豬支原體肺炎IgA 抗體ELISA 檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

朱海俠 陳 雷 傅星源 潘小慧 李梟辰 饒?jiān)破?/p>

（兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014）

豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，Mps）又稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasmal hyopneumoniae，Mhp）引起的一種慢性呼吸道疾病。雖然該病死亡率低，但發(fā)病率高，世界各地均有流行[1]。豬群感染該病后會(huì)引起機(jī)械性咳嗽，日增重下降，飼料報(bào)酬率降低等。嚴(yán)重時(shí)，當(dāng)呼吸道黏膜纖毛屏障受到破壞后，很容易繼發(fā)感染其它病原菌，導(dǎo)致豬只死亡。在當(dāng)前非洲豬瘟疫情形勢(shì)嚴(yán)峻的大環(huán)境影響下，豬價(jià)急速上漲，如何在保證豬群不受非洲豬瘟侵襲的情況下迅速育肥、出欄，成為養(yǎng)豬業(yè)密切關(guān)注的問(wèn)題。

目前對(duì)豬支原體肺炎的預(yù)防主要有藥物和疫苗預(yù)防兩種措施。但在當(dāng)前國(guó)家法規(guī)“禁抗”的背景下，疫苗免疫成為防控該病的關(guān)鍵。研究表明[2]，疫苗免疫在減輕因該病造成的肺部病變、提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率方面效果明顯，且對(duì)控制同群豬只感染、降低母豬帶菌率等非常重要。當(dāng)前針對(duì)豬支原體肺炎的疫苗主要有弱毒活疫苗和滅活苗兩種，但滅活苗主要以體液免疫為主，即使添加相關(guān)佐劑的滅活疫苗也只能產(chǎn)生有限的細(xì)胞免疫[3]，豬支原體肺炎滅活疫苗不能阻止野毒的感染。此外，對(duì)豬肺炎支原體而言，滅活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平和阻止病原移行及疾病的發(fā)生聯(lián)系不大，只能作為一種參考性指標(biāo)[4]。豬支原體肺炎滅活疫苗免疫后由于不能阻止豬肺炎支原體野毒對(duì)支氣管纖毛的定植，因此，無(wú)法產(chǎn)生完全的保護(hù)。而免疫豬支原體肺炎活疫苗后，能夠有效地激活全身的細(xì)胞免疫和局部黏膜免疫[5]。作為黏膜免疫系統(tǒng)的效應(yīng)分子，分泌型IgA 在呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道的黏膜抗感染中發(fā)揮重要作用[6]。特異性IgA 的水平已經(jīng)作為大多數(shù)研究中評(píng)估疫苗使用效果和早期疾病發(fā)生的主要依據(jù)。

P97 蛋白是發(fā)現(xiàn)最早的Mhp 黏附蛋白，也是最重要的一種毒力因子。它包含R1 和R2 兩個(gè)重復(fù)區(qū)域，其中R1 區(qū)是主要的抗原決定簇[7]。在Mhp 感染早期，血清和黏膜中均能檢測(cè)到針對(duì)P97R1 區(qū)的特異性抗體，并已確定為豬肺炎支原體早期感染的血清學(xué)標(biāo)志物[8]。抗豬支原體肺炎IgA 是Mhp 感染或免疫后在呼吸道首先產(chǎn)生的特異性標(biāo)志，同時(shí)也反映了疫苗免疫后的保護(hù)效果[9]。本研究采用豬肺炎支原體P97R1 蛋白作為包被用抗原，通過(guò)建立豬支原體肺炎IgA 抗體間接ELISA 檢測(cè)方法，結(jié)合現(xiàn)有的血清學(xué)、病原學(xué)檢測(cè)方法，以期更好地用于評(píng)估免疫豬群Mhp 疫苗使用效果以及未免疫豬群的自然感染情況。

1 材料與方法

1.1 菌種、血清、陰陽(yáng)性肺泡灌洗液 豬肺炎支原體（168 株）活疫苗由本公司提供；PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、TGEV 陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存；Mhp豬陰陽(yáng)性肺泡灌洗液的制備參照文獻(xiàn)[9]。

