馬鈴薯A病毒的研究進(jìn)展

魏旭言，白艷菊，張威，高艷玲，徐麗萍，羅秋香*

（1.東北林業(yè)大學(xué)東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040；2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086）

馬鈴薯因含有豐富的碳水化合物、優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)以及其他谷物所沒(méi)有的維生素C，2016年被農(nóng)業(yè)部指定為主食作物[1]。但經(jīng)近幾年的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)正處于病毒頻發(fā)的階段，在不同的生物脅迫條件下，病毒作為依賴(lài)寄主繁殖的病原物，是導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)的主要因素[2]。

馬鈴薯A病毒（Potato virus A，PVA）與馬鈴薯Y病毒（Potato virus A，PVY）同屬，寄主范圍較廣，可侵染多種茄科植物，是感染植物中最大的病毒家族之一[3]。PVA于1975年在黑龍江省克山縣首次被發(fā)現(xiàn)[4]，隨后在湖南、四川、福建等地也有報(bào)道[5-7]，目前幾乎遍布于馬鈴薯的各個(gè)主要產(chǎn)區(qū)，導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量及質(zhì)量下降。PVA既能單獨(dú)侵染寄主，又可與馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）、PVY等一起復(fù)合侵染，從而加重病毒病的發(fā)生，產(chǎn)生嚴(yán)重的花葉和葉脈壞死等癥狀，導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣[8]。2007年，中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫有害生物名錄將其列為檢疫性病害[9]，因此，PVA的研究已成為當(dāng)前馬鈴薯病毒研究中的熱點(diǎn)之一。

1 PVA基因組結(jié)構(gòu)及蛋白功能

1.1 PVA基因組

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，PVA的研究已從傳統(tǒng)生物學(xué)研究轉(zhuǎn)向了基因組的研究時(shí)代。Kekarainen[10]通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)的方法，基于噬菌體的轉(zhuǎn)位反應(yīng)探究出了一個(gè)完整的PVA基因組，發(fā)現(xiàn)PVA是一種含有RNA的真核病毒家族的一員，具有一個(gè)由9 565個(gè)核苷酸組成的單鏈RNA基因組，5'端共價(jià)連接病毒編碼蛋白VPg，后接一個(gè)3-poly（A）尾，且這兩種末端結(jié)構(gòu)都參與了基因組的復(fù)制及其表達(dá)調(diào)控。此外，Saha等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，PVA與其他病毒一樣，基因組中大的開(kāi)放閱讀框架（ORF）分別能編碼絲氨酸蛋白酶（P1）、輔助蛋白酶（HC-Pro）、第3蛋白（P3）、第1個(gè)6k蛋白、圓柱狀內(nèi)含體蛋白（CI）、第2個(gè)6k蛋白、連接蛋白（VPg）、核內(nèi)含體蛋白a（NIa）、核內(nèi)含體蛋白b（NIb）以及外殼蛋白（CP）。其中，CI是最保守的區(qū)域，P1和CP的N端是基因組中最大的變異區(qū)[12]。通過(guò)以上研究，PVA的功能基因組學(xué)在近些年來(lái)已取得了一定的進(jìn)展，這將有利于對(duì)其基因組編碼的各個(gè)功能蛋白進(jìn)行更加深入的研究。

1.2 基因組復(fù)制相關(guān)蛋白

由于多種復(fù)制蛋白協(xié)同作用會(huì)導(dǎo)致PVA引起的病毒病發(fā)生，因此研究基因組復(fù)制蛋白的功能十分重要。目前發(fā)現(xiàn)參與病毒復(fù)制的蛋白主要有6K2、NIa、NIb、VPg以及CI[13]。

通過(guò)對(duì)PVY的研究發(fā)現(xiàn)，6K2誘導(dǎo)形成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌小泡是病毒復(fù)制的主要位點(diǎn)[14]，小泡中包含病毒編碼連接蛋白VPg，PVA在系統(tǒng)侵染植物時(shí)，VPg起到了至關(guān)重要的作用。Rajam?ki等[15]研究發(fā)現(xiàn)，VPg是能促進(jìn)病毒擴(kuò)增的特異調(diào)控因子，作為病毒復(fù)制的引物來(lái)參與病毒的復(fù)制。因PVA沒(méi)有RNA帽子結(jié)構(gòu)，故翻譯的起始需與VPg互作而結(jié)合到病毒上，VPg充當(dāng)帽狀結(jié)構(gòu)來(lái)啟動(dòng)病毒翻譯，又因VPg存在于6K2誘導(dǎo)產(chǎn)生的小泡中，所以推測(cè)共同參與了病毒的復(fù)制。

