位衍生化。LATT技術(shù)可以縮短衍生化時間，增強衍生化反應(yīng)效率。研究人員將該技術(shù)用于CA原位衍生化方法的質(zhì)譜成像中，發(fā)現(xiàn)相比于之前的CA原位衍生化方法，衍生化時間明顯縮短，且衍生化產(chǎn)物的信號強度提高了20～235倍。

為了進一步提高衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜響應(yīng)，Toue等[63]采用p-N,N,N-三甲基氨基-N′-羥基丁二酰亞酰甲酸酯碘化物(p-N,N,N-trimethylammonioanilyl-N′-hydroxysuccinimidyl carbamate iodide, TAHS)作為衍生化試劑，對人結(jié)腸癌移植瘤小鼠肝組織中的氨基酸進行衍生化，以提高氨基酸的離子化效率和成像靈敏度。TAHS可以與氨基酸發(fā)生親核取代反應(yīng)形成脲基化合物，由于衍生化產(chǎn)物中含有季銨鹽端的陽離子部分，因而衍生化后氨基酸的離子化效率大幅提高。由于氨基酸衍生化產(chǎn)物離子峰與DHB基質(zhì)峰有重疊，研究人員通過衍生化產(chǎn)物的串聯(lián)質(zhì)譜進行了氨基酸的成像分析。結(jié)果表明，谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和丙氨酸這8種氨基酸在轉(zhuǎn)移瘤組織中的含量明顯高于肝實質(zhì)區(qū)域。說明組織上TAHS衍生化方法結(jié)合質(zhì)譜成像技術(shù)有利于理解疾病相關(guān)的氨基酸含量的分布變化。

對于含氨基的神經(jīng)遞質(zhì)的衍生化，Andren課題組[37-38]選擇吡喃鎓鹽作為反應(yīng)基質(zhì)，其可以與一級胺在室溫下快速反應(yīng)形成吡啶鹽，衍生化后不需要額外的基質(zhì)輔助離子化。通過比較，研究人員選擇了2,4,6-三苯基吡喃四氟化硼鹽(2,4-diphenyl-pyranylium tetrafluoroborate, DPP-TFB)用于神經(jīng)遞質(zhì)的組織上原位衍生化。DPP-TFB不僅可以作為衍生化試劑，過量的DPP-TFB還可以直接作為基質(zhì)使用，避免了過量衍生化試劑的干擾。衍生化產(chǎn)物由于具有吡啶正離子基團，因而可以顯著提升神經(jīng)遞質(zhì)的解吸和離子化效率。研究人員將DPP-TFB衍生化方法用于帕金森病模型鼠腦組織中多種神經(jīng)遞質(zhì)的同時成像分析，成像空間分辨率低至15 μm。在此基礎(chǔ)上，還使用氘代神經(jīng)遞質(zhì)的標準溶液繪制了標準曲線，用于神經(jīng)遞質(zhì)的MALDI MSI定量分析，結(jié)果清楚地顯示了疾病相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)的含量分布差異，體現(xiàn)了質(zhì)譜成像技術(shù)對于多種化合物同時成像分析的獨特優(yōu)勢。隨后，McDonnell等[64]進一步對CA、TAHS和DPP-TFB這3種衍生化試劑進行了結(jié)合與條件優(yōu)化，得到了鼠腦組織中23種氨基代謝物的含量分布。