1.2 主要試劑 PET-32a 原核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；2×Taq PCR Master Mix 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeStar Max polymerase、EcoRⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌DH5α，transetta(DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自Megan；蛋白凝膠試劑盒購(gòu)自博士德生物工程有限公司；His 融合蛋白純化柱（5 mL 預(yù)裝柱）購(gòu)自上海七海復(fù)泰生物技術(shù)有限公司；TMB 顯色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BSA 購(gòu)自Bioshrap；羊抗豬IgA-HRP購(gòu)自BethlyⅠ。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[10]，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 Mhp P97R1 基因的擴(kuò)增 以豬肺炎支原體（168 株）菌株為模板，用所合成的引物進(jìn)行P97R1基因擴(kuò)增。反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max premix（2×）25 uL，上下游引物（20 um/mL）各1 uL，DNA 1 uL，補(bǔ)足ddH2O 至50 uL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.0%核酸凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 PET32a-P97R1 重組基因表達(dá)載體的構(gòu)建利用DNA 凝膠試劑盒對(duì)P97R1 基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，利用ECORⅠ和HidⅢ限制性內(nèi)切酶對(duì)P97R1基因片段和PET-32a 載體進(jìn)行雙酶切，利用T4DNA連接酶對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，并對(duì)菌落進(jìn)行鑒定和序列測(cè)定，將鑒定為陽(yáng)性的菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取。

1.6 P97 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落，利用IPTG 誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，收集的上清和菌體進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定，經(jīng)Western Blot 鑒定正確的菌株經(jīng)處理后用His 融合蛋白純化柱進(jìn)行純化。

1.7 豬支原體肺炎IgA 抗體間接ELISA 檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

1.7.1 P97R1 蛋白最佳包被濃度及最佳陰陽(yáng)性肺泡灌洗液稀釋濃度的確定 采用方陣滴定法，將P97R1 重組蛋白用碳酸鹽緩沖液（CBS，pH9.6）按照8 ug/mL、4 ug/mL、2 ug/mL、1 ug/mL、0.8 ug/mL、0.5 ug/mL、0.4 ug/mL 比例進(jìn)行稀釋后，包被96 孔ELISA 酶標(biāo)板，100 uL/孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，4 ℃包被過(guò)夜。PBST 洗滌3 次，拍干，加入一定量BSA于37 ℃作用一段時(shí)間；洗滌，拍干，將陰陽(yáng)性肺泡灌洗液按1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50 的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋、加樣，100 uL/孔，37 ℃孵育一段時(shí)間后，洗滌、拍干，加入一定濃度的羊抗豬IgA-HRP，37 ℃孵育一段時(shí)間；洗滌，拍干，加入TMB 顯色，室溫作用10 min；加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定OD450nm值，以P/N 比值最大的抗原包被濃度和樣品稀釋度為最佳的工作濃度。

1.7.2 最佳包被條件的確定 采用最佳的抗原包被濃度及陰陽(yáng)性樣品稀釋倍數(shù)，將酶標(biāo)板包被抗原后分別置于4 ℃過(guò)夜，37 ℃、1 h，37 ℃、2 h，其它條件不變，以P/N 比值最大的包被條件確定為最佳包被條件。

1.7.3 最佳封閉濃度及封閉時(shí)間的確定 采用最佳的抗原包被濃度及陰陽(yáng)性樣品稀釋濃度，將酶標(biāo)板分別用5%BSA、4%BSA、3%BSA、2%BSA、1%BSA 進(jìn)行封閉，其它條件不變，以P/N 比值最大的封閉濃度確定為最佳封閉濃度，并根據(jù)最佳封閉濃度確定最優(yōu)的封閉時(shí)間。

1.7.4 最佳一抗工作時(shí)間的確定 采用最佳的包被條件，將陰陽(yáng)性樣品進(jìn)行一定濃度稀釋后，置37 ℃分別作用30 min、45 min、60 min，其它條件不變，以P/N 比值最大的作用時(shí)間確定為最佳一抗工作時(shí)間。

1.7.5 羊抗豬IgA-HRP 最佳工作條件的確定 采用最佳的包被條件，將羊抗豬IgA-HRP 按照一定稀釋比例（說(shuō)明書(shū)推薦濃度）稀釋后分別在37 ℃作用30 min、45 min、60 min，其它條件不變，以P/N 比值最大的作用時(shí)間確定為最佳二抗工作濃度和工作時(shí)間。

1.8 臨界值的確定 用上述建立的方法檢測(cè)52 份臨床鼻拭子樣本（陰性組），測(cè)定OD450nm值。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，OD450nm≥X+3SD 時(shí)，判定為陽(yáng)性；OD450nm≤X+2SD 時(shí)，判定為陰性；介于兩者之間的判定為可疑[11]，同時(shí)利用medcalc 軟件分析ROC 曲線，最終確定其臨界值。