Kamer和Argos[16]在研究中發(fā)現(xiàn)核內(nèi)含體蛋白NIb參與病毒的復(fù)制，若其中的保守序列Gly-Asp-Asp變異，病毒則會(huì)喪失復(fù)制的能力。此外，NIb中還有NLSI和NLSII兩個(gè)獨(dú)立的核定位信號(hào)，這些信號(hào)賦予了核遷移的活性，倘若發(fā)生位點(diǎn)突變，病毒的復(fù)制將會(huì)終止[17]。在之后的物理作用研究分析中發(fā)現(xiàn)，PVA的NIa蛋白酶結(jié)構(gòu)域可能介導(dǎo)NIa和NIb互作，其水解的多聚蛋白位點(diǎn)在復(fù)制蛋白CI和6K2之間，因此推測(cè)NIa也參與了病毒的復(fù)制并且在病毒的循環(huán)復(fù)制中起到重要作用[18]。

通過(guò)以前的研究，了解到PVA的發(fā)生是靠多種復(fù)制蛋白協(xié)同作用的結(jié)果，蛋白區(qū)域位點(diǎn)的變異會(huì)阻斷病毒的復(fù)制能力[19]?？傊?，PVA的復(fù)制機(jī)理已基本明確，PVA會(huì)一邊復(fù)制合成子代核酸，一邊進(jìn)行基因組的表達(dá)合成復(fù)制所需的蛋白，在這一過(guò)程中，RNA鏈被CI蛋白解開(kāi)后，NIb將連接在RNA上的VPg蛋白核甘酸化，隨后以VPg為引物開(kāi)始病毒的復(fù)制。

1.3 運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白

大多數(shù)馬鈴薯病毒蛋白是多功能的，參與病毒生命周期的重要步驟。隨著近年來(lái)分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多在病毒侵染循環(huán)過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)作用因子，PVA能否成功侵染寄主主要取決于胞間連絲是否進(jìn)行細(xì)胞間的移動(dòng)，而在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)中，主要有以下幾種蛋白起作用，分別是CP、HC-Pro、VPg及CI[20]。

CP蛋白，又稱(chēng)為多功能蛋白，在病毒粒子的組裝、復(fù)制和運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，其還參與了蚜蟲(chóng)的傳毒和細(xì)胞間長(zhǎng)距離的運(yùn)輸，對(duì)于病毒的系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)是必不可少的[21]。Lǒhmus等[22]研究證明蛋白激酶CK2介導(dǎo)的CP蛋白磷酸化對(duì)于PVA的復(fù)制很重要，改變CP磷酸化位點(diǎn)將會(huì)導(dǎo)致PVA復(fù)制產(chǎn)生缺陷。此外還有研究表明，CP的磷酸化能調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)蛋白的功能，以煙草為例，Hamalainen等[23]發(fā)現(xiàn)PVA的CP磷酸化會(huì)導(dǎo)致病毒發(fā)生誘變從而失去在煙草中的病毒傳輸功能；吳興泉和陳士華[24]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)誘變CP和HC-pro能抑制病毒在馬鈴薯細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)、延緩病毒在煙草中的傳播。

