浙江玫瑰醋異常發(fā)酵微生物的鑒定及控制途徑探索

賀德貴，邢利民，盛明健，黃炳文，朱軍莉，張林祥，蔣予箭*

（1.湖州老恒和釀造有限公司，浙江 湖州 313000；2.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

食醋是一種日常生活中不可或缺的酸性調(diào)味品，不僅能增進(jìn)食欲、防腐殺菌，還具有防心血管疾病、抗癌抗衰老、緩解消除疲勞、防止感冒等功效。浙江玫瑰醋因色澤如玫瑰般艷麗而得名，酸中帶甜、口感柔和、香氣獨(dú)特，深受江浙一帶消費(fèi)者的喜愛。玫瑰醋的發(fā)酵工藝獨(dú)特，為靜態(tài)表面自然發(fā)酵[1]。但浙江玫瑰醋的釀造受季節(jié)的限制，一年只能生產(chǎn)一次到兩次，在生產(chǎn)過程中經(jīng)常由于氣候潮濕而導(dǎo)致異常發(fā)酵變質(zhì)，即醋醪表面產(chǎn)生膜醭，處理不當(dāng)會(huì)使醋醪渾濁褪色，影響產(chǎn)品品質(zhì)[2]，這給產(chǎn)量不占優(yōu)勢(shì)的玫瑰醋行業(yè)帶來了較大的問題。

食醋依靠微生物發(fā)酵而成，自然也容易因?yàn)槲⑸镂廴径a(chǎn)生膜醭甚至異常發(fā)酵變質(zhì)，而膜醭的形成是由于單一運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞互相黏連而形成細(xì)胞長(zhǎng)鏈，然后產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)相互黏附[3]。隨著宏基因組等分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物菌群被鑒定分析。由于食醋的釀造工藝存在差異，食醋污染的來源和微生物種類也有所不同，翟磊等[4]研究發(fā)現(xiàn)，食醋中耐酸乳桿菌能消耗碳源并產(chǎn)生乳酸，從而導(dǎo)致食醋酸?。焕顐惖萚5]從異常發(fā)酵醋中分離出多株細(xì)菌，且絕大多數(shù)為革蘭氏陽性菌；孫文麗等[6]在脹袋食醋中不僅發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，還分離出了腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis）。浙江玫瑰醋是個(gè)復(fù)雜的多菌種體系，釀造季節(jié)高溫且多雨水，草缸蓋若不定期晾曬，容易使異常發(fā)酵微生物肆意生長(zhǎng)，致使釀造中的玫瑰醋微生物生態(tài)失衡[7]。

目前玫瑰醋研究仍未見有關(guān)異常發(fā)酵菌的相關(guān)報(bào)道，鑒于此，本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法分離異常發(fā)酵玫瑰醋中的微生物，通過回接實(shí)驗(yàn)分析菌株的異常發(fā)酵特征，并通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定微生物種屬，同時(shí)探究培養(yǎng)溫度、酸度、酒精度對(duì)主要異常發(fā)酵微生物生長(zhǎng)特性的影響，為控制玫瑰醋異常發(fā)酵變質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常玫瑰醋醋樣品、異常發(fā)酵玫瑰醋樣品：寧波佐餐王食品有限公司、湖州老恒和釀造有限公司、浙江五味和食品有限公司；營養(yǎng)瓊脂、虎紅瓊脂培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、真菌基因組DNA提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；HBPX220聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：英國Hybaid Limited公司；DChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio Rad公司；NSKY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 異常發(fā)酵玫瑰醋樣品微生物的分離

用無菌玻璃棒挑取異常發(fā)酵玫瑰醋表面的膜醭于10 mL無菌生理鹽水中，將其振蕩混勻，按等梯度稀釋至10-6，然后分別取100 μL不同梯度的稀釋液，均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂和虎紅瓊脂培養(yǎng)基上，將接種后的培養(yǎng)基分別置于37 ℃和30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。挑去形態(tài)各異的菌落進(jìn)行劃線分離純化，記錄純化后的單菌落形態(tài)，將真菌和革蘭氏染色后的細(xì)菌，在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，并斜面保藏，待用。

1.3.2 回接實(shí)驗(yàn)

取同批次中酸度和酒精度與異常發(fā)酵醋樣品相近的正常玫瑰醋，用0.22 μm濾膜過濾除菌。挑取分離的細(xì)菌及真菌菌株，分別接種到LB肉湯和麥芽汁培養(yǎng)基，分別在37 ℃和30 ℃條件下?lián)u床擴(kuò)培12～18 h。取5 mL擴(kuò)培后的懸浮液分別接種于50 mL正常玫瑰醋中，以不接種組為空白對(duì)照（M-0），在32 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，觀察玫瑰醋樣品的異常發(fā)酵和產(chǎn)膜醭現(xiàn)象。

