基于高通量測(cè)序技術(shù)分析濃香型白酒大曲真菌菌群多樣性

周 森，王 成，朱紹賓，趙文俊，劉京國(guó)

（北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

白酒是我國(guó)特有的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，具有悠久的釀造歷史和文化內(nèi)涵，根據(jù)不同香型分類，我國(guó)白酒可被細(xì)分為清香型、濃香型、米香型、醬香型等12種香型。其中，濃香型白酒以“窖香濃郁、綿柔甘洌、香味協(xié)調(diào)”的酒體風(fēng)格在我國(guó)白酒行業(yè)中占據(jù)主導(dǎo)地位，其年產(chǎn)量占全國(guó)白酒的70%左右，在國(guó)家級(jí)名酒中約占50%[1]。濃香型白酒風(fēng)味的形成除與原料、釀造工藝有關(guān)，還與大曲的質(zhì)量有著重要聯(lián)系，大曲是濃香型白酒生產(chǎn)的前提，是釀造優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的關(guān)鍵[2]。濃香型大曲常以小麥為原料，采用生料制曲，自然接種，自然發(fā)酵而成，品溫可達(dá)50～60 ℃[3]。由于大曲制作過(guò)程中受原料、環(huán)境的影響較大，使得大曲中微生物情況十分復(fù)雜。已有研究表明，濃香型大曲中含有大量不同種類的真菌和細(xì)菌，其代謝所產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等對(duì)白酒發(fā)酵、生香及產(chǎn)酯等方面起著重要作用[4]。

目前，對(duì)于濃香型大曲真菌微生物研究主要有傳統(tǒng)分離方法和免培養(yǎng)方法兩種。如向慧平等[5]利用純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)11份濃香型白酒大曲酵母進(jìn)行選擇性分離，所獲得的194株酵母菌均歸屬于酵母目；竇驍?shù)萚6]對(duì)濃香型白酒大曲酵母菌進(jìn)行分離鑒定，共獲得260株酵母菌，分為22個(gè)種，并確定異常維克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）是制曲過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)酵母，扣囊覆膜酵母是成品曲中的優(yōu)勢(shì)酵母。傳統(tǒng)分離雖然能夠有效獲得大曲活體菌株，但由于大曲微生物往往適應(yīng)了高溫、低水分的制曲環(huán)境，在人工培養(yǎng)模式下，由于培養(yǎng)環(huán)境和條件的不同，會(huì)導(dǎo)致微生物可培養(yǎng)性降低，大量具有重要作用的微生物資源被埋沒(méi)[7]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，對(duì)大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)的研究不再受傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術(shù)的限制，如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、高通量測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)可直接從分子水平研究大曲真菌微生物資源，為大曲真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性解析奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。如譚崇堯等[8]利用高通量測(cè)序?qū)Σ煌赜驖庀阈桶拙拼笄M(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)研究，結(jié)果表明北方派濃香型白酒大曲優(yōu)勢(shì)真菌有熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）等，長(zhǎng)江中游派優(yōu)勢(shì)真菌為曲霉屬（Aspergillus）、熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬，江淮派優(yōu)勢(shì)真菌有曲霉屬、熱子囊菌屬、耐干霉菌屬（Xeromyces）等，川派優(yōu)勢(shì)真菌有熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬、曲霉屬等；吳樹(shù)坤等[9]利用高通量測(cè)序分析了四川不同地區(qū)濃香型白酒大曲微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)大曲中優(yōu)勢(shì)真菌為嗜熱真菌屬、曲霉屬、嗜熱子囊菌屬、絲衣霉屬（Byssochlamys）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）；施思等[10]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了濃香型白酒大曲貯藏過(guò)程中微生物多樣性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在貯存過(guò)程中大曲真菌群落結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，畢赤酵母屬（Pichia）、根霉屬（Rhizopus）及橫梗霉屬（Lichtheimia）成為最終的優(yōu)勢(shì)菌群。

濃香型白酒在我國(guó)的白酒消費(fèi)市場(chǎng)上占據(jù)著主導(dǎo)的地位，因此對(duì)濃香型白酒大曲中的微生物進(jìn)行研究，對(duì)解析大曲的代謝機(jī)理、豐富大曲微生物資源及保證大曲質(zhì)量具有十分重要的意義。目前，雖然已有濃香型大曲真菌群落組成的相關(guān)研究，但多數(shù)研究往往采用較為傳統(tǒng)的微生物分離技術(shù)及DGGE技術(shù)，難以系統(tǒng)確定大曲真菌組成情況，即使部分研究運(yùn)用了高通量測(cè)序，但所研究樣品往往存在數(shù)量較少的問(wèn)題，很難全面反應(yīng)濃香型大曲真菌真實(shí)組成情況。因此，本實(shí)驗(yàn)從四川15家不同濃香型白酒企業(yè)采集大曲樣品，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析其真菌群落組成及多樣性，為進(jìn)一步解析濃香型大曲微生物及微生物篩選等工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

