南寧地區(qū)酸檸檬細(xì)菌多樣性及潛在功能分析

何夢(mèng)雪，張 彥，崔夢(mèng)君，郭 壯，熊建文，王玉榮*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽 441053；3.安琪紐特股份有限公司 酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443003；4.柳州工學(xué)院 柳州市螺螄粉植物源性配料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545616）

青檸（Citrus aurantiifolia）隸屬于蕓香科柑橘屬，在我國云南和廣西等地均有栽培，年產(chǎn)量可達(dá)3.5～4.0 t，是世界柑橘類水果中的四大主要栽培種之一[1]。青檸中富含豐富的檸檬酸和維生素C，具有助消化、預(yù)防感冒以及其他抗疾病的功效[2]。酸檸檬是以青檸為原料，并添加食鹽等輔料，經(jīng)過曬干、混合和密封發(fā)酵等過程加工而成的[3]。酸檸檬，既保留了青檸原本的清香與大部分營養(yǎng)，又賦予了成品咸爽的口感，能夠生津健胃，消食解乏[4]。廣西地處亞熱帶，具有四周多山和高原、氣候溫暖、降雨量大等特征，果蔬品類較多，因此獨(dú)具特色的“酸嘢”進(jìn)入廣西人民的餐桌上，當(dāng)?shù)馗骷叶加须缰茩幟实牧?xí)慣，并常將其用作烹飪?nèi)馇蒴~類等的輔料，其中尤以檸檬鴨最為出名，這種制作方式不僅可以降低原料的腥膻味，還能保留酸檸檬酸鮮口感[5-6]。酸檸檬加工工藝簡單，整個(gè)制作過程一般都在常溫常壓下進(jìn)行，成品品質(zhì)易受多種因素影響，尤其是參與發(fā)酵的微生物。目前，對(duì)于酸檸檬的研究主要集中在酸檸檬食品的烹飪[7]和生產(chǎn)工藝的研究[8]等方面，而對(duì)于酸檸檬中微生物多樣性的研究尚少。

隨著測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)以其快速高效的特點(diǎn)，成為微生物群落多樣性解析的重要工具，目前已在發(fā)酵食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9]。王成等[10]通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)Back-slopping發(fā)酵酸粥研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacteria）為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬；安飛宇等[11]通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)自然發(fā)酵豆醬研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬和四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，青霉菌屬（Penicillium）和異常威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces anomalus）為優(yōu)勢(shì)真菌屬；賈晶晶等[12]通過高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，腌漬白菜液中，變形菌門（Proteobacteria）和普羅威登斯菌屬（Providencia）分別為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及在發(fā)酵食品領(lǐng)域的應(yīng)用為解析酸檸檬中微生物群落結(jié)構(gòu)組成提供了重要的技術(shù)支撐。

本研究從廣西壯族自治區(qū)南寧市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)共采集酸檸檬樣品7份，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其微生物群落多樣性進(jìn)行了解析，同時(shí)采用PICRUSt軟件對(duì)酸檸檬樣品中微生物的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為后續(xù)南寧地區(qū)酸檸檬產(chǎn)品品質(zhì)的提升提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

從廣西自治區(qū)南寧市秀廂農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和淡村農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)共采集酸檸檬樣品7份，編號(hào)為NM1～NM7，放置于含有冰袋的采樣箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTPs）Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase（酶活500 U/g）、5×Trans StartTMFastPfu Buffer：北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：索來寶生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD18-T：大連寶生物工程有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：Axygen生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；VeritiFAST梯度PCR儀：美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國Dell公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酸檸檬樣品中微生物宏基因組DNA提取

稱取2.0 g酸檸檬樣品，采用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA對(duì)樣品中微生物宏基因組DNA進(jìn)行提取，將瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格的宏基因組DNA放置于-20 ℃保存，備用。

1.3.2 細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增

使用加入核苷酸標(biāo)簽（barcode）的成對(duì)引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），參照文獻(xiàn)[13]中的PCR擴(kuò)增體系和條件對(duì)酸檸檬樣品中細(xì)菌的16S rRNA V3-V4區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：5×PCR緩沖液4 μL，dNTPs Mix（2.5 mmol/L）2 μL，正反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL，DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，DNA模板10 ng，補(bǔ)充無菌雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。

1.3.3 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過Illumina MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。將返回序列拼接后進(jìn)行質(zhì)控。參照沈馨等[14]的方法，通過QIIME（v1.90）平臺(tái)對(duì)質(zhì)控合格的序列進(jìn)行生物學(xué)信息分析，將使用PyNAST軟件進(jìn)行對(duì)齊后的序列，按照100%和97%相似度進(jìn)行兩步UCLUST法構(gòu)建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣；通過ChimeraSlayer軟件對(duì)含有嵌合體的OTU進(jìn)行選取與去除，其后選取代表性O(shè)TU序列在核糖體核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）數(shù)據(jù)庫RDP、SILVA和Greengenes數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)，確定其不同分類學(xué)地位；計(jì)算超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)從而對(duì)樣品中微生物的豐度和多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.4 PICRUSt功能預(yù)測(cè)