1.3.3 異常發(fā)酵微生物的分子生物學(xué)鑒定

分別用真菌DNA提取試劑盒和細(xì)菌DNA提取試劑盒，提取純化后6株分離菌株的基因組DNA。以提取的基因組為模板，細(xì)菌以27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物PCR擴(kuò)增16S rDNA，PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GCbuffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水（ddH2O）8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，46.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。真菌以內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）為引物PCR擴(kuò)增18S rDNA，PCR擴(kuò)增體系同上。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性搜索比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA、18S rDNA基因序列，利用Clustal X軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，再使用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 異常發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)特性分析

活化分離鑒定的異常發(fā)酵微生物，按5%（V/V）的接種量接種于50 mL正常玫瑰醋中，在不同溫度（27 ℃、32 ℃、37 ℃）、不同pH值（3、5、7）、酒精度（0、2.5% vol、5.0% vol）條件下培養(yǎng)48 h，每4 h取樣，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm）。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

每組樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，并利用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 異常發(fā)酵玫瑰醋中微生物的分離

經(jīng)過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和虎紅培養(yǎng)基培養(yǎng)分離，初步分離得到4株細(xì)菌（X-1～X-4）和2株真菌（Z-1、Z-2）。各菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，4株細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后都呈紫色，即均為革蘭氏陽性（G+）細(xì)菌，其中菌株X-1、X-4的菌落為白色不透明，邊緣不整齊，細(xì)胞呈球形；菌株X-2和X-3的菌落呈點(diǎn)狀、表面光滑、邊緣整齊，菌株X-1的細(xì)胞呈短桿狀，菌株X-3的細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀。2株真菌Z-1、Z-2的菌落表面濕潤、呈粉紅色、邊緣光滑整齊，細(xì)胞呈橢圓形。

圖1 異常發(fā)酵玫瑰醋中分離微生物的菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of microorganisms isolated from abnormally fermented rosy vinegar

2.2 回接實(shí)驗(yàn)

將6株菌回接到正常玫瑰醋中，以不接種組為空白對(duì)照（M-0），靜置培養(yǎng)7 d后，觀察接種后醋樣的異常發(fā)酵和產(chǎn)膜醭現(xiàn)象，結(jié)果見表1。

表1 各菌株回接實(shí)驗(yàn)的異常發(fā)酵現(xiàn)象Table 1 Abnormal fermentation phenomenon of back-test experiment of each strain

由表1可知，從玫瑰醋的顏色變化發(fā)現(xiàn)，接種4株細(xì)菌的醋樣都能保持與對(duì)照組類似的玫瑰色或淡玫瑰色，而接種真菌Z-1和Z-2的醋樣顏色呈較深的暗紅色和棕色。從玫瑰醋的酸度變化發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組pH值為3.12，而除接種菌株X-2的醋樣外，其他醋樣的pH值升高，其中接種真菌Z-1、Z-2的醋樣pH較高，分別為4.78、5.12，顯然2株真菌生長(zhǎng)過程中表現(xiàn)出氮代謝積累堿性物質(zhì)的情形，pH升高會(huì)有利于其他細(xì)菌的繁殖生長(zhǎng)。從玫瑰醋的氣味變化發(fā)現(xiàn)，接種菌株X-1、Z-1和Z-2的醋樣均有淡醋酸氣味，接種菌株X-3的醋樣有較淡醋酸味且略帶異味，接種菌株X-2的醋樣酸味較重且略帶異味，而接種菌株X-4的醋樣則有明顯的異常發(fā)酵臭味，說明菌株X-4是關(guān)聯(lián)玫瑰醋異常發(fā)酵的主要微生物之一。從產(chǎn)膜醭情況發(fā)現(xiàn)，4株細(xì)菌都不產(chǎn)生膜醭，僅接種菌株X-4的醋樣底部出現(xiàn)膜狀沉淀，而接種真菌Z-1和Z-2的醋樣在培養(yǎng)1～2 d后液體表面形成膜醭。正常的玫瑰醋發(fā)酵中期，醪液表面可見清晰的樹枝狀醋酸菌膜，“翻缸”操作時(shí)會(huì)將醋酸菌膜打碎，但第二天就會(huì)重新形成這種醋酸菌膜。異常發(fā)酵總是從液體表面形成粗糙而厚實(shí)的異樣膜璞開始，這種粗糙的膜璞會(huì)迅速阻礙醋酸菌膜的存在，醪液的酸度就不再增加，行業(yè)內(nèi)將這種有異常膜璞的醋叫“桐油醋”，推測(cè)2株真菌是玫瑰醋產(chǎn)生膜醭的主要微生物。