大曲樣品：分別采集自四川15家濃香型白酒酒企，編號(hào)為NX-1～NX-15，其中樣品NX-1采集自四川巴中，NX-4、NX-6、NX-10、NX-11采集自四川成都，NX-3、NX-7、NX-8、NX-13采集自四川瀘州，NX-2、NX-5采集自四川綿陽(yáng)，NX-12采集自四川遂寧，NX-9、NX-14、NX-15采集自四川宜賓。樣品采集后砸碎混勻，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

三氯甲烷、月桂酸鈉、異戊醇、異丙醇（均為分析純）：上海生工生物工程有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、酚（Phenol）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1-14k高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；C1000快速梯度基因擴(kuò)增儀；Powerpac Basic基礎(chǔ)型水平電泳儀；GelDoc XR+BIO-RAD全自動(dòng)凝膠成像儀：美國(guó)BIORAD公司：Illumina MiSeq測(cè)序儀：北京奧維森基因科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲總DNA的提取

從-80 ℃冰箱中各取1 g大曲樣品放入研缽中，倒入液氮，迅速研磨成粉末后轉(zhuǎn)移到50 mL無(wú)菌離心管中，加入10 mL月桂酸鈉緩沖液（5.844 g NaCl，10 g月桂酸鈉，100 mL 1.0 mol/L Tris-HCl，40 mL 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0，定容至1 L），并緩慢搖動(dòng)離心管15～20 min。加入10 mL苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V），緩慢搖動(dòng)10 min，12 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min。吸取16 mL上清液至50 mL離心管中，加入12.8 mL異丙醇，上下緩慢顛倒數(shù)次，12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清。加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇反復(fù)輕輕振蕩洗滌沉淀，12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄乙醇。重復(fù)上一步驟后，將白色沉淀再次在12 000 r/min、4 ℃條件下短暫離心數(shù)秒，用移液槍吸干殘留乙醇，白色沉淀置于37 ℃干燥箱中，烘干后添加0.9 mL TE緩沖液（pH 8.0）溶解脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[11]。

1.3.2 Illumina MiSeq高通量測(cè)序

DNA檢測(cè)合格后，送往北京奧維森公司，利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)大曲真菌ITS1區(qū)基因序列進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序引物內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）1-F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-TGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過(guò)濾、剔除嵌合體，舍棄低質(zhì)量序列等。利用USEARCH（v11.0.667）將序列按97%相似度聚類為可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。利用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）在UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//unite.ut.ee/analysis.php）對(duì)真菌序列進(jìn)行分類注釋，獲得有效的OTU分類學(xué)信息。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

利用Mothur（v1.42.1）對(duì)序列數(shù)進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算出稀疏曲線數(shù)據(jù)、Alpha多樣性指數(shù)；基于R語(yǔ)言（3.6.1）分析微生物門(mén)、綱、屬組成情況；基于R語(yǔ)言的vegan包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA），進(jìn)而分析不同濃香型大曲真菌組成情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型白酒大曲真菌群落多樣性分析

2.1.1 稀釋曲線

有研究表明，稀釋曲線能夠反應(yīng)測(cè)序深度情況[12]。濃香型白酒大曲樣品真菌菌群的稀釋曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，15份大曲樣品的稀釋曲線隨測(cè)序深度的增加呈現(xiàn)先直線上升后緩慢上升直至趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序樣品數(shù)據(jù)量已經(jīng)能夠反映樣品中絕大多數(shù)的微生物菌群信息，再增加測(cè)序深度也無(wú)法獲得更多的OTU，真菌菌群的多樣性也不會(huì)發(fā)生改變，所測(cè)數(shù)據(jù)能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

圖1 濃香型白酒大曲樣品真菌菌群稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of fungal community in strong-flavor Baijiu Daqu samples

2.1.2 Alpha多樣性分析

15份大曲樣品的真菌ITS區(qū)測(cè)序共獲得657 848條真菌序列，按照97%相似度歸類，并進(jìn)行Alpha多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 15份濃香型白酒大曲樣品真菌菌群α-多樣性指數(shù)分析結(jié)果Table 1 Analysis results of α-diversity indexes of fungal community in 15 strong-flavor Baijiu Daqu samples