將通過Greengenes數(shù)據(jù)庫比對(duì)后的高質(zhì)量序列進(jìn)行UCLUST劃分與注釋，通過PICRUSt軟件對(duì)酸檸檬樣品中微生物的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)[15]，并依照直系同源蛋白數(shù)據(jù)庫（clusters of orthologous groups of proteins，COG）進(jìn)行功能注釋[16]。

1.3.5 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R軟件進(jìn)行氣泡圖與瀑布圖的繪制；使用Origin 2017軟件進(jìn)行柱狀圖的繪制；使用MEGA 5.0軟件的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸檸檬細(xì)菌序列豐度和多樣性分析

對(duì)本研究采集的7份酸檸檬樣品進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序，其16S rRNA V3-V4區(qū)基因序列測(cè)序結(jié)果、各分類地位數(shù)量統(tǒng)計(jì)及α-多樣性分析結(jié)果見表1。

表1 基于測(cè)序結(jié)果酸檸檬樣品細(xì)菌不同分類學(xué)地位數(shù)量統(tǒng)計(jì)及α-多樣性分析結(jié)果Table 1 Results of quantitative statistics of different taxonomic status and α-diversity analysis of bacteria in acidic lemon samples based on sequencing results

由表1可知，7個(gè)酸檸檬樣品共產(chǎn)生312 150條高質(zhì)量16S rRNA序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生44 593條。按照97%和100%的相似度對(duì)所得序列進(jìn)行劃分且去除嵌合體后共得到8 958條代表性序列和5 223個(gè)細(xì)菌OTU。由表1亦可知，當(dāng)測(cè)序量達(dá)到33010時(shí)，樣品NM3的超1指數(shù)最高，為1116.79，樣品NM5的香農(nóng)指數(shù)最高，為4.13。有研究報(bào)道，超1指數(shù)越大，樣本菌群豐富度越高；香農(nóng)指數(shù)越小，群落多樣性越高[17]。由此可見，樣品NM3的物種豐富度最高，樣品NM5的群落多樣性最高。

2.2 基于微生物分類學(xué)地位酸檸檬樣品細(xì)菌菌群多樣性分析

本研究進(jìn)一步從質(zhì)控合格的序列中挑選代表性序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，共注釋到32個(gè)門、87個(gè)綱、122個(gè)目、198個(gè)科和356個(gè)屬，僅有0.076%和5.63%的合格序列無法注釋到門和屬水平。將7份酸檸檬樣品中平均相對(duì)含量＞1.0%的門和屬定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，將相對(duì)含量＜1.0%的細(xì)菌門和屬定義為others，細(xì)菌門種類及平均相對(duì)含量氣泡圖見圖1。

圖1 基于門水平酸檸檬樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.1 Analysis results of bacterial community structure in acidic lemon samples based on phylum level

由圖1可知，7份酸檸檬樣品在門的分類水平上，平均相對(duì)含量＞1%的細(xì)菌門有4個(gè)，分別為變形菌門（Proteobacteria）（80.61%）、硬壁菌門（Firmicutes）（9.24%）、放線菌門（Actinobacteria）（4.25%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（4.13%）。由圖1亦可知，變形菌門在所有樣品中均存在且相對(duì)含量均＞70%，為酸檸檬中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，不同酸檸檬樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門的組成與含量無明顯差異。葛東穎等[18]同樣采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)與酸檸檬制作工藝相似的來鳳地區(qū)鹽漬藠頭鹽水中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），與本研究結(jié)果相似。

本研究進(jìn)一步對(duì)酸檸檬樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的種類及平均相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖2。

圖2 基于屬水平酸檸檬樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of bacterial community structure in acidic lemon samples based on genus level

由圖2可知，7份酸檸檬樣品在屬分類水平上，平均相對(duì)含量＞1%的細(xì)菌屬有5個(gè)，分別為勞爾氏菌屬（Ralstonia）（66.13%）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）（8.18%）、諾卡氏菌屬（Nocardia）（2.87%）、假單胞菌屬（Pelomonas）（1.27%）和別樣桿菌屬（Alistipes）（1.01%）。值得一提的是勞爾氏菌屬在樣品NM1和NM2中含量較高，分別為71.14%和72.22%，遠(yuǎn)高于其他細(xì)菌屬，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。然而隸屬于上述5個(gè)屬的部分菌種為條件致病菌，如勞爾氏菌屬中大部分菌種都具有將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的能力，從而引起人體中毒乃至死亡，有的則是植物病原菌，從而導(dǎo)致煙草青枯病[19-20]；伯克霍爾德菌屬對(duì)多種抗菌藥物具有耐藥性，其中洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）是引起囊性纖維化及慢性肉芽腫患者感染的最重要條件致病菌[21]。由此可知，自制的酸檸檬樣品存在一定安全隱患。究其原因，可能與原料特性或農(nóng)戶制作酸檸檬開放的發(fā)酵條件有關(guān)，因此在后續(xù)對(duì)酸檸檬樣品的研究中，應(yīng)該在改善加工條件的基礎(chǔ)上篩選出更優(yōu)良的菌株，從而提高產(chǎn)品的安全性；或是采用純培養(yǎng)技術(shù)收集菌株，發(fā)掘其潛在價(jià)值，如大多數(shù)伯克霍爾德氏菌屬物種已證明對(duì)多種作物的不同植物病原體具有良好的生物防治作用；同時(shí)該屬的部分菌株顯示出巨大的生物技術(shù)潛力，可以作為新型抗生素和生物活性次生代謝物的來源[22]。