5.2 含羰基化合物的衍生化

生物體內(nèi)含有活性羰基基團的化合物種類繁多，其中研究較多的是類固醇類化合物。類固醇激素具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎及促進發(fā)育等功能，它的含量異常變化與很多疾病密切相關(guān)，例如乳腺癌、肥胖癥和前列腺癌等[65]。因此，生物樣本中類固醇激素的定量分析對于相關(guān)疾病的診斷治療具有重要意義。質(zhì)譜法是血液中類固醇定量的金標準，然而血液中激素含量的變化很難歸結(jié)是具體某個器官帶來的。質(zhì)譜成像技術(shù)的引入則使得對類固醇的研究進入到更直觀的特定組織分子層面。類固醇激素是一類四環(huán)脂肪烴化合物，在MALDI過程中具有豐度低、離子化效率低的特點，直接進行MALDI MSI分析存在難點。由于類固醇分子結(jié)構(gòu)中一般存在活性羰基及羥基基團，對其衍生化后再進行質(zhì)譜成像分析可以明顯提高檢測靈敏度。Andrew課題組[66]采用吉拉德試劑T (Girard’s reagent T, GirT)結(jié)合MALDI MSI對糖皮質(zhì)激素放大酶的底物11-脫氫皮質(zhì)酮(11-dehydrocorticosterone ,11DHC)及產(chǎn)物皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)，以及7-酮基膽固醇進行了衍生化后的質(zhì)譜成像分析。中性皮質(zhì)類固醇中的α-β不飽和酮部分可以與GirT反應(yīng)生成帶正電荷的腙類化合物，從而顯著提高成像靈敏度。衍生化后組織上皮質(zhì)類固醇激素的檢測限低至0.1 pg。質(zhì)譜成像結(jié)果顯示，皮質(zhì)類固醇在鼠腦組織中的大腦皮層、海馬體以及杏仁核區(qū)域的豐度更高。作者還通過對糖皮質(zhì)激素放大酶11β-HSD1缺陷小鼠中11DHC 和CORT進行成像分析，以揭示11DHC和CORT含量比例變化與11β-HSD1酶活性之間的關(guān)系，其中MALDI MSI空間分辨率為150～200 μm。隨后，Andrew課題組[67]還將GirT衍生化方法應(yīng)用于鼠睪丸組織中睪酮與5α-二氫睪酮(5α-dihydrotestosterone, DHT)的成像分析，衍生化后睪酮的檢測限低至0.1 pg。通過優(yōu)化衍生化條件及改變試劑沉降裝置，顯著提高了實驗的重現(xiàn)性及試劑在組織上分布的均勻性，成像分辨率低至50 μm，實現(xiàn)了更高分辨的質(zhì)譜成像。質(zhì)譜成像技術(shù)在類固醇成像中的成功應(yīng)用有助于胞內(nèi)分泌學(xué)的發(fā)展。

除了內(nèi)源的類固醇分子，對于外源的類固醇藥物分子的衍生化也有相關(guān)應(yīng)用。雖然醫(yī)學(xué)上有很多成熟的疾病影像檢查手段，例如超聲檢查、計算機斷層掃描、磁共振成像和正電子發(fā)射斷層掃描等，且這些檢查方法對患者的診斷或隨訪很有效，但還是不能從生物分子層面提供對疾病病理的理解。MALDI MSI由于具有可同時得到多個分子的高分辨成像信息，近年來已有多篇在藥物分子成像分析方面應(yīng)用的報道[68-70]。Cillero-Pastor等[71]將GirT衍生化方法應(yīng)用于軟骨組織中外源類固醇類藥物分子曲安奈德(triamcinolone acetonide, TAA)的成像分析。曲安奈德是一種合成的皮質(zhì)類固醇藥物，可以用于減輕骨關(guān)節(jié)的炎癥和疼痛[72]，了解TAA藥物的局部分布有助于調(diào)整關(guān)節(jié)內(nèi)藥物治療的用量和給藥方式。然而軟骨組織中無血管分布，很難直接測定TAA在軟骨組織中的滲透能力和含量分布。MALDI MSI技術(shù)對于TAA分子的直接成像分析也極其困難，這是因為TAA分子在MALDI過程中的離子化效率很低。為解決這一難題，Cillero-Pastor課題組[73]通過比較2,4-二硝基苯肼和GirT兩種衍生化試劑，選擇GirT對軟骨組織中的TAA進行衍生化后的質(zhì)譜成像。使用GirT衍生化方法成功地成像和定量了TAA在軟骨組織中的含量分布，相比于未衍生化方法的檢測靈敏度顯著提升。