2.3 異常發(fā)酵微生物的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

細(xì)菌X-1、X-2、X-3、X-4的16S rRNA及真菌Z-1和Z-2的18S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，6株菌經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得預(yù)期大小的產(chǎn)物，電泳條帶清晰明亮。

圖2 6株菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products of 6 strains

分別基于16S rDNA、18S rDNA基因序列構(gòu)建4株細(xì)菌及2株真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

由圖3A可知，菌株X-1與類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）聚于一支，親緣關(guān)系最近，鑒定其為類芽孢桿菌（Paenibacillussp.），何銀等[8]對(duì)赤水曬醋的異常發(fā)酵微生物研究發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌是引起醋異常發(fā)酵的菌株之一，其在15 ℃時(shí)生長(zhǎng)很微弱，pH 3.0時(shí)幾乎不生長(zhǎng)，能耐受5%以上的鹽分；王虎虎等[9]對(duì)真空包裝鹽水鵝貯藏期的優(yōu)勢(shì)菌群研究發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌生存能力強(qiáng)，分解蛋白質(zhì)能力較強(qiáng)，是產(chǎn)品貯藏后期的主要異常發(fā)酵菌。菌株X-2與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）聚于一支，親緣關(guān)系最近，鑒定其為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），其為革蘭氏陽性耐鹽的食源性致病菌，在食品加工過程中易污染食品。菌株X-3與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）聚于一支，親緣關(guān)系最近，鑒定其為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），是人體皮膚黏膜常見的正常菌群，可能與醋發(fā)酵過程中人工操作污染有關(guān)。王向陽等[10]研究發(fā)現(xiàn)，脹袋的腌蘿卜干中存在表皮葡萄球菌，不過其產(chǎn)氣緩慢，產(chǎn)氣量較少。菌株X-4與蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）聚于一支，親緣關(guān)系最近，鑒定其為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），該革蘭氏陽性菌產(chǎn)孢子，常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)和碳水化合物含量高的食物，在腐質(zhì)食物中含量也較高，產(chǎn)生的毒素會(huì)引起食物中毒[11]。研究顯示，蠟狀芽孢桿菌會(huì)引起榨菜異常發(fā)酵變質(zhì)，引起榨菜“胖袋”現(xiàn)象[12]；在異常發(fā)酵后的韓國豆腐中分離到兩株異常發(fā)酵菌，鑒定均為蠟狀芽孢桿菌[13]。

由圖3B可知，真菌菌株Z-1與庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）聚于一支，親緣關(guān)系最近，鑒定其為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。菌株Z-2與盔形畢赤酵母（Pichia manshurica）聚于一支，親緣關(guān)系最近，鑒定其為盔形畢赤酵母（Pichia manshurica）。在發(fā)酵食品中真菌引起的污染較為常見，畢赤酵母屬在弱酸環(huán)境下生長(zhǎng)，是導(dǎo)致泡菜生花的主要污染微生物之一[14]，在異常發(fā)酵后，泡菜中庫德里阿茲威畢赤酵母數(shù)量成倍增加[15]，在米酒釀造過程中也經(jīng)常發(fā)生野生畢赤酵母、異常漢遜酵母的污染[16]。MOON S H等[17]研究報(bào)道，庫德里阿茲威畢赤酵母是泡菜中產(chǎn)膜醭的主要腐敗菌，導(dǎo)致泡菜的不良風(fēng)味、質(zhì)地軟化；SAEZ J S等[18]研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母屬是導(dǎo)致葡萄酒異常發(fā)酵的原因之一。

圖3 基于16S rDNA基因序列細(xì)菌（A）和基于18S rDNA基因序列真菌（B）的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria (A) based on 16S rDNA gene sequence and fungi (B) based on 18S rDNA gene sequence

