一株源于北派醬香白酒釀造環(huán)境中產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的篩選、鑒定及其特性研究

秦立芹，馬景浩，李二浩，周 陽，楊博思，朱宇婷，吳秋華，田進(jìn)英，李秀婷，4，范光森*

（1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；3.北京華都釀酒食品有限責(zé)任公司，北京 102212；4.北京工商大學(xué)，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

白酒是中國(guó)的國(guó)酒，是一種歷史悠久的蒸餾酒，因其獨(dú)特的固態(tài)釀造方式成為我國(guó)傳統(tǒng)釀造食品中的典范，在中國(guó)飲食文化中占有重要地位[1-2]。傳統(tǒng)白酒釀造是以富含淀粉基質(zhì)的高粱、玉米和大米等為原料，采用邊糖化邊發(fā)酵的“雙邊發(fā)酵”方式協(xié)同進(jìn)行，再經(jīng)過蒸餾、勾調(diào)和貯存等過程釀制的富含千種風(fēng)味物質(zhì)的酒精類飲品[3]。在白酒釀造過程中，“雙邊發(fā)酵”中的糖化和發(fā)酵協(xié)調(diào)一致、有序進(jìn)行是白酒釀造成功的關(guān)鍵，決定了白酒的出酒率和豐富度[4]。如糖化作用不足，原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖量不充分，從而影響酵母的發(fā)酵，導(dǎo)致原料利用率差，出酒率低[5]。高產(chǎn)淀粉酶菌株往往具有高糖化作用，對(duì)于提高白酒出酒率和縮短白酒釀造周期具有重要的作用。為此，有研究者針對(duì)白酒釀造環(huán)境中高產(chǎn)淀粉酶菌株開展了研究，獲得了多株具有提高白酒出酒率等應(yīng)用潛力的優(yōu)良菌株[6]。眾所周知，霉菌是重要的淀粉酶產(chǎn)生菌株，在白酒釀造糖化過程中發(fā)揮一定作用，是眾多研究者篩選白酒釀造環(huán)境中高產(chǎn)淀粉酶的重要關(guān)注菌群，這也是有關(guān)白酒釀酒中高產(chǎn)淀粉酶菌株相關(guān)研究主要集中于霉菌的原因[7]。然而，在白酒釀造過程中，細(xì)菌菌群具有更高的豐度和多樣性，是白酒釀造更為有力的主導(dǎo)者，加強(qiáng)白酒釀造環(huán)境中細(xì)菌功能的研究將會(huì)有助于白酒品質(zhì)的進(jìn)一步提升，尤其是對(duì)其所產(chǎn)酶能力的探究[8]。因此，已有研究者將研究白酒釀酒環(huán)境中高產(chǎn)淀粉酶的菌株聚焦于細(xì)菌，篩選出多株高產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌[9-10]。

醬香型白酒是白酒的基本香型之一，具有“醬香突出，幽雅細(xì)膩，酒體醇厚，回味悠久，空杯留香”的酒體風(fēng)格，深受消費(fèi)者的喜愛[11]。其中，以茅臺(tái)為代表的醬香型白酒因其獨(dú)特的品質(zhì)而廣受好評(píng)，因此，在1975年“八大名酒進(jìn)北京”時(shí)，北京華都釀酒食品有限責(zé)任公司沿襲和創(chuàng)新了茅臺(tái)醬香型白酒的釀造工藝，開啟了一段南醬北傳的歷史傳奇，成為北派醬香的先河，也奠定了華都在北派醬香中的歷史地位。但畢竟南北方的氣候和環(huán)境差異很大，微生物區(qū)系也有較大差異[12]，因此，以華都為代表的北派醬香型白酒在釀造過程上也因地制宜進(jìn)行了創(chuàng)新，從而釀造出了獨(dú)具一格的北派醬香型白酒，如“下沙”時(shí)間段相比茅臺(tái)釀造工藝的“下沙”時(shí)間段后移，以此將釀造好酒的3～5輪次安排在最接近南方炎熱且潮濕氣候的7～9月；冬季寒冷季節(jié)通過供暖系統(tǒng)提高釀造環(huán)境溫度等。為進(jìn)一步提升北派醬香白酒的品質(zhì)，北京華都釀造食品有限責(zé)任公司嘗試通過挖掘釀造環(huán)境中微生物的功能，以白酒釀造驅(qū)動(dòng)力-微生物作為進(jìn)一步深化改革的靶點(diǎn)。因此，本研究正是基于此，采用平板涂布方法結(jié)合淀粉瓊脂篩選培養(yǎng)基透明圈法從其釀造環(huán)境（大曲、酒醅和窖泥）中篩選高產(chǎn)淀粉酶菌株，并通過形態(tài)和細(xì)胞觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，同時(shí)探究其在不同條件下的菌體生長(zhǎng)情況分析其生長(zhǎng)特性和環(huán)境耐受性，以此進(jìn)一步解決因冬季寒冷，入窖溫度低，糖化作用低的問題。本研究將有助于了解華都釀造食品有限責(zé)任公司白酒釀造環(huán)境中產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌微生物情況，為后續(xù)利用功能微生物強(qiáng)化方法提高其出酒率提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