對于類固醇藥物的衍生化，F(xiàn)linders等[36]還采用了4-二甲氨基-6-(4-甲氧基-1-萘基)-1,3,5-三嗪-2-肼(4-dimethylamino-6-(4-methoxy-1-naphthyl)-1,3,5-triazine-2-hydrazine, DMNTH)反應(yīng)基質(zhì)，對治療哮喘的藥物丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)進行了衍生化后的質(zhì)譜成像分析。該試劑最早由Karst課題組[74]報道用于含有羰基化合物的板上衍生化的反應(yīng)基質(zhì)。Flinders等[70]通過優(yōu)化原位衍生化條件,將DMNTH衍生化方法成功應(yīng)用于鼠肺組織中丙酸氟替卡松的質(zhì)譜成像分析。研究人員發(fā)現(xiàn)，為了提高檢測靈敏度及降低檢測限，衍生化時間需要延長到48 h，且DMNTH作為反應(yīng)基質(zhì)時，需要混入少量的CHCA基質(zhì)。

除了類固醇類分子中羰基的衍生化，Enomoto等[75]還采用GirT衍生化方法對植物種子中的脫落酸與12-氧-植物二烯酸中的酮羰基進行了衍生化后的質(zhì)譜成像分析。顯示了GirT衍生化方法在不同類型樣本質(zhì)譜成像分析中的應(yīng)用潛力。

5.3 羧基衍生化

含羧基組織上原位衍生化的工作主要包括對聚糖及脂肪酸中的羧基衍生化。N-聚糖參與許多細胞代謝過程，例如細胞間相互作用、免疫應(yīng)答和細胞分化等，具有作為疾病生物標記物和治療靶標的巨大潛力[76]。定性定量分析其含量變化可以揭示相關(guān)疾病的發(fā)病機理。然而，對于N-聚糖直接MALDI-MS和MSI分析仍然具有挑戰(zhàn)，這主要是因為N-聚糖中存在的唾液酸結(jié)構(gòu)具有不穩(wěn)定的特性，易于在源內(nèi)/源后降解，且唾液酸中的羧基存在不利于正離子檢測模式下聚糖的離子化。Wuhrer課題組[77]對組織中的N-聚糖進行了組織上原位二甲基酰胺化后的質(zhì)譜成像分析，該衍生方法可以對N-聚糖中不同連接方式(α2,3或α2,6構(gòu)型)的唾液酸實現(xiàn)差異衍生化，得到具有28.031 u質(zhì)量差異的衍生化產(chǎn)物，從而分別對含有不同構(gòu)型唾液酸結(jié)構(gòu)的N-聚糖進行成像分析。MALDI MSI結(jié)果顯示，N-聚糖在結(jié)腸癌以及福爾馬林固定的平滑肌肉瘤組織中不同區(qū)域的差異分布，且相比于未衍生化的N-聚糖的質(zhì)譜成像分析結(jié)果得到了明顯改善。

游離脂肪酸作為生物體內(nèi)重要的合成中間體，參與了很多重要的代謝過程，例如脂質(zhì)代謝及糖代謝過程，脂肪酸在生物體內(nèi)含量的變化與很多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[78]。利用MALDI MSI對脂肪酸含量分布、變化進行成像分析，可以很好地揭示脂肪酸所參與的疾病相關(guān)的代謝過程。然而，脂肪酸這類分子具有豐度低、相對分子質(zhì)量低(200～400 u)、離子化效率低的特點，直接對其采用MALDI質(zhì)譜成像分析仍然極具挑戰(zhàn)，因此通過在組織上先對脂肪酸原位衍生化后再進行成像是非常必要的。對于脂肪酸的衍生化，Sweedler課題組[79]利用2-氨甲基吡啶作為衍生化試劑對鼠腦組織中的內(nèi)源脂肪酸進行了組織上原位衍生化，在衍生化后的質(zhì)譜成像分析中得到了6個脂肪酸的成像信息。該工作創(chuàng)新性地使用電噴霧裝置進行衍生化試劑的沉降，不僅改善了目標分析的移位現(xiàn)象，還顯著縮短了衍生化時間，成像的空間分辨率低至20 μm。

