熒光抗體病毒中和方法檢測(cè)豬瘟抗體

包松英 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）可引起豬群出現(xiàn)高熱、出血等癥狀的烈性傳染病[1]，免疫接種豬瘟疫苗是防治CSFV 感染最經(jīng)濟(jì)的手段之一。20 世紀(jì)50 年代，我國(guó)學(xué)者通過在兔體內(nèi)傳代350 多代致弱獲得安全性好、免疫原性優(yōu)秀的疫苗種毒C 株，70 多年來，C 株疫苗為我國(guó)豬瘟防控起到了至關(guān)重要的作用。C 株疫苗陽性血清可對(duì)11 種豬瘟野毒和石門強(qiáng)毒株產(chǎn)生中和效力，因此，在現(xiàn)階段CSF 流行趨勢(shì)下，其依然是防控豬瘟的良好選擇[2]。

目前，臨床對(duì)于豬瘟疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)方法主要是抗體檢測(cè)。豬瘟抗體檢測(cè)方法包括間接免疫熒光試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、兔體中和試驗(yàn)、熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（Fluorescent antibody virus neutralization test，F(xiàn)VNT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等，其中ELISA 是目前應(yīng)用最廣的抗體檢測(cè)手段[3]，具備簡(jiǎn)便易操作的優(yōu)點(diǎn)，但常用的間接ELISA 或阻斷ELISA 方法所用的單抗主要針對(duì)E2 蛋白，通常在豬群免疫2～4 周左右才可檢測(cè)出較高抗體陽性率[4]，不能很好地反映疫苗早期的免疫效果；間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)血清中豬瘟全病毒抗體，操作簡(jiǎn)便、易于臨床推廣，但與同病毒屬的其它病毒存在交叉反應(yīng)、致敏紅細(xì)胞批間差異較大等缺點(diǎn)；兔體中和試驗(yàn)是檢測(cè)豬瘟抗體的經(jīng)典方法，但存在試驗(yàn)兔個(gè)體差異、檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)等問題[5]；FVNT 為國(guó)際貿(mào)易指定的豬瘟抗體檢測(cè)方法，采用固定病毒中和稀釋的血清，以熒光抗體檢測(cè)方法檢測(cè)豬瘟抗體。本試驗(yàn)在FVNT 方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，采用對(duì)豬瘟病毒更敏感的ST 細(xì)胞檢測(cè)豬群免疫豬瘟活疫苗（兔源）后的抗體水平，為更客觀地評(píng)價(jià)疫苗免疫早期的抗體水平提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清和細(xì)胞 豬瘟病毒：Thiveral 株，購自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，批號(hào)：SF2-20160717。豬瘟活疫苗（兔源）：由兆豐華生物科技（福州）有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2017070。待檢血清：選擇福州市永泰縣某試驗(yàn)豬場(chǎng)豬瘟抗原抗體陰性的4 周齡小豬15 頭，其中13 頭免疫豬瘟活疫苗（兔源），另外2 頭作為陰性對(duì)照，免疫生理鹽水，分別于一免后7 d、13 d、24 d、34 d 及二免后10 d、20 d 無菌采血，獲得90 份待檢血清，檢測(cè)前經(jīng)過56 ℃水浴30 min 滅活。細(xì)胞：ST細(xì)胞，購自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，由兆豐華生物科技（福州）有限公司保存?zhèn)鞔?/p>

1.2 試劑 MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco 公司；豬瘟病毒間接免疫熒光檢測(cè)試劑盒，購自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.3 病毒培養(yǎng) 將豬瘟病毒（Thiveral 株）按培養(yǎng)液的1%接種ST 細(xì)胞單層，37 ℃孵育1 h 后，加入含1%～5%無牛病毒性腹瀉(BVD)抗體且無豬瘟抗體的胎牛血清MEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)48～60 h，收獲病毒液，分裝凍存于-15 ℃以下冰箱。

1.4 間接免疫熒光法測(cè)豬瘟病毒效價(jià)

1）將1.3 步驟中收獲的豬瘟病毒（Thiveral 株）作10 倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6四個(gè)稀釋度接種于96 孔板培養(yǎng)的ST 細(xì)胞單層，每個(gè)稀釋度接6 孔，100 μL/孔，設(shè)立空白對(duì)照2 孔，僅加MEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱于37 ℃孵育1 h，加入含1%～5%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)液，100 μL/孔，培養(yǎng)96 h后待檢。

2）棄去待檢細(xì)胞的細(xì)胞液，以PBS 輕柔洗滌1～2 次后加入80%冷丙酮溶液，100 μL/孔，2～8 ℃固定30 min，之后棄去丙酮，自然晾干。

3）PBS 洗滌1～2 次，每孔加洗液200 μL，室溫孵育3～5 min 后棄去PBS。

4）加入豬瘟病毒特異性抗體50 μL，37 ℃濕盒作用1 h 后，棄去一抗，重復(fù)1.4 步驟3）。

5）加入FITC-兔抗豬IgG（二抗）50 μL/孔，37 ℃濕盒作用1 h 后棄去二抗，重復(fù)1.4 步驟3）。

6）用藍(lán)色激發(fā)光（選擇波長(zhǎng)490 nm 光源）在倒置顯微鏡下放大100～200 倍進(jìn)行觀察。

7）如待檢細(xì)胞孔出現(xiàn)特異性胞漿內(nèi)黃綠色熒光，判為陽性，否則判為陰性，并按Reed-Munch 法計(jì)算，判讀熒光組培半數(shù)感染量（TCID50）。

