玻璃基介電型MALDI-TOF MS一次性靶片設(shè)計制備及其在微生物檢測性能的研究

盧瀚侖，劉寧煬

(廣東省科學(xué)院半導(dǎo)體研究所，廣東 廣州 510650)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)近年來廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)檢測[1]，應(yīng)用范圍涵蓋核酸[2-4]、多肽蛋白質(zhì)[5-7]、細菌和微生物分析[8-11]、抗體[12-13]、藥物科學(xué)[14-15]等方向。

靶片是MALDI-TOF MS中用以承載基質(zhì)和檢測物，同時為檢測物提供均勻解吸電位的重要裝置。靶片的結(jié)構(gòu)設(shè)計、材料選擇以及加工工藝對質(zhì)譜測試性能有較大影響。目前已商品化的用于醫(yī)療檢測領(lǐng)域的多為重復(fù)使用的不銹鋼靶片。受鋼表面特殊親疏水工藝等加工成本的限制，其價格偏高。同時，由于多次使用的特性，不利于實現(xiàn)臨床使用的高潔凈度[16]、少交叉污染[17]、測試結(jié)果可靠[18]等特殊要求；且長期接觸清洗靶片的有機溶劑(如丙酮、乙腈、乙醇等)會對人體產(chǎn)生危害[19]，如果清洗不到位，還會直接影響測試結(jié)果，增加誤診率。因此，一次性靶片的研發(fā)與生產(chǎn)是MALDI-TOF MS用于臨床診斷的技術(shù)瓶頸。 Schürenberg等[20]開發(fā)的一次性塑料靶片得到了一些應(yīng)用，但存在塑料襯底在激光作用下降解而導(dǎo)致測試結(jié)果不準確的問題。因此，本團隊擬開發(fā)一種玻璃襯底、靶點為金屬金表面、含有特殊結(jié)構(gòu)的介電型一次性靶片。該靶片與鋼靶片相比具有的優(yōu)勢為：1) 三維點樣結(jié)構(gòu)有利于手動點樣的精準性；2) 特殊結(jié)構(gòu)設(shè)計使結(jié)晶均勻性更好，提升分辨率；3) 材質(zhì)以玻璃為主，成本低廉。該靶片與塑料靶片相比具有的優(yōu)勢為：1) 耐高溫，可進行高溫滅菌處理；2) 不易吸附大氣中的雜菌成分而造成污染；3) 全無機結(jié)構(gòu)，不易被激光損壞導(dǎo)致測試物污染。本文將首先研究影響玻璃靶片生產(chǎn)的主要工藝問題，從玻璃選材、刻蝕工藝的優(yōu)化、鍍金結(jié)構(gòu)的設(shè)計，解決生產(chǎn)過程中遇到的樣品無法正常電離、玻璃底面出現(xiàn)結(jié)晶等問題，得到符合技術(shù)參數(shù)要求的靶片。然后分別從基質(zhì)結(jié)晶情況、測試質(zhì)量穩(wěn)定性分辨率以及細菌標準品測試穩(wěn)定性等方面，對比其與鋼靶片的性能。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

CMI-1600基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜儀：廣州禾信公司產(chǎn)品；DE400DHL電子束蒸發(fā)鍍膜系統(tǒng)：北京德儀公司產(chǎn)品；ABM/6/350/NUV/DCCD/BSV/SA紫外光刻機：美國ABM公司產(chǎn)品。