圖4 磷脂與脂肪酸同時質(zhì)譜成像分析示意圖Fig.4 Schematic diagram of simultaneous mass spectrometry imaging analysis of phospholipids and fatty acids

本課題組[80]設(shè)計合成了與磷脂具有相似季銨鹽端的衍生化試劑N，N-二甲基哌嗪碘鹽(N,N-dimethylpiperazine iodide, DMPI)，用于脂肪酸與磷脂的同時質(zhì)譜成像分析，示于圖4。相比于2-氨甲基吡啶脂肪酸衍生化方法，DMPI衍生化后脂肪酸的檢測靈敏度提高了1～2個數(shù)量級。這是因為DMPI中哌嗪基團與羧基的反應(yīng)活性更高，生成的衍生化產(chǎn)物中季銨鹽端的離子化效率更加優(yōu)異。采用DMPI組織上原位衍生化方法，實驗中僅使用一個組織樣本切片便可以同時得到脂肪酸和磷脂的質(zhì)譜成像信息。該原位衍生化策略成功地實現(xiàn)了甲狀腺癌組織與癌旁組織中脂肪酸與磷脂的同時質(zhì)譜成像分析。本課題組在得到兩類分子的空間差異分布信息后又進行了不同分子間的相關(guān)性分析，結(jié)果表明脂肪酸的從頭合成在甲狀腺癌組織中更加活躍，這也進一步揭示了脂質(zhì)的差異代謝與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

5.4 脂質(zhì)異構(gòu)體中碳碳雙鍵的衍生化

5.5 羥基、巰基衍生化

含有羥基的化合物主要是一些毒品分子及神經(jīng)遞質(zhì)。毒品分子及蛋白分子衍生化毒品可以通過血液循環(huán)進入頭發(fā)毛囊中，其相比于血液、尿液中的毒品更不易受外部環(huán)境影響。一直以來，頭發(fā)毒品檢測技術(shù)是藥物依賴防治研究領(lǐng)域的熱點。近年來，MALDI MSI已應(yīng)用于頭發(fā)樣本中違禁藥物的成像分析，例如甲基苯丙胺[89]、克他命[90]和可卡因[91]等的成像分析。四氫大麻醇(tetrahydrocannabinol, THC)是在世界范圍內(nèi)濫用最廣的毒品，其在生物體內(nèi)和體外的代謝路徑和代謝產(chǎn)物不同，為了分辨是否來自外源污染，將這些代謝物分別進行成像分析是非常必要的。Bassindale等[92]采用2-氟-1-甲基吡啶翁對甲苯磺酸鹽(2-fluoro-1-methylpyridinium ptolunesolfonate，F(xiàn)MTPS)對頭發(fā)中的THC及其代謝物進行了衍生化后的質(zhì)譜成像分析。THC及其代謝物中的酚羥基可以與FMTPS發(fā)生快速溫和的反應(yīng)，由于衍生化產(chǎn)物中具有季銨鹽結(jié)構(gòu)，使后續(xù)成像的靈敏度顯著提升。另外，通過FMTPS衍生化方法還實現(xiàn)了THC及生物體內(nèi)、體外代謝物的分別成像分析。

兒茶酚胺類化合物作為神經(jīng)遞質(zhì)的一種，參與調(diào)節(jié)了很多生物學(xué)過程和行為。兒茶酚氨結(jié)構(gòu)中含有鄰雙酚基，去甲腎上腺素、多巴胺和腎上腺素均屬于兒茶酚胺類化合物。這類分子在成像過程中易受基質(zhì)及組織內(nèi)源物質(zhì)抑制，離子化效率較低。Fletcher等[41]合成了一種吡啶硼酸鹽類化合物4-(N-甲基)吡啶硼酸(4-(N-methyl)pyridinium boronic acid)作為反應(yīng)基質(zhì)，用于兒茶酚胺類分子中雙酚基的衍生化。4-(N-甲基)吡啶硼酸成功地對豬腎上腺組織中的去甲腎上腺素、多巴胺和腎上腺素進行衍生化，隨后的無標記激光解吸電離質(zhì)譜成像(LDI MSI)分析顯示了這3種分子在組織中不同區(qū)域的分布強弱。研究人員也認為，4-(N-甲基)吡啶硼酸衍生化方法具有應(yīng)用于含氨基醇、二醇、糖類化合物衍生化后的成像分析潛力。