Yelina等[25]研究發(fā)現(xiàn)PVA是靠運(yùn)動(dòng)蛋白HC-pro來(lái)完成長(zhǎng)距離的運(yùn)動(dòng)，其是一種輔助蛋白，既能參與病毒維管束的運(yùn)動(dòng)又能充當(dāng)基因沉默劑來(lái)抑制植物對(duì)PVA的抗性。根據(jù)對(duì)馬鈴薯Y病毒屬的研究發(fā)現(xiàn)，其中的KITC保守基序和PTK基序能促使病毒顆粒與蚜蟲(chóng)刺針結(jié)合，以此來(lái)參與病毒傳播，因PVA與PVY同屬，所以推測(cè)PVA可能也是通過(guò)這種方式進(jìn)行蚜蟲(chóng)的傳播。除CP和HC-pro蛋白外，CI對(duì)于病毒細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)也是必不可少的，其能通過(guò)增加胞間連絲附近錐形結(jié)構(gòu)的穿透孔徑來(lái)幫助病毒進(jìn)行運(yùn)動(dòng)[26]。此外，基因連接蛋白VPg還可能通過(guò)與寄主之間的相互作用來(lái)參與病毒的系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)，其不但能在病毒循環(huán)侵染中發(fā)揮重要作用，還能參與病毒的系統(tǒng)侵染[27]。盡管植物導(dǎo)管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，對(duì)于PVA系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)的研究還相對(duì)較少，但PVA的運(yùn)動(dòng)機(jī)理已基本明確。

2 PVA檢測(cè)方法

2.1 生物學(xué)檢測(cè)法

采用生物學(xué)的方法進(jìn)行PVA鑒定具有成本低、操作簡(jiǎn)單易行、直觀等優(yōu)點(diǎn)，但是具有人為觀察等主觀因素的局限。1929年，美國(guó)病毒學(xué)家Holmes[28]首先發(fā)現(xiàn)了指示植物檢測(cè)法，隨后人們開(kāi)始廣泛使用此法鑒定各種不同的病毒。PVA的寄主范圍較窄，已知寄主為茄科植物，包括番茄、假酸漿、普通煙、德伯尼煙、馬鈴薯等[29]。劉衛(wèi)平[30]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)PVA的寄主有香料煙、枸杞、A6和直房叢生番茄。將PVA接種在不同的鑒定寄主上其癥狀表現(xiàn)也不同。以香料煙為對(duì)象，接種葉片微明脈；枸杞在接種后5～10 d產(chǎn)生明顯的局部病斑；A6的接種葉片出現(xiàn)棕色星狀斑點(diǎn)；直房叢生番茄葉片出現(xiàn)褐色壞死斑。張維[31]將湖南的PVA分離株系接種到洋酸漿上發(fā)現(xiàn)葉片出現(xiàn)褐色病斑、普通煙出現(xiàn)微明脈，同時(shí)將其接種到黃苗榆煙上，發(fā)現(xiàn)病毒含量呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，可以當(dāng)作保毒植物。劉喜才和李芝芳[32]研究發(fā)現(xiàn)PVA的典型保毒植物是馬鈴薯‘布爾斑克’品種和普通煙，能將PVA含量富集的很高，適合作為繁殖寄主。

2.2 血清學(xué)檢測(cè)法

自首次用乳膠凝聚反應(yīng)做了病毒顯性技術(shù)的研究并將其應(yīng)用到PVA、PVX和馬鈴薯S病毒（Potato virus S，PVS）等的檢測(cè)后[33]，隨著抗病育種和病毒鑒定工作的需要，病毒的檢測(cè)方法已不斷的向更靈敏的方向發(fā)展。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)速度快以及檢測(cè)規(guī)模更大的血清學(xué)檢測(cè)法已成為廣為應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)，包括雙抗體夾心法（DAS-ELISA）和點(diǎn)免疫結(jié)合檢測(cè)法（Dot-ELISA）等[34]。張志軍等[35]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在不同的檢測(cè)技術(shù)中，雙抗體夾心技術(shù)是最靈敏的技術(shù)之一，其作用原理是將抗原-抗體反應(yīng)與酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合，根據(jù)產(chǎn)生的顏色反應(yīng)來(lái)進(jìn)行病毒的檢測(cè)。吳建祥[36]通過(guò)制備PVA抗體建立了酸性磷酸酶ACP-ELISA和Dot-ELISA檢測(cè)技術(shù)，宋志成等[37]利用重組CP作為抗原制備出PVA的多克隆抗體并將其用于DAS-ELISA檢測(cè)。