2.3 OTU統(tǒng)計(jì)分析

本研究進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了樣品中平均相對(duì)含量＞1%的核心OTU構(gòu)成及平均相對(duì)含量，結(jié)果見圖3。

圖3 細(xì)菌核心OTUs平均相對(duì)含量分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of average relative content of bacterial core OTUs

由圖3可知，7份酸檸檬樣品中核心細(xì)菌OTU有6個(gè)，僅占總OTU數(shù)的0.11%，其中有2個(gè)隸屬于僅鑒定到科的瘤胃菌科（Ruminococcaceae），4個(gè)分別隸屬于瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、諾卡氏菌屬、Reyranella和伯克霍爾德菌屬?；?個(gè)核心OUT序列及其模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖4。

圖4 酸檸檬樣品中核心OTUs的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of core OTUs in acidic lemon samples

由圖4可知，6個(gè)核心OTU共分為2大分支，其中OTU2529和OTU4497與纖維素分解瘤胃梭菌（Ruminiclostridium cel lulolyticum）聚為一類，OTU7750與扭鏈瘤胃球菌（Ruminococcustorques）聚為一類，OTU6193和產(chǎn)腔諾卡氏菌（Nocardia coeliaca）聚為一類，OTU1885與胰島素伯克霍爾德氏菌（Burkholderia insulsa）聚為一類，OTU2043與馬西里雷拉菌（Reyranella massiliensis）聚為一類。此外，6個(gè)核心OTU累計(jì)平均相對(duì)含量達(dá)到了89.24%，尤其是OTU4497（隸屬于Ruminococcaceae）在7份酸檸檬樣品中含量分別為76.06%、78.60%、72.80%、77.41%、69.82%、77.75%、72.93和75.05%，由此可見，OTU4497為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)核心OTU。

由圖4亦可知，OTU4497和OTU2529與R.cellulolyticum的相似度≥99%，由此可見，這2個(gè)核心OTU可能具有與R.cellulolyticum相似的功能。許多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，R.cellulolyticum一方面與其他厭氧纖維素分解的微生物一樣，能產(chǎn)生胞外多酶復(fù)合物，其中包含Cel9V和Cel9E等家族9糖苷水解酶，從而使纖維素分解，釋放纖維二糖和纖維糊精，進(jìn)一步降解后，為細(xì)胞提供能量[23-24]；另一方面因其可以分解纖維素的特點(diǎn)，會(huì)對(duì)未來生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化成為生物燃料提供菌株支持[25]。由此可知，酸檸檬中亦可能存在大量有利于生物燃料合成的菌株，從而對(duì)其工業(yè)化的發(fā)展起到積極作用。

2.4 PICRUSt功能預(yù)測(cè)

本研究進(jìn)一步使用PICRUSt軟件對(duì)酸檸檬樣品中細(xì)菌菌群的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫對(duì)樣品預(yù)測(cè)到的功能類別進(jìn)行注釋，結(jié)果見圖5。

圖5 酸檸檬樣品中細(xì)菌功能類別分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of functional categories of bacteria in acidic lemon samples

7份酸檸檬樣品中細(xì)菌序列注釋到的COG有4 173個(gè)，分別隸屬于23個(gè)功能類別。由圖5可知，有關(guān)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換功能的序列在酸檸檬細(xì)菌序列中占比分別為7.19%和9.04%，而細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分割、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、RNA的加工與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞骨架的潛在表達(dá)則相對(duì)較低。由圖5亦可知，7份酸檸檬樣品共分為2大類，樣品NM1、NM2、NM3、NM5、NM6和NM7中細(xì)菌功能之間存在一定的相似性，而樣品NM4與其他樣品之間細(xì)菌功能存在較大的差異。高秀芝等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在豆醬發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)被分解成氨基酸，從而產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味與優(yōu)良的品質(zhì)。由此推測(cè)，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝功能在酸檸檬樣品中的高表達(dá)，會(huì)對(duì)其品質(zhì)與風(fēng)味產(chǎn)生一定的積極作用。

3 結(jié)論

本研究利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)7份廣西南寧地區(qū)酸檸檬樣品的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，酸檸檬樣品的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群組間差異不顯著，且分布較為均勻。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Ralstonia、Burkholderia、Nocardia、Pelomonas和Alistipes?；蚬δ芗氨硇皖A(yù)測(cè)結(jié)果表明，酸檸檬中具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換功能的細(xì)菌序列占比較高。此外，潛在致病菌的檢出指示，應(yīng)該改善發(fā)酵條件或篩選出更優(yōu)良的菌株控制發(fā)酵進(jìn)程以提高產(chǎn)品的安全性。