2.4 異常發(fā)酵微生物在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特性

培養(yǎng)溫度、pH和酒精度對(duì)異常發(fā)酵微生物生長(zhǎng)特性的影響見圖4。由圖4a可知，產(chǎn)膜醭的真菌菌株Z-1、Z-2、金黃色葡萄球菌X-2、蠟狀芽孢桿菌X-4在26～40 ℃較廣的溫度區(qū)間都有較快的生長(zhǎng)速度，而類芽孢桿菌X-1、表皮葡萄球菌X-3的生長(zhǎng)速度要慢得多，僅在32 ℃生長(zhǎng)較好。玫瑰醋釀造主要依靠夏季高溫，使醋酸菌處于較為適宜的條件下將酒精轉(zhuǎn)化為醋酸，當(dāng)溫度低于28～30 ℃時(shí)，醋酸菌（醋酸桿菌屬（Acetobactersp.）A和葡糖桿菌屬（Gluconobactersp.）G）的生長(zhǎng)速度顯著變慢[19-20]，而產(chǎn)膜醭的真菌和蠟狀芽孢桿菌X-4快速生長(zhǎng)和繁殖，液體表面大量酵母膜醭的形成阻擋了液面上醋酸菌跟空氣的接觸，從而使膜醭上的酵母迅速成為優(yōu)勢(shì)菌，而醋酸菌逐漸停止生長(zhǎng)[21]。由圖4b可知，酸度提高對(duì)真菌Z-1、Z-2的生長(zhǎng)影響有限，而腐敗細(xì)菌均無法在pH低于2.8的酸性條件下正常生長(zhǎng)。玫瑰醋異常發(fā)酵大多數(shù)發(fā)生在玫瑰醋發(fā)酵的中期，這時(shí)候醪液的pH值大約在pH3.5左右，金黃色葡萄球菌X-2和蠟狀芽孢桿菌X-4都能以一定的速度生長(zhǎng)繁殖，并使醪液的pH值適當(dāng)上升，給不耐酸的腐敗菌提供生存條件[22]。敖曉琳等[23]報(bào)道畢赤酵母屬在酸性食品表面形成膜狀結(jié)構(gòu)，還能氧化有機(jī)酸，從而為不耐酸的腐敗菌提供生存條件。由圖4c可知，庫德里阿茲威畢赤酵母Z-1、盔形畢赤酵母Z-2和金黃色葡萄球菌X-2在酒精濃度低于5% vol的基質(zhì)中生長(zhǎng)良好，而類芽孢桿菌X-1、表皮葡萄球菌X-3和蠟狀芽孢桿菌X-4不易在高濃度酒精條件下生長(zhǎng)。由于玫瑰醋發(fā)酵中期醪液內(nèi)有一定濃度的酒精2.0% vol～5.0% vol（沖缸放水后20～40 d的發(fā)酵中期）[24]，這為酒精耐受的雜菌繁殖和生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件。

圖4 培養(yǎng)溫度（a）、pH值（b）和酒精度（c）對(duì)異常發(fā)酵微生物生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of culture temperature (a),pH (b) and alcohol content (c) on the growth of abnormal fermentation microorganisms

2.5 異常發(fā)酵微生物的作用途徑及控制方法探究

玫瑰醋發(fā)酵過程中大米的淀粉通過糖化、發(fā)酵最終轉(zhuǎn)變?yōu)榇姿?，這個(gè)過程完全依賴環(huán)境空氣中的微生物自然發(fā)酵完成。雖然空氣中各種有益菌、有害菌混雜，生產(chǎn)中大米原料卻能有序接受霉菌分泌的淀粉酶進(jìn)行糖化，即生產(chǎn)上俗稱“發(fā)花”?！皼_缸放水”后糖分選擇性地被釀酒酵母發(fā)酵轉(zhuǎn)化成酒精，隨后酒精被生長(zhǎng)于液面上的醋酸菌氧化成乙酸。這些微生物的選擇與調(diào)控的成敗取決于生產(chǎn)中兩個(gè)重要環(huán)節(jié)的掌控：①大米的浸米時(shí)間長(zhǎng)達(dá)7～10 d，使得飯坯pH約3.5左右，在這較低的pH下，霉菌可以生長(zhǎng)，而其他雜菌很難在飯粒表面繁殖；②投料時(shí)間從立夏到芒種，“沖缸放水”前期（6月份）的氣溫保持在25～29 ℃，適宜于酵母菌的生長(zhǎng)，后期（7月、8月）氣溫保持在28.5～32 ℃，適宜于醋酸菌的生長(zhǎng)[25]。