2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)法

傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)靈敏度較低、耗時(shí)較長(zhǎng)。隨著分子生物學(xué)的不斷完善，因其特異的靈敏度、適合大批次的檢測(cè)，已成為最具有發(fā)展前景的檢測(cè)技術(shù)[29]。目前，檢測(cè)PVA的方法主要包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）以及基因芯片技術(shù)[38]。劉洪義等[39]研究并建立了PVA液相芯片快速檢測(cè)技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），為PVA的檢測(cè)提供了更高效、特異的新方法。Agindotan等[40]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法成功的從休眠種薯中檢測(cè)出PVA、PVX及PVY。在之后的研究中，袁青等[41]發(fā)現(xiàn)雙重PCR技術(shù)適用于大批量樣品的快速檢測(cè)，并應(yīng)用此方法快速檢測(cè)出了PVX和PVA的復(fù)合侵染病毒。陳陽(yáng)婷等[42]在此基礎(chǔ)上建立了更加快速的三重PCR檢測(cè)技術(shù)，并應(yīng)用到馬鈴薯中的多種病毒檢測(cè)，如PVX、PVS和PVA，PVX、PVA和馬鈴薯卷葉病毒（Potato leafroll virus，PLVR），PVS、PVA和PLRV等。Zhang等[43]建立了PVA、PVX、PVY、PLRV和馬鈴薯M病毒（Potato virus M，PVM）五重RT-PCR分子檢測(cè)技術(shù)，并經(jīng)過(guò)大量樣品檢測(cè)，驗(yàn)證了該檢測(cè)體系的特異性和靈敏度，為PVA提供了快速檢測(cè)方法。

2.4 電鏡檢測(cè)法

自20世紀(jì)初，首次在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒（TMV），隨后，電鏡檢測(cè)法已逐步發(fā)展成為植物病毒研究中必不可少的技術(shù)之一。其原理是以電磁波作為光源，將被感染的植物組織放入電鏡中直接觀察，根據(jù)病毒的大小和形狀來(lái)判斷病毒的類(lèi)型[44]。劉海英等[45]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)電子顯微鏡的分辨率非常高，最高能達(dá)到0.1 nm。目前常用的電鏡檢測(cè)法主要有負(fù)染技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。吳興泉等[46]通過(guò)電子顯微鏡觀察到福建PVA的病毒粒子，粒子呈彎曲的線條狀，長(zhǎng)為730 nm，寬為15 nm，同時(shí)對(duì)湖南PVA株系進(jìn)行了分子鑒定，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)花葉癥狀的馬鈴薯感染上了PVA病毒。

3 馬鈴薯對(duì)PVA抗性

近年來(lái)，科學(xué)家對(duì)PVA的抗性基因進(jìn)行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)控制由蚜蟲(chóng)傳播的病毒較難，保護(hù)馬鈴薯免受PVA的侵害從而有效阻止病毒繁殖的最有效的方法是發(fā)現(xiàn)持久抗性基因、培育抗病品種。馬鈴薯對(duì)PVA的抗性分為過(guò)敏抗性（HR）和極端抗性（ER）。Barker[47]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯的抗性是由單個(gè)顯性基因控制，單個(gè)基因可以對(duì)多種病毒表現(xiàn)出綜合抗性，如Rysto具有對(duì)PVY和PVA的綜合抗性，此外還發(fā)現(xiàn)了對(duì)PVA具有特異性的ER基因，如具有Rasto和Raadg抗性的植物表現(xiàn)為局部壞死，可以阻止病毒進(jìn)一步擴(kuò)散。

Singh等[48]研究發(fā)現(xiàn)，‘Shepody’對(duì)PVA具有極強(qiáng)的抗性，這種抗性是由兩個(gè)獨(dú)立的顯性互補(bǔ)基因控制，用感染PVA的嫩枝嫁接‘Shepody’時(shí)，植物有時(shí)會(huì)發(fā)生頂部壞死，這方面‘Shepody’反應(yīng)類(lèi)似于HR。然而，高靈敏度的ELISA卻不能從植株中檢測(cè)到PVA，因此，‘Shepody’對(duì)PVA的反應(yīng)可能包括HR和ER。此外研究中還發(fā)現(xiàn)馬鈴薯對(duì)PVA的抗性與品種有關(guān)，將PVA接種到不同的品種上，‘Desiree’表現(xiàn)出輕微的花葉，‘Maris Bard’出現(xiàn)褪綠斑，而‘King Edward’、‘Marisa Piper’、‘Cara’、‘Tomasa Condemayta’、‘Yungay’等品種則表現(xiàn)出頂端壞死[49]。