1.2 樣品與試劑

α-氰基-4-羥基肉桂酸(C8982,α-CHCA)、0.1%三氟乙酸(302031,TFA)、乙腈(34851,ACN)，促腎上腺皮質(zhì)激素18-39(A8346,ACTH Fragment 18-39)、胰島素(91077C,Insulint)、肌紅蛋白(M1882,Myoglobin)、牛血清白蛋白(B2064,BSA)：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；丙酮、異丙醇、氟化銨腐蝕液BOE(6∶1)：均為MOS級，江陰市化學(xué)試劑廠有限公司產(chǎn)品；AZ4620、AZ2035光刻膠，AZ300MIF顯影液：汶顥股份有限公司產(chǎn)品。所有化學(xué)試劑使用時均未進行二次純化操作。質(zhì)譜儀校正物Peptide Calibration Standard I(#206195)和Protein Calibration Standard I(#206355)：德國布魯克道爾頓公司產(chǎn)品。實驗純凈水：由Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)生產(chǎn)；750 μm B270玻璃：肖特玻璃公司產(chǎn)品；750 μm浮法鈉鈣玻璃：洛陽玻璃廠產(chǎn)品；超純金屬：中諾先進材料(北京)有限公司產(chǎn)品。

測試樣品：ATCC-8739 大腸桿菌標準溶液、標準蛋白和ACTH多肽樣品?；|(zhì)為α-CHCA的乙腈-三氟乙酸-水(50∶2.5∶47.5,V/V/V)飽和溶液。根據(jù)各藥品所需濃度，利用0.1% 三氟乙酸溶液配制而成。采用覆蓋點樣法，先點1.0 μL樣品，然后覆蓋1.0 μL基質(zhì)，自然風(fēng)干后上機測試。

MALDI-TOF MS使用CMI-1600進行測試。正離子模式，離子加速電壓22 kV，使用波長343 nm、脈寬1 ns、重復(fù)頻率2 kHz的激光進行電離。由200次激光脈沖后疊加得到質(zhì)譜結(jié)果，使用標準蛋白混合物Protein Calibration Standard I和標準肽混合物Peptide Calibration Standard I校準質(zhì)譜儀。

1.3 玻璃襯底介電型一次性靶片的制備

為降低一次性使用成本，減少靶片的點數(shù)，形成了28點小樣量靶片的設(shè)計，示于圖1a。根據(jù)用戶以往使用體驗，本靶片在載樣區(qū)特別設(shè)計了凹坑結(jié)構(gòu)，方便手動點樣時液滴不容易溢出點樣區(qū)，同時可增加載樣體積，以獲得更好的測試效果。靶片實物照片示于圖1b。

圖1 玻璃基靶片的設(shè)計與實現(xiàn)Fig.1 Design and fabrication of the glass based target plate

靶片的加工工藝示于圖1c：1) 依據(jù)圖1a制作玻璃鉻光刻掩膜；2) 將所需玻璃襯底用激光切割成19.7 mm × 30.0 mm，并實施AZ4620背膠保護，正面AZ2035掩膜曝光顯影樣品區(qū)圖形，形成中間體；3) 將中間體置于BOE腐蝕液濕法腐蝕一段時間，用去離子水徹底清洗，以阻止繼續(xù)被刻蝕，得到結(jié)構(gòu)襯底，105 ℃ 烘干5 min，備用；4) 使用電子束蒸發(fā)臺，在不去掉掩膜膠的情況下進行電子束蒸鍍金屬，正面樣品區(qū)為20 nm Ni-V合金與200 nm Au；5) 背面去膠后，電子束蒸鍍20 nm Ni-V合金；6) 使用丙酮超聲波輔助去除并回收殘膠和多余金屬，分別用異丙醇、純凈水完全清潔后，高純氮氣吹掃5 min，105 ℃ 烘干5 min，即得樣品靶片。

2 結(jié)果與討論

2.1 背面鍍鎳的影響

為降低成本，本課題組先前的設(shè)計沒有對玻璃背面進行全面鍍鎳。樣品制備完成后上機測試，發(fā)現(xiàn)靶托一些位置的樣品點均無法發(fā)生有效電離，導(dǎo)致質(zhì)譜測試失敗。隨后開發(fā)了背面全面鍍鎳的方案，成功解決了這一問題。為理解背面不鍍鎳造成樣品電離失敗的原因，使用COMSOL建模對靶托附近的電場分布進行有限元計算，結(jié)果示于圖2。