大曲、酒醅和窖泥：2020年8月取自北京華都釀酒食品有限責(zé)任公司釀造車間；可溶性淀粉：美國(guó)Sigma公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；淀粉酶（2萬U/mL）：上海麥克林生化科技有限公司；糖化酶（10萬U/mL）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)生化試劑或分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，瓊脂粉20 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

淀粉瓊脂篩選培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，瓊脂粉20 g/L，可溶性淀粉20 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1 g/L，蛋白胨1 g/L，（NH4）2SO40.25 g/L，MgSO40.02 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 5 g/L，KH2PO40.3 g/L，CaCl2·6H2O 0.025 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min，F(xiàn)eSO4·7H2O滅菌后過膜加入。

高粱酶解液培養(yǎng)基：參照FAN G S等[13]方法進(jìn)行制備。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S電子天平、PB-10 pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YQX-SG46-280S立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCN-1360型生物潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器公司；LHS-100CL恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒儀器設(shè)備有限公司；TU-19紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CKX41-F32FL倒置熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司；Tprofessional 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymeras chain reaction，PCR）儀：德國(guó)Biometra公司；Microfuge2R離心機(jī)：北京田林恒泰科技有限公司；TSQTM8000 evo三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）儀：美國(guó)ThermoFisherScientific公司；ZQZY-C8V振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的篩選和分離

用無菌水將曲粉、窖泥或酒醅樣品稀釋成10-5、10-6和10-7的菌懸液，取100 μL菌懸液涂布于LB平板上，倒置培養(yǎng)于30 ℃，隨時(shí)觀察并挑取菌落形態(tài)特征明顯不同的單菌落，采用分區(qū)劃線法進(jìn)行分離純化，純化菌株保藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

將篩選得到的菌株分別點(diǎn)種于淀粉瓊脂篩選培養(yǎng)基上，于30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，用少量碘液鋪平平板后，靜置1 min，觀察菌落周圍有無透明圈，若有透明圈，則表明菌株能產(chǎn)生淀粉酶根據(jù)透明圈直徑（D2）與菌落直徑（D1）的比值（D2/D1）的大小判斷菌株產(chǎn)淀粉酶的能力。

1.3.3 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將高產(chǎn)淀粉酶菌株接種至LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察；挑取LB平板上單菌落少量菌體，涂布并固定在載玻片上，進(jìn)行革蘭氏染色及芽孢染色，采用油鏡（10×100倍）觀察，記錄細(xì)胞形態(tài)情況[14]。

生理生化實(shí)驗(yàn)：菌株生理生化分析參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]，包括糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化、淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、牛奶石蕊試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定：采用細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒提取初篩獲得的高產(chǎn)淀粉酶菌株的基因組DNA，并以該DNA為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：37.5 μL雙蒸水（ddH2O），4 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs），1 μL上游引物（27F），1 μL下游引物（1492R），1 μL總DNA，0.5 μLTaqDNA聚合酶，5 μL 10×Buffer。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對(duì)，使用MEGA 7.0生物學(xué)軟件對(duì)近似序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株生物學(xué)特性研究

菌株生物學(xué)特性研究參照之前研究報(bào)道[16]，主要包括生長(zhǎng)溫度范圍、pH值范圍、乙醇耐受性、葡萄糖耐受性、NaCl耐受性和己酸耐受性。

1.3.5 菌株產(chǎn)淀粉酶測(cè)定

菌株于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化（37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)18 h）后，按照1%（V/V）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)5 d，每天測(cè)定淀粉酶活力和生物量。

淀粉酶活力采用DNS法進(jìn)行測(cè)定[17]，淀粉酶活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生產(chǎn)1 μmol葡萄糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位（U/mL）。

生物量采用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值）。

1.3.6 菌株產(chǎn)香特性

菌株按照1.3.5中方法進(jìn)行活化后，接種于高粱酶解液中進(jìn)行產(chǎn)香特性分析，培養(yǎng)條件為37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（solid-phase micro-extractiongas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法檢測(cè)其所產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。參照FAN G S等[18]的方法并采取一定修改測(cè)定菌株在高粱酶解液中培養(yǎng)所產(chǎn)揮發(fā)性成分，具體參數(shù)如下：發(fā)酵液裝入頂空瓶中50 ℃平衡30 min，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附30 min，于氣相色譜高溫氣化室解吸5 min后進(jìn)行氣質(zhì)分析。