1.9 特異性試驗(yàn) 按照建立的方法，分別對(duì)PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、PEDV 陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)OD450nm值，確定上述建立方法的特異性。

1.10 敏感性試驗(yàn) 采用上述建立的間接ELISA 方法對(duì)不同稀釋倍數(shù)的MPs IgA 陽(yáng)性抗體進(jìn)行檢測(cè)，確定該檢測(cè)方法的靈敏度。

1.11 Mhp 抗體ELISA 檢測(cè)方法的應(yīng)用 為了解某豬群豬肺炎支原體感染情況，選取已知試驗(yàn)場(chǎng)采集豬群鼻拭子，并通過(guò)臨床疫苗實(shí)際免疫情況，結(jié)合Mhp PCR 檢測(cè)方法對(duì)豬群Mps 感染情況進(jìn)行分析，比較該抗體檢測(cè)方法與豬群實(shí)際情況的符合率情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 P97R1 基因的擴(kuò)增 以Mhp 168 菌株為模板，采用特異性引物對(duì)P97R1 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增出大小為280 bp 的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（見(jiàn)圖1）。

圖1 P97R1 基因的PCR 擴(kuò)增

2.2 PET32a-P97R1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將PET32a 載體與P97R1 基因進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后，利用PET32a 通用引物對(duì)獲取的菌落進(jìn)行PCR 鑒定及測(cè)序分析。結(jié)果表明：獲取預(yù)期結(jié)果已知的目的條帶，測(cè)序結(jié)果符合預(yù)期（見(jiàn)圖2）。

圖2 P97R1 重組基因陽(yáng)性菌落的鑒定

2.3 重組P97R1 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及純化 將重組質(zhì)粒PET32a-P97R1 轉(zhuǎn)化至transetta（DE3）中，挑取單菌落，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)4 h 后獲得了可溶性表達(dá)蛋白，其大小約為35 kDa（見(jiàn)圖3）。使用His 融合蛋白陽(yáng)性血清作為一抗，經(jīng)Western Blot 驗(yàn)證其為His標(biāo)簽融合蛋白。經(jīng)His 標(biāo)簽融合蛋白純化柱進(jìn)行純化，獲取較高純度的蛋白，蛋白濃度為336 ug/mL。

圖3 P97R1 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)分析

2.4 豬支原體肺炎IgA 抗體間接ELISA 反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過(guò)方陣滴定試驗(yàn)，確定其最優(yōu)反應(yīng)條件（見(jiàn)表1）。

表1 豬支原體肺炎IgA 抗體ELISA 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.5 臨界值確定 52 份Mps 陰性豬鼻拭子OD450nm的平均值為0.204，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為0.081，確定：當(dāng)樣品OD450nm值≥0.446 判定為陽(yáng)性；當(dāng)樣品OD450nm值≤0.365 判定為陰性；當(dāng)0.365＜樣品OD450nm＜0.446 判定為可疑。ROC 曲線結(jié)果顯示，在OD450nm≤0.365 時(shí)具有較好的特異性和靈敏度。

2.6 特異性試驗(yàn) 結(jié)果表明，本研究建立的間接ELISA 方法與上述病原均無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的特異性（見(jiàn)表2）。

表2 豬支原體肺炎IgA 抗體ELISA 檢測(cè)方法特異性檢測(cè)

2.7 敏感性試驗(yàn) 應(yīng)用上述建立的檢測(cè)方法對(duì)不同稀釋倍數(shù)的Mhp 陽(yáng)性肺泡灌洗液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示當(dāng)樣品稀釋至1∶35 時(shí)，OD450nm值為0.47，判定為陽(yáng)性（見(jiàn)表3）。

表3 豬支原體肺炎IgA 抗體ELISA 檢測(cè)方法靈敏度檢測(cè)

2.8 Mhp 抗體ELISA 檢測(cè)方法的應(yīng)用 應(yīng)用上述建立的方法對(duì)某試驗(yàn)場(chǎng)豬群的92 份鼻拭子樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果共計(jì)檢出陰性樣品73 份，陽(yáng)性樣品13 份，可疑樣品6 份。對(duì)陽(yáng)性樣品、可疑樣品及部分陰性樣品進(jìn)行Mhp 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性樣品的鼻拭子中均存在Mhp 抗原，可疑和陰性樣品中無(wú)Mhp檢出。