4 PVA防治方法

4.1 化學(xué)防治

利用抗病毒化學(xué)物質(zhì)消除馬鈴薯病毒能起到非常好的防治效果。研究表明，利巴韋林是最有希望的抗馬鈴薯植物病毒的化學(xué)物質(zhì)，高濃度的利巴韋林應(yīng)用于馬鈴薯離體繁殖中更是可以成功的消除大多數(shù)流行的馬鈴薯病毒，如PVA、PVM、PVS和PVX[50]。此外，對(duì)于蟲(chóng)害如蚜蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，可以及時(shí)噴灑對(duì)蚜蟲(chóng)天敵無(wú)害的藥劑，目前使用較廣的有抗蚜威、樂(lè)果乳油等[51]。

4.2 生物防治

生物防治是一種主要針對(duì)于蟲(chóng)害防治的技術(shù)，通常利用一種生物去克制另一種生物，目前在馬鈴薯病毒的防治工作中已得到廣泛應(yīng)用，如果再結(jié)合昆蟲(chóng)信息素控制害蟲(chóng)將會(huì)取得良好的成效[52]。研究發(fā)現(xiàn)反-β-法尼烯是蚜蟲(chóng)報(bào)警外激素的主要組分，在調(diào)控植物-蚜蟲(chóng)、植物-蚜蟲(chóng)-天敵互作中起重要作用，目前在生物防治過(guò)程中已取得良好的成效[53]。

4.3 物理防治

物理防治就是利用各種物理因素或工具防治病害，這種方法具有簡(jiǎn)單方便、經(jīng)濟(jì)有效等優(yōu)點(diǎn)[54]。其中，利用病毒和宿主之間的差異進(jìn)行熱處理，以達(dá)到脫毒效果是最有效的方法，其在使病毒外殼蛋白變性的同時(shí)不會(huì)破壞植物組織[55]。尹明華等[56]將莖尖培養(yǎng)技術(shù)與熱療法結(jié)合，反復(fù)試驗(yàn)，成功脫除了馬鈴薯的PVA病毒。

5 總結(jié)與展望

PVA造成的產(chǎn)量損失可達(dá)40%左右，當(dāng)與其他病毒復(fù)合侵染時(shí)，將會(huì)引起較為嚴(yán)重的花葉并伴有葉片皺縮和卷曲等現(xiàn)象[57]。隨著科研工作者對(duì)PVA重視度的提高，越來(lái)越多的基因組蛋白被深入研究，目前浙江、云南、福建等省已成功的克隆出PVA的外殼基因、復(fù)制酶基因，并通過(guò)外殼蛋白介導(dǎo)、復(fù)制酶基因介導(dǎo)等不同途徑獲得抗PVA的馬鈴薯栽培品種[58]，同時(shí)，又對(duì)PVA的檢測(cè)技術(shù)、防治方法有了更深入的了解，但是PVA與寄主間的互作機(jī)制等方面仍有待進(jìn)一步深入研究。

PVA病毒的傳播主要依靠基因組中多種蛋白的協(xié)同作用，這些蛋白共同協(xié)調(diào)著病毒的復(fù)制及運(yùn)動(dòng)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于PVA的研究主要集中在檢測(cè)方面，而蛋白功能的研究非常少且還處于初級(jí)階段，但隨著國(guó)內(nèi)PVA病害的發(fā)生和馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的需要，對(duì)PVA病毒進(jìn)行系統(tǒng)而深入的研究顯得至關(guān)重要。因此，深入研究PVA的致病機(jī)理，明確PVA與馬鈴薯的互作機(jī)制，詳細(xì)闡明基因組蛋白的功能并深度挖掘抗性基因資源，拓寬遺傳背景將成為今后PVA研究的主要方向，這將對(duì)馬鈴薯抗病育種及促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義。