BTI和Nisin復合涂膜液對鱸魚魚糜的保鮮效果

李晨，牛澤潔，李文婕，韓宇航，王景雪

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

鱸魚具有生長速度快、抗病能力強、適應性強等特點，其肉質細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛，是許多國家重要的經濟魚類[1]。目前鱸魚以鮮銷為主，產品形式單一，有待進一步開發(fā)精深加工的多元化鱸魚制品[2]。由于鱸魚具有豐富的營養(yǎng)價值以及高含水量，鱸魚制品在貯藏加工過程中易變質腐敗，影響食用品質并造成經濟損失。因此，延長鱸魚制品的保鮮期，保證其質量安全顯得尤為重要[3]。

在肉類食品保鮮中，化學防腐劑是最常用的方法之一，但考慮到化學防腐劑的殘留安全性等問題，人們對天然生物防腐劑的需求不斷增加[4]。乳酸鏈球菌素（nisin）是一種由食用級細菌乳酸鏈球菌產生的具有34個氨基酸殘基的多肽[5]，對革蘭氏陽性菌有抑制作用[6]，是唯一被世界衛(wèi)生組織批準使用的天然抗菌肽[7-8]。然而nisin對胰蛋白酶敏感，其Lys12和Lys22是胰蛋白酶的作用位點，胰蛋白酶的水解作用可使nisin的抑菌活性降低甚至喪失[9-10]。魚糜等肉制品中存在較豐富的內源類胰蛋白酶，因此，抑制胰蛋白酶的活性對nisin的穩(wěn)定性至關重要。目前，加熱、高壓、調節(jié)pH值、使用酶抑制劑等是抑制或消除食品內源酶活性的常用方法。然而，多肽或蛋白質類酶抑制劑在食品中的應用卻鮮有報道，尋找高效的天然來源的蛋白酶抑制劑，對于解決內源酶引起的食品品質下降問題具有重要的現實意義。蕎麥胰蛋白酶抑制劑（buckwheat trypsin inhibitor，BTI） 由 69 個氨基酸殘基組成，對胰蛋白酶具有很強的抑制作用[11-13]。BTI源于蕎麥，且具有較好的熱及酸堿穩(wěn)定性，有望開發(fā)應用于食品加工。

本試驗以明膠和殼聚糖為基本組分，通過添加乳酸鏈球菌素以及不同含量的BTI制備涂膜保鮮劑，通過菌落總數、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量、pH 值、蒸煮損失率等質量指標，研究了BTI和nisin的涂膜劑對鱸魚魚糜的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與儀器

鱸魚：市售；殼聚糖（中黏度 200 mPa·s～400 mPa·s）：山東西亞化學股份有限公司；明膠：河南萬邦實業(yè)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、三羥甲基氨基甲烷[tris （hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris]、Ni2+-NTA親和層析柱、NaCl、咪唑、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺：生工生物工程（上海）股份有限公司；低分子質量標準蛋白：北京索萊寶科技有限公司。工程菌E.coli M15 pQE30-BTI：山西大學生物技術研究所蛋白質工程實驗室構建保存。

TU-1810紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；HW.SY21-KP4恒溫水浴鍋：北京市長風儀器儀表公司；SW-CJ-2F超凈工作臺：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；THZ-C-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設備廠；HC-2518R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；BSA224S精密電子天平：德國賽多利斯公司；FA-25高速組織勻漿機：上海弗魯克科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 BTI的誘導表達和純化

將E.coli M15 pQE 30-BTI接至肉湯（lysogeny broth，LB）液體培養(yǎng)基，當培養(yǎng)至對數期時，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.3 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心收集菌體。用Tris-HCl緩沖液（20 mmol/L pH7.5）懸浮菌體，超聲破碎菌體后于80℃水浴鍋中加熱30 min，12 000 r/min離心20 min，收集上清即為蛋白粗品。用Ni2+-NTA親和層析柱純化BTI，所用平衡緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH7.5，洗脫液為 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，300 mmol/L 咪唑，pH7.5[14]。合并收集洗脫峰，用Sephadex G-25柱脫鹽，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定蛋白純度后備用[15]。