圖2 初級加速極靴在2 cm(a)和0 cm(b)時的電場分布Fig.2 Electric field distributions from the target holder to the primary acceleration shoe at 2 cm (a), 0 cm (b)

背面不鍍金時靶片的襯底是絕緣玻璃，而靶托是通電的不銹鋼金屬材質(zhì)。因此，在背面不鍍金時，靶片正面載樣區(qū)的金表面電荷來源于靶托給玻璃的極化。而由有限元仿真結(jié)果可知，不同的極靴中心在靶托的凹槽結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較明顯的電場變化，這一變化直接通過玻璃非良好接觸傳遞給靶板樣點。由于玻璃不是均勻介電體，并且與靶托接觸電阻不可控，電場結(jié)構(gòu)誤差會被放大，最終導(dǎo)致樣品靶片不同位置的電場強度差異過大而電離失敗。如果在靶片背面實施鍍鎳與玻璃緊密接觸，減少靶片與靶托的接觸不良，有利于電場變化均勻化，從而解決無法電離樣品的問題。

2.2 靶片襯底材料選擇對刻蝕的影響

本實驗分別使用B270玻璃和浮法鈉鈣玻璃進行加工測試，按照前述規(guī)則進行光刻掩膜，并用氫氟酸-氟化銨(6∶1)的BOE刻蝕5 min，最后上鏡檢測。結(jié)果表明，BOE對2種玻璃的刻蝕速度相似，均約為1.0～1.3 μm/min。

經(jīng)過BOE刻蝕后的B270玻璃底面出現(xiàn)了明顯的紋理結(jié)構(gòu)，表面不光滑，示于圖3a；刻蝕后B270玻璃底面局部影像示于圖3b，可看出使用B270光學(xué)玻璃雖然有更好的澄清度，但刻蝕底部出現(xiàn)了較多的晶體結(jié)構(gòu)；從圖3c可以看出，在光刻掩膜下，BOE對玻璃區(qū)域的縱向刻蝕深度約為6.3 μm，對邊沿的側(cè)向過刻蝕接近0.01 mm，過刻蝕比率約為2∶1，這與BOE刻蝕硅的性質(zhì)接近[21]。由于實驗設(shè)計的靶點直徑為2.65 mm，側(cè)向過刻蝕對尺寸不準確度僅貢獻約3.8‰，可以認為完全不影響圖形的準確度。在2.65 mm直徑下，6～7 μm深度的凹槽足以容納約20 μL的極限溶液體積，故這一形貌對于實驗需要的靶片參數(shù)來說是可取的。蘇打玻璃刻蝕后的底面光學(xué)影像示于圖3d，比圖3b顯示出更光滑均勻的底面結(jié)構(gòu)，表面沒有產(chǎn)生結(jié)晶狀的顆粒，顯現(xiàn)出良好的形貌特征。從刻蝕后形貌可知，蘇打玻璃是此工藝路線中比較合理的襯底材料。通過查閱玻璃數(shù)據(jù)手冊發(fā)現(xiàn)，普通浮法鈉鈣玻璃的鋁含量小于1%，而B270含有的鋁成分更多(約2%～3%)，由此推測底面不平整現(xiàn)象是因為BOE中氟離子與玻璃中過多的氧化鋁發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成難溶的三氟化鋁結(jié)晶，阻止了均勻刻蝕。因此，實驗最終選用浮法鈉鈣玻璃為玻璃襯底材料，成功制備了形貌可控，滿足測試需求的玻璃靶片。

圖3 SEM(a)和光學(xué)顯微鏡(b)拍攝B270玻璃腐蝕后底面，SEM拍攝蘇打玻璃刻蝕后底面與光刻膠關(guān)系(c)，光學(xué)顯微鏡拍攝蘇打玻璃刻蝕后結(jié)果(d)Fig.3 Bottom surfaces of B270 glass after etching taken by SEM (a) and optical microscope (b), relationship between the bottom surface and photoresist of soda glass after etching taken by SEM (c), optical image taken after etching of soda glass (d)