對于含巰基化合物的衍生化，Rittne等[93]報道了一種用于組織中含有游離硫醇基團的大分子蛋白和小分子代謝物的原位衍生化成像方法。該方法使用三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)-phosphine，TCEP)對組織中的含硫醇化合物進行還原，然后采用CHC-Mal作為衍生化試劑進行原位衍生化，結(jié)構(gòu)列于表1。研究人員將CHC-Mal衍生化方法應(yīng)用于豬胰腺組織中還原后的胰島素質(zhì)譜成像，成功得到了衍生化后的胰島素α-鏈和β-鏈在組織中的含量差異分布。另外，還將CHC-Mal衍生化方法應(yīng)用于豬肝組織中谷胱甘肽的MALDI MSI分析，結(jié)果表明，衍生化后的谷胱甘肽具有更好的質(zhì)譜響應(yīng)。

5.6 鉑類藥物分子衍生化

抗癌藥物中包含很多含鉑類藥物，例如奧沙利鉑、卡鉑和順鉑等。鉑類藥物被廣泛應(yīng)用于臨床，給藥后在組織中的含量分布研究主要依靠熒光成像法，其缺點是對于不含熒光基團的藥物分子需預(yù)先連接熒光基團。許多研究表明，加上熒光基團后的藥物分子在組織中的分布可能會與藥物分子本身的分布存在差異。基于此，開發(fā)輔助性的成像方法是很必要的。MALDI MSI雖然能得到部分鉑類藥物分子的成像信息，但大多數(shù)分子的質(zhì)譜響應(yīng)都很弱。Liu等[94]將乙基二硫代氨基甲酸酯(diethyldithiocarbamate, DDTC)用于MALDI MSI的原位衍生化中，以提高鉑類藥物分子成像中的質(zhì)譜響應(yīng)。DDTC是一種親核性的含硫化合物，可以作為螯合劑與多種金屬離子形成金屬配合物，之前已被用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用中鉑類藥物分子的定量分析[95]。作者通過優(yōu)化衍生化方法將其用于鉑類藥物奧沙利鉑的衍生化試劑，衍生化后奧沙利鉑的質(zhì)譜響應(yīng)顯著提升，成功實現(xiàn)了多細胞腫瘤球體切片中奧沙利鉑分子的衍生化及MALDI MSI分析。

6 展望

MALDI MSI分析一些低豐度、離子化效率低的化合物時，通常會因檢測靈敏度低、離子化效率差、離子抑制、分析物源碎裂以及MALDI基質(zhì)和內(nèi)源性成分的背景峰干擾而受到阻礙。將樣本原位衍生化方法應(yīng)用于MALDI MSI，可以顯著改善這些化合物MALDI MSI的成像效果，原位衍生化與MALDI MSI的結(jié)合擴大了MALDI MSI的應(yīng)用范圍。由于樣本上的原位衍生化方法的衍生化條件較為苛刻，所以需要對衍生化試劑、衍生化反應(yīng)及成像流程進行合理的設(shè)計和優(yōu)化，以實現(xiàn)衍生化與MALDI MSI的優(yōu)勢互補，否則原位衍生化方法就可能成為一把“雙刃劍”，在衍生化過程中會伴隨大量分子成像信息的丟失。對于原位衍生化結(jié)合的MALDI MSI，如何設(shè)計更高效的衍生化試劑、降低離子抑制現(xiàn)象以及對目標分析物的準確定量等均是需要進一步研究的問題。