1.2.2 涂膜保鮮劑的制備

配制1%的殼聚糖溶液（溶劑為1%醋酸）及5%的明膠溶液，將二者等體積混合后，加入甘油（2%）、nisin（0.05%）及不同質量分數的BTI（0%、0.004%、0.008%），充分混勻后，超聲脫氣20 min，備用。

1.2.3 肉樣處理

將新鮮的鱸魚肉制成肉末，加入1%（質量分數）的淀粉攪勻，稱取20 g，做成肉糜，在不同保鮮液（BTI添加量分別為0%、0.004%、0.008%）中浸泡3 min后瀝干，用保鮮膜包裝，依次標記為A組、B組、C組，于4℃貯藏。以未經涂膜處理的樣品為對照，記為CK組。分別在第0、2、4、6、8天取樣測定樣品的菌落總數、揮發(fā)性鹽基氮、TBARS值、pH值、蒸煮損失率等指標。

1.2.4 菌落總數測定

稱取1 g肉糜于無菌燒杯中，加入9 mL無菌生理鹽水，勻漿。用無菌生理鹽水以10為倍數進行系列稀釋，取3個不同稀釋梯度的樣品液各100 μL涂布于平板計數瓊脂培養(yǎng)基（plate count agar，PCA），在 37℃培養(yǎng) 48 h后統計菌落總數（total viable count，TVC），所有計數用 lg（CFU/g）表示[16]。

1.2.5 揮發(fā)性鹽基氮測定

稱取5g肉糜于錐形瓶中，加入50mL蒸餾水，攪勻，25℃恒溫振蕩30 min后過濾。取10 mL濾液與10 mL MgO（10 g/L）混懸液混合進行蒸餾，用10 mL含甲基紅（2 g/L）和次甲基藍（1 g/L）的硼酸吸收液（20 g/L）吸收蒸出物質，用10 mmol/L的標準鹽酸進行滴定。用蒸餾水代替濾液作空白對照。按照公式（1）計算樣品中TVB-N 的含量[17]。

式中：T和B分別為樣品液和空白對照消耗標準鹽酸溶液的體積，mL。

1.2.6 硫代巴比妥酸測定

稱取5 g肉糜于燒杯中，加入12.5 mL 20%三氯乙酸和10 mL蒸餾水，10 000 r/min勻漿1 min后于4℃8000r/min離心10min，取2mL上清液與2mL20mmol/L硫代巴比妥酸溶液混合，沸水浴加熱20 min后冷卻至室溫（25℃），測定532 nm處吸光度（A532nm），以蒸餾水代替濾液作空白對照[18]。TBARS值以每千克樣品中丙二醛（malondialdehyde，MAD）的毫克數表示，按照公式（2）計算。

1.2.7 pH值的測定

稱取2 g肉糜，加入20 mL蒸餾水，勻漿，用pH計測定混合液的pH值。

1.2.8 蒸煮損失率的測定

稱取5 g樣品，擦干肉樣表面水分后稱重并裝入離心管中，蓋緊蓋子，置于70℃的水浴鍋中加熱30 min后立即用流水冷卻至室溫（25℃）。取出肉樣，用吸水紙擦去肉樣表面水分后稱重，按照下式計算蒸煮損失率[19]。

式中：W0為蒸煮前樣品的質量，g；W1為蒸煮后樣品的質量，g。

1.2.9 數據處理

采用SPSS 17.0軟件進行數據差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；使用Microsoft Excel1 4.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 BTI的表達及純化

經誘導表達及Ni2+-NTA柱親和層析后，對純化的BTI進行SDS-PAGE鑒定，結果見圖1。

圖1 BTI的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE pattern of BTI

由圖1可知，BTI（泳道1）在電泳圖譜上顯示單一條帶，表明所得BTI純度較高，達到了電泳純。BTI制備方法簡便易行，僅需一次親和層析便可達到純化目的，具有進一步開發(fā)應用的優(yōu)勢。