由表1可知，15份大曲樣品累計(jì)共獲得393個(gè)OTU，樣品NX-9的OTU數(shù)最高，達(dá)到163，樣品NX-6的OUT數(shù)最低為52。Goods coverage、Chao1、Shannon指數(shù)是Alpha多樣性常用指數(shù)，其中Goods coverage指數(shù)用來(lái)反映測(cè)序得到的微生物群落的覆蓋率[13]，15份濃香型大曲樣品的Goods coverage均＞99.79%，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)測(cè)序結(jié)果能夠很好地反映樣品中真菌的情況。Chao1指數(shù)用于計(jì)算物種豐度，其值越大說(shuō)明樣品的微生物群落的豐度越高，15份大曲樣品中，樣品NX-7的Chao1指數(shù)最高，達(dá)到308.3，樣品NX-6的Chao1指數(shù)最低，僅為65.6。Shannon指數(shù)常用于計(jì)算菌群多樣性指數(shù)，其值越大說(shuō)明群落多樣性越高，15份大曲樣品中，樣品NX-9的Shannon指數(shù)最高，為3.683，樣品NX-7的Shannon指數(shù)最低，僅為0.847。結(jié)果表明，不同濃香型白酒大曲真菌微生物豐度及群落多樣性存在較大差異。

2.1.3 Beta多樣性分析

為進(jìn)一步分析不同濃香型白酒大曲真菌群落相似性，本研究基于Bray Curtis距離對(duì)測(cè)序獲得的OTU進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）分析，以反應(yīng)不同大曲真菌組成相似度，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基于OUT 15份濃香型白酒大曲樣品真菌菌群PCoA結(jié)果Fig.2 PCoA results of fungal community in 15 strong-flavor Baijiu Daqu samples based on OTU

PCoA常用來(lái)研究樣本群落組成的相似性或差異性[14]，各個(gè)點(diǎn)之間的距離越大，表明它們之間的菌群差異越大[15]。由圖2可知，PCoA1和PCoA2對(duì)樣品差異性方差貢獻(xiàn)率分別為30.16%和17.98%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為48.14%，其余主成分方差貢獻(xiàn)率均低于10%，說(shuō)明同一香型大曲中，15份大曲樣品真菌組成存在一定差異，但并不明顯。樣品NX-1、NX-3、NX-4、NX-10、NX-11距離較近，樣品NX-2和NX-8距離較近，說(shuō)明樣品NX-1、NX-3、NX-4、NX-10、NX-11真菌菌群組成相似，樣品NX-2和NX-8真菌組成相似，其余樣品距離較遠(yuǎn)，未出現(xiàn)明顯聚類，說(shuō)明不同酒廠濃香大曲真菌組成之間存在一定差異性。

2.2 濃香型白酒樣品真菌菌群組成分析

基因門(mén)、綱及屬水平15份濃香型白酒大曲樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。由圖3a可知，15份濃香型白酒大曲所檢測(cè)到的393個(gè)真菌OTU隸屬于6個(gè)門(mén)19個(gè)綱和117個(gè)屬。在門(mén)分類水平，6個(gè)門(mén)分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、毛霉門(mén)（Mucoromycota）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、羅茲菌門(mén)（Rozellomycota）。其中，子囊菌門(mén)在15份大曲中相對(duì)豐度較高，達(dá)到67.98%～99.48%，毛霉門(mén)在樣品NX-9（26.98%）、NX-11（14.62%）和NX-6（11.13%）中相對(duì)豐度較高，其余門(mén)相對(duì)豐度較低。

圖3 基于門(mén)（a）、綱（b）及屬（c）水平15份濃香型白酒大曲樣品真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Fungal community structure of 15 strong-flavor Baijiu Daqu samples at phylum (a),class (b) and genus (c) level

在綱分類水平上，共有19個(gè)綱被檢測(cè)到，將相對(duì)豐度＜1%及無(wú)法歸類的綱合并為others。由圖3b可知，15份大曲樣品中，酵母綱（Saccharomycetes）和散囊菌綱（Eurotiomycetes）的相對(duì)豐度較高，二者相對(duì)豐度之和達(dá)到58.8%～99.1%。另外，Mucoromycetes在樣品NX-9（26.98%）、NX-11（14.62%）、NX-6（11.13%）中也占有較高相對(duì)豐度，其余綱相對(duì)豐度較低。

在屬分類水平上，共檢測(cè)到117個(gè)真菌屬，將相對(duì)豐度＜1%及無(wú)法歸類的屬合并為others。由圖3c可知，15份大曲樣品中真菌菌群出現(xiàn)明顯差異。樣品NX-1、NX-4、NX-11中以嗜熱類真菌的熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）為主，相對(duì)豐度較高，兩者相對(duì)豐度之和達(dá)45.6%～31.3%，同時(shí)還含有一定量的覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（18.7%～40.4%）和曲霉屬（Aspergillus）（5.4%～22.4%）。樣品NX-3、NX-10、NX-13、NX-6和NX-14則主要以酵母類的覆膜孢酵母屬和畢赤酵母屬（Pichia）為主，兩者相對(duì)豐度之和達(dá)到46.4%～83%。樣品NX-5、NX-12、NX-15、NX-7中曲霉屬相對(duì)豐度較高，能夠達(dá)到50%～89.3%。樣品NX-9中絲狀真菌相對(duì)豐度較高，曲霉屬和根毛霉屬（Rhizomucor）相對(duì)豐度之和達(dá)56.6%。樣品NX-2主要以酵母類的威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）和酵母屬（Saccharomyces）為主，相對(duì)豐度之和達(dá)到56.9%。樣品NX-8以酵母類的耐堿酵母屬（Galactomyces）和雙足酵母屬（Dipodascus）為主，相對(duì)豐度之和能夠達(dá)到59%。