3 討論

黏膜免疫是豬支原體肺炎活疫苗的免疫機(jī)制之一。P97R1 是Mhp 纖毛結(jié)合素P97 蛋白氨基酸序列C 末端的重復(fù)序列，直接參與Mhp 對(duì)豬呼吸道黏膜上皮纖毛粘附并發(fā)揮粘附功能，具有很強(qiáng)的免疫原性[12]。華利忠等[13]指出，無(wú)論是肺內(nèi)免疫還是氣溶膠免疫豬支原體肺炎活疫苗均能在一定時(shí)間內(nèi)短暫誘導(dǎo)免疫豬上呼吸道的黏膜免疫，為免疫豬提供早期保護(hù)。SIgA 作為黏膜免疫的主要指標(biāo)，也是病原體入侵機(jī)體后最先產(chǎn)生的抗體。疫苗免疫后通過(guò)快速占位機(jī)制能夠有效地阻止豬肺炎支原體野毒的入侵。有報(bào)道指出，支原體僅需1 h 就能大量粘附宿主細(xì)胞，免疫后2 h 就能夠在肺泡灌洗液中檢測(cè)到毒株的存在。本研究發(fā)現(xiàn)豬支原體肺炎IgA 抗體陽(yáng)性豬只鼻拭子中Mhp 檢測(cè)基本為陽(yáng)性，陰性豬鼻拭子樣品中均未檢測(cè)到Mhp 的存在，且免疫后豬鼻拭子中Mhp 存在時(shí)間達(dá)42 d 之久。這一結(jié)果再次驗(yàn)證了豬支原體肺炎活疫苗（168 株）免疫后能夠長(zhǎng)時(shí)間在呼吸道黏膜產(chǎn)生很好的占位效應(yīng)，且能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生很好的黏膜免疫反應(yīng)。針對(duì)豬支原體肺炎抗體的檢測(cè)方法，很多學(xué)者做了相關(guān)的研究[14]。逯曉敏等[9]建立了抗豬支原體肺炎IgA 間接ELISA 檢測(cè)方法，并將全菌和P97R1 蛋白分別作為抗原進(jìn)行對(duì)比分析，指出全菌蛋白雖然包含了病原菌的全部抗原蛋白，但其可能會(huì)與呼吸道其它支原體產(chǎn)生非特應(yīng)性交叉反應(yīng)。本研究方法與該方法相比大大縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，降低了檢驗(yàn)過(guò)程的復(fù)雜性。

當(dāng)前市面上存在的豬肺炎支原體試劑盒主要是針對(duì)血清中IgG 抗體的診斷試劑盒。而血清中IgG抗體水平的高低與動(dòng)物的免疫保護(hù)情況并無(wú)相關(guān)性。且研究表明[5]，豬群免疫豬支原體肺炎活疫苗能夠產(chǎn)生細(xì)胞免疫，并不能激活機(jī)體體液免疫應(yīng)答；自然感染和免疫滅活苗的豬群則能夠激活機(jī)體的體液免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫M(jìn)hp 活疫苗的豬群血清中無(wú)抗體產(chǎn)生，在鼻拭子中能夠檢測(cè)到IgA 的存在，且經(jīng)過(guò)PCR 鑒定有Mhp 的存在，隨著時(shí)間的推移，豬肺炎支原體含量逐漸降低。這些結(jié)果與先前學(xué)者報(bào)道的一致[12]。當(dāng)前對(duì)于豬支原體肺炎抗體的檢測(cè)并沒(méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)作為參照，大多依據(jù)豬群的免疫情況、臨床癥狀以及剖檢后肺部評(píng)分來(lái)確定豬群感染豬肺炎支原體的情況。在當(dāng)前豬病“老病不斷，舊病新發(fā)”且多種疾病共感染的情況下，根據(jù)上述依據(jù)已很難對(duì)Mhp 疫苗的使用效果作出有效評(píng)定。

本研究通過(guò)Mhp IgA 抗體檢測(cè)方法的建立，結(jié)合Mhp 抗原檢測(cè)以及市面上豬支原體肺炎血清抗體檢測(cè)，能夠有效區(qū)分豬群Mhp 自然感染或疫苗免疫的情況，更有利于對(duì)豬群Mhp 免疫情況進(jìn)行評(píng)估，為豬支原體肺炎疫苗的使用效果提供很好的評(píng)估方案。