2.2 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中菌落總數的影響

菌落總數是衡量肉類腐敗變質的一項重要參數，Al-Dagal等[20]提出水產品可食用的菌落總數上限是6 lg（CFU/g）。各組鱸魚魚糜貯藏期間的菌落總數變化如圖2所示。

圖2 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中菌落總數的影響Fig.2 Effect of BTI content in coating preservative on total viable count of Lateolabrax japonicus surimi during storage

由圖2可知，未經涂膜液處理的對照（CK）組的菌落總數在貯藏第4天時為5.45 lg（CFU/g），已接近可食用上限；只添加0.05%nisin的A組在第4天時菌落總數不到5.0 lg（CFU/g），在第6天時接近可食用上限，表明添加nisin可顯著抑制細菌的生長（P＜0.05）；B組、C組的菌落總數在第7天～8天時才達上限。在貯藏第6天時，B組（BTI添加量為0.004%）和C組（BTI添加量為0.008%）的菌落總數均顯著低于A組（未添加BTI組）；在第8天時，C組TAC值仍顯著低于A組（P＜0.05）。以上結果表明BTI和nisin的聯合使用較單獨使用nisin涂膜液的抑菌效果加強，顯著降低了魚糜中細菌的生長速率。

2.3 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中TVB-N含量的影響

TVB-N指肉類在酶和細菌的作用下，由蛋白質或氨基酸分解產生的氨以及二甲胺、三甲胺等堿性含氮物質，是判斷鮮肉新鮮性的重要指標。根據GB 2733—2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》規(guī)定，淡水魚蝦的TVB-N值不大于20 mg/100 g[21]。各組鱸魚魚糜貯藏期間的TVB-N含量變化如圖3所示。

圖3 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中TVB-N含量的影響Fig.3 Effect of BTI content in coating preservative on TVB-N of Lateolabrax japonicus surimi during storage

由圖3可知，CK組在貯藏第4天時，肉樣中TVBN含量為15.17 mg/100 g，在第6天時，TVB-N含量就達到19.21 mg/100 g，已接近上限。而在相同貯藏時間時，A組、B組、C組中TVB-N含量均顯著低于CK組（P＜0.05），3組在貯藏第8天時的TVB-N含量仍低于20 mg/100 g。以上結果與菌落總數結果一致，由于nisin的使用抑制了菌的生長，顯著減緩蛋白質等的分解。第6天和第8天時樣品組TVB-N含量呈現C組<B組<A組，表明隨著BTI使用量增加，肉樣中蛋白分解減緩。BTI減緩肉樣蛋白分解的原因可能是BTI直接抑制了內源蛋白酶，或通過抑制蛋白酶對nisin的降解，增強了nisin的抑菌作用，間接降低了菌對蛋白質的降解作用。

2.4 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚貯藏過程中TBARS值的影響

TBARS值是指示肉類脂質氧化程度的重要指標之一[22]。各組鱸魚魚糜貯藏期間的TBARS值變化如圖4所示。

圖4 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中TBARS值的影響Fig.4 Effect of BTI content in coating preservative on TBARS of Lateolabrax japonicus surimi during storage

由圖4可知，涂膜保鮮劑的使用有效地降低了鱸魚中TBARS值的增長速率，即延緩了鮮肉中脂質的氧化進程。雖然在儲藏初期（第2天時）只有高劑量BTI添加組（C組）的TBARS值顯著低于CK組，A組和B組的TBARS值與CK組無明顯差別，但隨著貯藏時間延長，在第4天、第6天及第8天時A組、B組、C組的TBARS值顯著低于CK組（P＜0.05），而且添加了BTI的B組、C組的TBARS值均顯著低于A組（P＜0.05）。據報道，殼聚糖中的羥基和氨基具有清除羥基自由基的能力[23]。Fan等[24]的研究發(fā)現，nisin修飾的一種纖維素（氨乙基羥丙基甲基纖維素）具有清除DPPH自由基的活性，而且清除活性隨著nisin含量增加而增強。在本試驗中，BTI與nisin的涂膜劑增強了鱸魚魚糜的抗氧化能力，但其作用機理需要進一步研究。