GC條件：毛細(xì)管色譜柱為DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm），不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣（He），流速為1mL/min，程序升溫：40℃，保留3min，以2℃/min的速率升至100 ℃，保留5 min，再以2 ℃/min升至150 ℃，穩(wěn)定3 min，最后以10 ℃/min升至280 ℃，穩(wěn)定6 min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍35～400 amu，離子源溫度250 ℃，接口溫度250 ℃。

定性定量方法：通過質(zhì)譜解析與NIST 11譜庫和文獻(xiàn)保留指數(shù)比對(duì)確定各化合物結(jié)構(gòu)，并采用四辛醇作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)半定量法計(jì)算各化合物的含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)平行，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用Excel 2016處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選

通過梯度稀釋結(jié)合平板涂布方法先后從大曲、酒醅和窖泥樣品中分離出127株菌株（分別編號(hào)為2-1～2-15，3-1～3-25，4-1～4-25，5-1～5-8，7-1～7-19，12-1～12-19，17-1～17-16；其中從大曲中篩選獲得16株，從酒醅中分離獲得96株，窖泥樣品中分離出15株）。將上述127株菌分別接種到淀粉瓊脂篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，用碘液染色，觀察有無透明圈，代表菌株結(jié)果見圖1。測(cè)定每株菌株形成的透明圈直徑和菌落直徑，并計(jì)算兩者的比值，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

圖1 淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選Fig.1 Screening of amylase-producing bacteria

表1 分離菌株透明圈直徑與菌落直徑比Table 1 Transparent circle diameter and colony diameter ratio of isolated strains

續(xù)表

由表1可知，在所篩選菌株中，將近40%菌株能產(chǎn)生透明圈，這可能與生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，是富含淀粉的釀造環(huán)境選擇和富集的結(jié)果。在這些能產(chǎn)生透明圈的菌株中，其比值差異比較大，表明其所產(chǎn)淀粉酶活力存在一定差異，這主要是由于不同菌株的遺產(chǎn)特性決定的，也正是這些微生物之間存在類似于淀粉酶活力等生物活性的差異，才會(huì)促使不同白酒釀造微生物菌群之間巧妙的有機(jī)結(jié)合，相互促進(jìn)、協(xié)調(diào)和制衡，形成符合其釀造工藝特有的菌群演替規(guī)律，最終獲得對(duì)應(yīng)釀造環(huán)境和生產(chǎn)工藝的產(chǎn)品[19]。相比茅臺(tái)酒廠，北京華都釀酒食品有限責(zé)任公司釀造車間中高產(chǎn)淀粉酶的菌株相對(duì)較少，其比值達(dá)到1.50以上的菌株僅9株，其中，以菌株2-2的比值為最大，為2.25，為此將其確定為本研究的目標(biāo)菌株[20]。

2.2 菌株2-2的鑒定

2.2.1 菌株2-2的形態(tài)特征

由圖2a可知，菌株2-2在LB鑒定平板上的生長(zhǎng)菌落呈白色不透明狀，表面褶皺，邊緣不規(guī)則，內(nèi)部濕潤(rùn)不易挑起；由圖2b可知，菌株2-2革蘭氏染色結(jié)果呈陽性；由圖2c可知，顯微鏡下菌株2-2細(xì)胞形態(tài)為桿狀，鏈狀排列，可形成芽孢，呈橢圓形，兩端鈍圓，芽孢囊不膨大，屬典型細(xì)菌特征。根據(jù)菌株2-2的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)初步確定菌株2-2為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 菌株2-2在LB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征（a）及細(xì)胞形態(tài)特征（b,c）Fig.2 Colony morphological characteristics on LB culture medium (a)and cell morphological characteristics (b and c) of strain 2-2

2.2.2 菌株2-2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，菌株2-2能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，但不能利用乳糖、半乳糖、棉子糖、甘露糖、山梨糖、木糖和海藻糖產(chǎn)酸或產(chǎn)氣；碳源同化試驗(yàn)表明該細(xì)菌能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、棉子糖、甘露糖、山梨糖、木糖和海藻糖等碳源生長(zhǎng)；氮源同化試驗(yàn)結(jié)果表明，該細(xì)菌能利用尿素、硝酸鉀、硫酸銨、L-苯丙氨酸和L-賴氨酸作為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)；硫化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)均為陰性反應(yīng)；V.P.試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)和明膠水解試驗(yàn)均為陽性反應(yīng)，石蕊牛乳試驗(yàn)表明該細(xì)菌能夠產(chǎn)生蛋白酶水解牛乳且具有還原性，能夠使石蕊還原。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，該細(xì)菌與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的生理特性相似度最高，初步認(rèn)為菌株2-2屬于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