2.3 結(jié)晶情況對比

針對上述制備成功的玻璃靶片，分別取1 μL CHCA基質(zhì)溶液滴于鋼靶片和玻璃靶片載樣區(qū)，自然風(fēng)干，放入MALDI-TOF MS載樣平臺，通過CCD攝像頭相同放大倍率下觀測靶點結(jié)晶狀態(tài)。鋼靶片和玻璃靶片的結(jié)晶形貌示于圖4。對比可知，玻璃靶片擁有更佳的結(jié)晶均勻度、更小的結(jié)晶粒徑，由于MALDI-TOF MS是對樣品區(qū)域不同位置進行隨機采樣并累加而獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，因而更加平整的結(jié)晶效果測試結(jié)果更優(yōu)。

2.4 質(zhì)荷比準確度

同等點樣條件下，對比了28個采樣點下ATCC-8739的質(zhì)譜測試。以m/z4 365為基準進行測試，結(jié)果示于圖5a。從圖中散點分布可以看出，玻璃靶片與鋼靶片的離散程度基本一致。值得注意的是，鋼靶片在A2和B3沒有出現(xiàn)這個峰，表現(xiàn)出重大缺陷，在計算平均值和標準差時，排除了這2個異常點。計算結(jié)果表明，玻璃靶片在該峰各點表現(xiàn)為m/z4 365.24±0.69，而鋼靶片的表現(xiàn)為m/z4 365.79±0.75。對比數(shù)據(jù)可知，如果排除異常點的干擾，2種靶片在m/z4 365 處表現(xiàn)相同。

為進一步驗證測試質(zhì)荷比的準確度，以特征m/z5 381進行相同實驗，示于圖5b。玻璃靶片與鋼靶片的離散程度基本一致。同樣，鋼靶片在A2與B3出現(xiàn)了異常，可能是點樣問題引起的，因此排除了這一干擾點。經(jīng)計算得到，玻璃靶片表現(xiàn)為m/z5 381.88±1.2，而鋼靶片為m/z5 382.02±0.95。綜上，可認為玻璃靶片與鋼靶片的質(zhì)量數(shù)準確度處于同等水平。

圖4 鋼靶片(a)和玻璃靶片(b)的結(jié)晶形貌Fig.4 Crystal morphology of steel target (a) and glass target (b)

圖5 玻璃靶片與鋼靶片的測試質(zhì)荷比對比特征m/z 4 365(a)和m/z 5 381(b)Fig.5 Mass-to-charge ratios comparison of glass target and steel target at m/z 4 365 (a) and m/z 5 381 (b)

2.5 分辨率

2.5.1單譜分辨率 分別以ATCH與混合蛋白質(zhì)為模式物進行打單譜對比分辨率，示于圖6。玻璃靶片在ACTH主峰m/z2 466、2 467、2 468上的分辨率與鋼靶片基本一致，但玻璃靶片在高分子質(zhì)量區(qū)顯示出更明確的細節(jié)，具體表現(xiàn)為m/z2 469、2 470以及2 471的峰值信號與m/z2 467相對強度比鋼靶片更大，這有利于建立在基準物吻合度檢驗的細菌圖譜的機器驗證。

從圖6b可以看出，在m/z10 000 以前，混合蛋白質(zhì)的譜圖分辨率在玻璃靶片與鋼靶片上表現(xiàn)一致；在大于m/z10 000的區(qū)域，即m/z12 373與m/z16 969峰的分辨率上，玻璃靶片的分辨率比鋼靶片高約16%。這可能是因為在大分子質(zhì)量段，玻璃靶片的電容電場均化效應(yīng)使其動能平均化作用更明顯，體現(xiàn)了玻璃靶片檢測大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的優(yōu)勢。