玫瑰醋發(fā)酵過程中不人為添加菌種，發(fā)酵所需的菌種基本來自于草缸蓋和空氣。當(dāng)南方梅雨季節(jié)時(shí)，草缸蓋無法得到定期晾曬，雜菌容易繁殖生長(zhǎng)。夜間溫度降低同樣會(huì)造成玫瑰醋中的醋酸菌生長(zhǎng)速度變慢。而畢赤酵母在空氣中大量存在，最佳生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，生長(zhǎng)速度快、耐酸、好氧、能在液面上快速形成膜。玫瑰醋發(fā)酵中表面如若被異常畢赤酵母形成的膜璞覆蓋，醋酸菌接觸不到氧氣，醋酸菌生長(zhǎng)緩慢甚至停止。人工定期“翻缸”等操作過程中也會(huì)混入各種微生物，一旦醋醅酸度不再上升，一些耐低酸的細(xì)菌（如臘狀芽孢桿菌）就會(huì)慢慢地活躍起來。從回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，類芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)時(shí)分解蛋白質(zhì)使醪液pH值上升，pH值向中性變化導(dǎo)致更多雜菌的繁殖。有些芽孢桿菌類雜菌分解糖類產(chǎn)二氧化碳使缸中醪液后期返渾，蠟狀芽孢桿菌類雜菌分解蛋白質(zhì)會(huì)使缸內(nèi)醪液產(chǎn)生臭味?？梢?，畢赤酵母是導(dǎo)致玫瑰醋異常發(fā)酵的首要腐敗菌，而具有一定耐酸能力的蠟狀芽孢桿菌類細(xì)菌是導(dǎo)致玫瑰醋進(jìn)一步返渾、發(fā)臭的輔助腐敗菌[26]。

從多家玫瑰醋廠的生產(chǎn)實(shí)踐，結(jié)合對(duì)異常發(fā)酵玫瑰醋微生物的分離、鑒定與生理特性研究，可以推測(cè)異常醋發(fā)酵過程見圖5。由圖5可知，環(huán)境溫度降低、醋酸菌生長(zhǎng)緩慢→污染的酵母和芽孢菌優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)→表面膜璞形成、醋酸菌停止生長(zhǎng)→其他細(xì)菌異常發(fā)酵。可見，溫度管理是控制玫瑰醋發(fā)酵中期產(chǎn)生異常發(fā)酵醋的關(guān)鍵因素，因?yàn)橐好嫘纬纱罅恐旅艿哪よ保袠I(yè)中稱這種異常醋為“桐油醋”，在較高的溫度下野生酵母等雜菌不可能獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。根據(jù)異常發(fā)酵玫瑰醋的微生物鑒別和成因分析，一旦玫瑰醋發(fā)生異常，應(yīng)該在污染的早期及時(shí)采取如下措施：及時(shí)翻缸，破壞表面由野生酵母產(chǎn)生的膜璞；及時(shí)升溫，使醋醅溫度恢復(fù)到醋酸菌適宜的溫度范圍；把正常醋缸中的一定量醪液（含有大量醋酸菌）并入表面開始形成膜璞的醋缸。

圖5 玫瑰醋異常發(fā)酵過程模式圖Fig.5 Diagram of abnormal fermentation process of rosy vinegar

3 結(jié)論

從異常發(fā)酵浙江玫瑰醋的表面膜醭分離獲得4株革蘭氏陽性細(xì)菌（X1～X4）和2株真菌（Z1～Z2）。回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6株菌株均有異常發(fā)酵特征，其中接種菌株X-4的醋樣出現(xiàn)明顯的發(fā)酵臭味，而接種真菌Z-1和Z-2的醋樣表面形成膜醭。通過菌體形態(tài)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定4株細(xì)菌分別為類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），2株真菌分別為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和盔形畢赤酵母（Pichia manshurica）。低溫抑制醋酸菌的生長(zhǎng)，而對(duì)異常發(fā)酵菌的生長(zhǎng)影響較小；低酸和低酒精度下，異常發(fā)酵細(xì)菌無法正常繁殖，而不影響異常發(fā)酵真菌。低溫是異常發(fā)酵微生物成為優(yōu)勢(shì)菌的前提條件，畢赤酵母產(chǎn)生的膜醭阻斷了醋酸菌的氧氣供應(yīng)是導(dǎo)致醋酸異常發(fā)酵的主要因素。根據(jù)異常發(fā)酵玫瑰醋的微生物鑒別和成因分析，一旦玫瑰醋發(fā)生異常，應(yīng)該在污染的早期及時(shí)翻缸，破壞表面由野生酵母產(chǎn)生的膜璞；及時(shí)升溫，使醋醅溫度恢復(fù)到醋酸菌適宜的溫度范圍；把正常醋缸中的一定量醪液（含有大量醋酸菌）并入表面開始形成膜璞的醋缸。