表2 菌株2-2的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain 2-2

2.2.3 菌株2-2的分子生物學(xué)鑒定

菌株2-2的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知，菌株2-2與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）及貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）AJAS1的16S rDNA序列同源性最高，相似度達(dá)到99%。綜合菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生理生化和分子生物學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果，菌株2-2被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 基于16S rDNA序列菌株2-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 2-2 based on 16S rDNA sequences

2.3 菌株2-2生物學(xué)特性分析

2.3.1 生長(zhǎng)溫度

白酒釀造時(shí)溫度范圍變化較大，溫度的適當(dāng)升高有利于糖化的進(jìn)行，但過高的溫度也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝能力的降低，影響酶的活性[21]。

由圖4可知，菌株2-2在25～50 ℃的溫度范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)，在30～40 ℃的溫度范圍內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)良好，且其最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃。這表明菌株2-2能夠很好的適應(yīng)糖化過程中溫度的變化，切合北方地區(qū)白酒釀造環(huán)境中溫度的變化，表明其在北方地區(qū)的白酒釀造過程中具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖4 菌株2-2在不同溫度下的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth situation of strain 2-2 at different temperature

2.3.2 生長(zhǎng)pH值

環(huán)境pH值會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生一定影響[22]。在白酒發(fā)酵過程中，原料中的淀粉和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸、氨類化合物或其他產(chǎn)物，從而導(dǎo)致釀造環(huán)境pH的變化[23]，這就要求菌株具有較為寬廣的pH值適應(yīng)范圍，從而適應(yīng)發(fā)酵過程中pH值的變化。由圖5可知，菌株2-2在pH值4～10的范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)，且在pH值5～9時(shí)生長(zhǎng)旺盛，有較好的pH值適應(yīng)性。因此可以在白酒釀造環(huán)境中存活且發(fā)揮其糖化作用。

圖5 菌株2-2在不同pH值下的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth situation of strain 2-2 at different pH

2.3.3 乙醇耐受性

菌株的耐乙醇能力在發(fā)酵白酒的過程中是非常重要的，因?yàn)榘拙漆勗爝^程中產(chǎn)生的乙醇會(huì)抑制細(xì)胞的正常代謝，對(duì)其繁殖也會(huì)造成一定程度的影響[24]。由圖6可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌株2-2的生長(zhǎng)速率下降，但在乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，菌株2-2還能夠生長(zhǎng)，說明其具有較高的耐乙醇能力。在乙醇體積分?jǐn)?shù)10%的范圍內(nèi)，菌株2-2都有很好的生長(zhǎng)，這使得該菌株能夠更好的在釀造環(huán)境中發(fā)揮作用，發(fā)揮糖化力，從而有利于出酒率的提升。

圖6 菌株2-2的乙醇耐受性Fig.6 Ethanol tolerance of strain 2-2

2.3.4 葡萄糖耐受性

淀粉酶在白酒釀造過程中主要起糖化作用，水解釀造原料中的淀粉為后續(xù)的發(fā)酵生產(chǎn)乙醇提供原料，但是過高濃度的糖產(chǎn)生的高滲透壓會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分的流失，對(duì)菌株自身具有一定的危害作用[25]，因此能夠適應(yīng)高糖環(huán)境的菌株對(duì)于糖化過程是有利的。由圖7可知，隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～80%的范圍內(nèi)增加，逐漸形成的高滲透壓會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)速率的下降，但菌株2-2在葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時(shí)還可以生長(zhǎng)，表明具有較強(qiáng)的葡萄糖耐受性，這一特征進(jìn)一步表明了其在白酒釀造中具有潛在的提高白酒產(chǎn)率的應(yīng)用價(jià)值。

圖7 菌株2-2的葡萄糖耐受性Fig.7 Glucose tolerance of strain 2-2

2.3.5 NaCl耐受性

NaCl濃度越高，產(chǎn)生的滲透壓越大，從而會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)水分活度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及組成成分的變化，甚至?xí)档图?xì)胞中酶的活性。微生物的種類不同，其所能適應(yīng)的滲透壓也不同，具有高滲透壓耐受性的微生物細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成多種具有特殊功能的酶，來適應(yīng)環(huán)境的變化[26-27]。由圖8可以看出，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～30%的范圍內(nèi)增加，菌株2-2生長(zhǎng)速率會(huì)受到一定程度的抑制，但其耐受NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以達(dá)到15%，說明菌株2-2具有較好的耐鹽性。這可能是在復(fù)雜的白酒釀造環(huán)境中自然選擇而來的，有利于其快速適應(yīng)白酒釀造環(huán)境。