2.5.2分辨率綜合對比 使用大腸桿菌ATCC-8739進行分辨率綜合對比，示于圖7。玻璃靶片與鋼靶片在分辨率上的離散規(guī)律相似，程度接近。經(jīng)計算得到，玻璃靶片對特征m/z4 365的分辨率為746.38±59，而鋼靶片為712.91±81。對特征m/z5 381，玻璃靶片的分辨率為871.94±75，鋼靶片為833.84±90。從以上可看出，玻璃靶片具有更好的分辨率以及更窄的分辨率波動性，可能是因為玻璃靶片具有更好的結(jié)晶穩(wěn)定性。同時，使用光刻工藝可實現(xiàn)每個樣品點高度的均一化，進一步提升其分辨率。由于靶片特殊的電容型結(jié)構(gòu)，帶來了脈沖引出離子時較大的靶片電容造成的動能均化效應(yīng)。

a,c.玻璃靶片；b,d.鋼靶片圖6 ACTH(a,b)和混合蛋白質(zhì)(c,d)測試分辨率對比圖Fig.6 Comparison of resolution in testing proteins ACTH (a, b) and mixed proteins (c, d)

2.6 信噪比

2.6.2信噪比對比 使用ATCC-8739大腸桿菌進行信噪比對比，示于圖9?？梢钥闯?，玻璃靶片在m/z4 365和m/z5 381均表現(xiàn)出更高的信噪比趨勢。玻璃靶片在m/z4 365的信噪比是223.07±119，鋼靶片是146.89±105；玻璃靶片在m/z5 381的信噪比是245.58±126，而鋼靶片是148.99±93。綜上，玻璃靶片的分辨率優(yōu)于鋼靶片60%以上，但分辨率穩(wěn)定性沒有顯著差異。

2.7 細菌指紋圖譜評分測試

通過軟件程序?qū)ΣＡО衅c鋼靶片進行ATCC-8739標準細菌指紋圖譜評分測試。軟件評分原理是將測試的細菌質(zhì)譜圖與細菌數(shù)據(jù)庫中標準譜進行差分比對后，根據(jù)相似度進行評分，評分從0～10分表示相似的可信度從低到高，滿分為10，計算結(jié)果列于表1?？芍?，玻璃靶片的總體匯總評分為9.98±0.022，而鋼靶片為9.76±0.92，表明玻璃靶片具有更優(yōu)秀的細菌鑒定性能。

3 結(jié)論

本研究設(shè)計了一種玻璃襯底的介電型一次性MALDI-TOF MS靶片。通過優(yōu)化工藝路線和襯底選擇，成功制備了滿足技術(shù)要求的玻璃靶片。測試數(shù)據(jù)表明，玻璃靶片在質(zhì)量數(shù)測試穩(wěn)定性和精確度方面與常用的鋼靶片持平，但分辨率、信噪比以及細菌指紋圖譜測試評分等技術(shù)指標均優(yōu)于傳統(tǒng)鋼靶片。由于該靶片使用了廉價易得的浮法鈉鈣玻璃為襯底，且工藝簡單，在未來的批量生產(chǎn)過程中(10萬片/批次)，有望將平均材料成本控制在10元/片，從而進一步降低測試成本并提高性能，提升配套MALDI-TOF MS作為臨床醫(yī)療診斷領(lǐng)域解決方案的使用價值。

圖7 ATCC-8739特征m/z 4 365(a)和m/z 5 381(b)的分辨率散點圖Fig.7 Resolution scatter plots of ATCC-8739 at m/z 4 365 (a) and m/z 5 381 (b)

注：a.玻璃靶片；b.鋼靶片圖8 BSA的單譜信噪比對比Fig.8 Comparison of S/N ratio in BSA single shot between the different target plates

圖9 ATCC-8739 特征m/z 4 365(a)和m/z 5 381(b)的信噪比散點圖Fig.9 S/N ratio scatter plots of ATCC-8739 at m/z 4 365 (a) and m/z 5 381 (b)

表1 ATCC-8739在玻璃靶片與鋼靶片上細菌指紋比對分數(shù)表Table 1 ATCC-8739 bacterial fingerprint comparison score table on glass and steel target plates