2.5 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中pH值的影響

肉樣pH值的變化與貯藏過程中微生物生長繁殖產生的代謝物質有關，因此，pH值與肉糜新鮮度有密切關系[25]。各組鱸魚魚糜貯藏期間的pH值變化如圖5所示。

圖5 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中pH值的影響Fig.5 Effect of BTI content in coating preservative on pH of Lateolabrax japonicus surimi during storage

與文獻報道一致[3，26]，隨貯藏時間的延長，各組鱸魚魚糜的pH值均呈現先下降后上升的趨勢（圖5）。這可能是由于魚死后糖酵解作用使魚體內剩余糖原分解為丙酮酸，導致樣品最初pH值下降。然而隨著貯藏時間的延長，魚肉中滋生的微生物分解蛋白質產生堿性化合物，隨著堿性物質含量不斷積累，導致后期肉糜pH值升高[27]。在貯藏期間，A組、B組、C組的pH值均顯著低于CK組（P＜0.05），且C組pH值顯著低于A組，進一步表明BTI和nisin的聯合使用可以有效抑制肉樣中微生物的生長。

2.6 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中蒸煮損失率的影響

蒸煮損失率與肉的持水能力有關，是肌肉持水性的重要指標之一，通常蒸煮損失率較低的樣品會獲得更好的食用品質[28]。涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中蒸煮損失率的影響如圖6所示。

圖6 涂膜劑中BTI添加量對鱸魚魚糜貯藏過程中蒸煮損失率的影響Fig.6 Effect of BTI content in coating preservative on cooking loss rate of Lateolabrax japonicus surimi during storage

由圖6可知，隨著貯藏時間延長，CK組的蒸煮損失率迅速增加，使用涂膜劑有利于降低鱸魚的蒸煮損失率。在貯藏第2、4、8天時，添加nisin的A組蒸煮損失率顯著低于CK組（P＜0.05），表明nisin的使用可有效降低肉樣的蒸煮損失率，另外，添加0.008%BTI的C組蒸煮損失率顯著低于A組（P＜0.05），進一步表明BTI與nisin結合使用更有利于持水能力的保持。持水能力的降低與肌肉細胞結構的破壞和蛋白質的降解有關[29]。BTI可以抑制內源蛋白酶并提高nisin的抑菌活性，因此，添加BTI有利于降低樣品的蒸煮損失率。

3 結論與討論

本試驗以明膠和殼聚糖為基本組分，制備了添加乳酸鏈球菌素（nisin）和BTI的復合涂膜劑，并將其用于鱸魚魚糜保鮮研究。結果表明，僅添加nisin的涂膜保鮮劑可有效抑制樣品中微生物的生長，并降低魚糜貯藏期間的TVB-N含量、TBARS值和pH值，減少蒸煮損失，使鱸魚魚糜在4℃的保質期從4 d延長至6 d。而同時添加BTI和nisin的涂膜保鮮劑可以將鱸魚魚糜的保質期由6 d延長至7 d，抑菌效果更加明顯，TVB-N含量等各項指標更優(yōu)，具有更好的保鮮效果。nisin因安全性高、抑菌作用強被廣泛應用于食品保鮮，然而魚蝦等水產品中的內源酶卻使nisin的抑菌效果大打折扣。BTI可有效抑制鱸魚內源胰蛋白酶活性，降低內源胰蛋白酶對nisin的分解作用，進而保護nisin的抑菌活性。BTI與nisin結合使用解決了nisin在應用中對蛋白酶敏感的問題，可有效抑制鱸魚腐敗變質，保持肉樣新鮮度，延長鱸魚冷藏貨架期。