圖8 菌株2-2的NaCl耐受性Fig.8 NaCl tolerance of strain 2-2

2.3.6 己酸耐受性

白酒在釀造過程中會(huì)產(chǎn)生很多風(fēng)味物質(zhì)，如醇類、酯類等，其中短鏈有機(jī)酸物質(zhì)在這一過程中會(huì)大量積累，同時(shí)酸類也是產(chǎn)生酯類的前體物質(zhì)，但有機(jī)酸含量過高也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，從而影響到白酒的品質(zhì)，基于此考察了菌株的己酸耐受性。由圖9可知，己酸體積分?jǐn)?shù)＜0.02%時(shí)，有利于菌株2-2的生長(zhǎng)，但是隨著己酸添加量的增加，其生長(zhǎng)受到影響，當(dāng)己酸體積分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，菌株已不能生長(zhǎng)，由此可見，該菌株具有一定的己酸耐受性，可能在白酒釀造中發(fā)揮著將己酸轉(zhuǎn)化為己酸乙酯的作用。

圖9 菌株2-2的己酸耐受性Fig.9 Caproic acid tolerance of strain 2-2

2.4 菌株2-2的產(chǎn)酶特性

菌株2-2在37 ℃的條件下培養(yǎng)5 d，每隔24 h取樣進(jìn)行酶活測(cè)定和生物量測(cè)定，產(chǎn)酶結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，淀粉酶的活力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后降低，在第3天達(dá)到最大值，為18.7 U/mL。由圖10亦可知，前2 d菌體生長(zhǎng)較慢，可能處于延遲期，因此產(chǎn)酶較弱，第3天時(shí)菌體生長(zhǎng)較快，產(chǎn)酶能力也隨之加強(qiáng)，在第3天到第4天時(shí)，菌體量迅速增加。通過比較菌體量和淀粉酶活力的變化，在菌體量較高時(shí)，淀粉酶活力反而降低，這可能是由于該菌株所產(chǎn)蛋白質(zhì)酶所致，也正是由于微生物所產(chǎn)酶系的不斷變化才產(chǎn)生了不同香型和品質(zhì)特性的白酒。另外，該酒廠中所產(chǎn)淀粉酶菌株活力相對(duì)較低，這也表明了其采用“下沙”時(shí)間后移，冬季采暖等措施的科學(xué)性。

圖10 菌株2-2的產(chǎn)酶曲線和生長(zhǎng)曲線Fig.10 Enzyme production curve and growth curve of strain 2-2

2.5 菌株2-2的產(chǎn)香特性

通過對(duì)產(chǎn)香特性分析發(fā)現(xiàn)，菌株2-2可以產(chǎn)生乙醇、苯乙醇、正己醇、2-甲基-3-戊醇、4-辛醇、異辛醇、5-甲基-5-壬醇、α-松油醇、糠醇、（2S，3S）-（+）-2,3-丁二醇、香葉醇七種醇類物質(zhì)，其中苯乙醇、正己醇均為醬香型白酒骨架成分[28]；酮類物質(zhì)主要有3-羥基-2-丁酮、1-丁醇2-庚酮、2-羥基-3-戊酮和大馬士酮，其中3-羥基-2-丁酮的濃度達(dá)到0.35 mg/L，它是合成4-甲基吡嗪的前體物質(zhì)，而吡嗪類物質(zhì)是醬香型白酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)[29]，同時(shí)在該菌株的產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)中也檢測(cè)到了2,5-二甲基吡嗪；此外還可以產(chǎn)生丁酸、異丁酸等有機(jī)酸類物質(zhì)和對(duì)乙烯基愈瘡木酚、苯酚兩種酚類物質(zhì)，對(duì)醬香型酒體風(fēng)味也有較大的貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

本研究從北方醬香型白酒大曲中獲得一株產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)分析綜合鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），該菌株在25～45 ℃和pH 5～9的范圍內(nèi)都能良好生長(zhǎng)，同時(shí)還具有12%的乙醇耐受性、15%的NaCl耐受性和70%的葡萄糖耐受性；在37 ℃的條件下培養(yǎng)3 d淀粉酶活力最高，達(dá)到18.7 U/mL。綜上可見，該細(xì)菌對(duì)于北方醬香型白酒釀造具有很好的實(shí)際應(yīng)用意義。