結(jié)果表明，雖然15份大曲樣品門(mén)分類和綱分類較為一致，但真菌屬組成存在較大的差異，絲狀真菌類的Thermoas cus、Thermomyces、曲霉屬、根毛霉屬以及酵母類的酵母屬、覆膜孢酵母屬、畢赤酵母屬、威克漢姆酵母屬、耐堿酵母屬和雙足酵母屬在不同大曲樣品中相對(duì)豐度較高。在白酒釀造過(guò)程中，絲狀真菌往往能夠分泌多種酶類將原料中的淀粉、脂肪等降解，為酒醅的后期發(fā)酵提供多種前體物質(zhì)。如曲霉屬能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等，是白酒發(fā)酵中淀粉等大分子物質(zhì)分解的主要?jiǎng)恿χ籟16-17]。根毛霉屬具有較強(qiáng)的產(chǎn)脂肪酶能力[18]。嗜熱菌屬和嗜熱囊菌屬同屬于嗜熱真菌類，能夠生成具有更高熱穩(wěn)定性的木聚糖酶、脂肪酶等多種工業(yè)用酶類[19-20]。橫梗霉屬具有產(chǎn)α-淀粉酶、葡萄糖苷酶、纖維素酶和半纖維素酶的能力[21-23]。與絲狀真菌相比，酵母類真菌在產(chǎn)香、產(chǎn)酒等方面具有較強(qiáng)作用，酵母屬是白酒釀造過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)酵母屬之一，能夠產(chǎn)生多種風(fēng)味酯并貢獻(xiàn)乙醇和其他有機(jī)酸[24-25]。畢赤酵母屬、覆膜孢酵母屬、假絲酵母屬是大曲成熟過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬之一，在白酒釀造中具有潛在的風(fēng)味貢獻(xiàn)功能，其中覆膜孢酵母屬具有較高的淀粉酶和糖苷酶活性，能將淀粉或多糖降解為低分子質(zhì)量糖，最終水解為葡萄糖，在發(fā)酵前期起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)覆膜孢酵母屬還能夠生成較多的多元醇，能夠提高白酒純甜感，改進(jìn)白酒后味[26-28]。威克酵母屬能夠?qū)⒃现械那绑w物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酯、酸、醇、醛等風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)白酒風(fēng)味形成有重要作用[29]。耐堿酵母屬、雙足酵母屬在白酒微生物研究中也有報(bào)道，但功能性研究較少，如王鵬等[30]在中國(guó)白酒發(fā)酵過(guò)程核心微生物群研究中，將雙足酵母屬列為核心微生物之一；李凱敏等[31]研究表明，耐堿酵母屬是特香型釀造過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌之一，并在底糟中占到較高的比例。

3 結(jié)論

通過(guò)高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，15份濃香型白酒樣品中真菌群落的豐度和多樣性存在較大差異，其中樣品NX-1、NX-3、NX-4、NX-10、NX-11真菌組成相似，樣品NX-2和NX-8真菌組成相似，其他樣品真菌組成差異較大。15份大曲樣品中共檢測(cè)到393個(gè)操作分類單元（OTU），隸屬于6個(gè)門(mén)19個(gè)綱和117個(gè)屬，其中子囊菌門(mén)（Ascomycota）、酵母綱（Saccharomycetes）和散囊菌綱（Eurotiomycetes）在15份大曲樣品中的相對(duì)豐度均較高。在屬分類水平上，15份大曲樣品出現(xiàn)明顯差異，樣品NX-1、NX-4、NX-11中的熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces），樣品NX-3、NX-10、NX-13、NX-6和NX-14中的覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、畢赤酵母屬（Pichia），樣品NX-5、NX-12、NX-15、NX-7中的曲霉屬（Aspergillus），樣品NX-9中的曲霉屬和根毛霉屬（Rhizomucor）、樣品NX-2中的威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、酵母屬（Saccharomyces），及樣品NX-8中的耐堿酵母屬（Galactomyces）和雙足酵母屬（Dipodascus）相對(duì)豐度較高。本研究能夠在一定程度上豐富人們對(duì)四川濃香型白酒大曲真菌菌群的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步濃香型白酒大曲優(yōu)勢(shì)真菌微生物功能性研究及特色菌株應(yīng)用提供一定理論支撐。