1.5 熒光抗體病毒中和方法檢測(cè)豬瘟抗體效價(jià)

1）利用熒光抗體病毒中和方法原理，采用固定病毒稀釋血清的方法檢測(cè)豬瘟抗體。首先將待檢血清用MEM 做2 倍系列稀釋，接著將豬瘟病毒（Thiveral 株）稀釋成含200TCID50/0.1 mL 的工作抗原，將待檢血清與工作抗原等體積混勻，成為病毒與血清混懸液，37 ℃孵育1 h，以MEM 培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，以工作抗原為陽性對(duì)照，與被檢樣品在同樣條件下處理。

2）將上一步驟的混懸液接種96 孔板培養(yǎng)的ST細(xì)胞單層，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度6 孔，孵育1 h。

3）棄去混懸液，補(bǔ)充含3%～5%血清的MEM 培養(yǎng)液，每孔200 μL，培養(yǎng)3～5 d。

4）余下步驟參照豬瘟病毒間接免疫熒光檢測(cè)試劑盒使用方法操作。

5）當(dāng)陽性對(duì)照孔出現(xiàn)而陰性對(duì)照孔未出現(xiàn)特異性黃綠色熒光時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立，否則，試驗(yàn)結(jié)果不成立。如待檢細(xì)胞孔出現(xiàn)特異性胞漿內(nèi)黃綠色熒光，判為陰性，否則判 為陽性，以Reed-Muench 法計(jì)算血清的中和抗體 滴度。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，以LSD 法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

陽性對(duì)照孔可見黃綠色熒光，陰性對(duì)照孔無熒光，試驗(yàn)結(jié)果成立。試驗(yàn)豬免疫前中和抗體均小于1∶2。本次試驗(yàn)共使用試驗(yàn)豬15 頭，其中免疫組13 頭，空白對(duì)照組2 頭，采集免疫后6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)豬前腔靜脈血液樣品，進(jìn)行熒光抗體病毒中和試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 間接免疫熒光法檢測(cè)中和抗體結(jié)果

6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抗體陽性率均為100%，13 頭豬在一免7 d 即可檢測(cè)到中和抗體，之后抗體水平快速升高，一免34 d，中和抗體水平均值達(dá)1∶33.9；二免后10 d，中和抗體水平略有降低，之后繼續(xù)升高，二免20 d，中和抗體水平均值達(dá)1∶38.85，高于一免24 d 的1∶26.16（見圖1）。

圖1 6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)中和抗體平均值消長(zhǎng)趨勢(shì)

利用SPSS 17.0 對(duì)免疫后6 個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表2。一免7 d相對(duì)于之后所有采樣時(shí)間點(diǎn)，中和抗體水平均差異顯著（P＜0.05）；二免后中和抗體水平略有下降，之后快速上升，二免20 d 相較于一免13 d，抗體水平差異極顯著（P＜0.01）。

表2 6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)Bonferroni 分析結(jié)果

3 討論

豬瘟兔化弱毒C 株疫苗長(zhǎng)期以來被應(yīng)用于我國(guó)豬瘟防控，其在組織器官中的增殖不引起病理損傷和病毒血癥[6]，免疫豬體5 d 后即可抵御豬瘟強(qiáng)毒攻擊[7]。豬瘟活疫苗（兔源）是C 株接種健康家兔，收獲出現(xiàn)定型熱的兔體脾臟和腸系膜淋巴結(jié)研磨制備而成的疫苗，保留了病毒良好免疫原性，且副反應(yīng)小[8]，徐磊[9]發(fā)現(xiàn)，豬瘟兔化弱毒脾淋苗可刺激豬體產(chǎn)生比細(xì)胞苗更高比例的CD3+和CD4+淋巴細(xì)胞亞群、CD4+/CD8+比值、淋巴細(xì)胞以及高水平的IFN-γ 和IL-3。而本試驗(yàn)結(jié)果表明，在一免7 d，所有免疫組小豬血液中均已檢測(cè)到具有中和活性的熒光抗體，說明豬瘟活疫苗（兔源）可在短時(shí)間內(nèi)刺激豬體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。規(guī)模豬場(chǎng)一般對(duì)仔豬進(jìn)行2 次豬瘟疫苗免疫，以保證良好的免疫保護(hù)效果[10]。本試驗(yàn)在二免10 d 檢測(cè)到抗體，水平相對(duì)于一免34 d 略有下降，之后快速上升，二免后20 d 的中和抗體水平極顯著高于一免后13 d（P＜0.01），說明二次免疫，可顯著提升豬瘟抗體水平。

目前，豬瘟抗體檢測(cè)方法包括間接免疫熒光試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、兔體中和試驗(yàn)、FVNT 法、ELISA法等。其中IDEXX 公司的豬瘟抗體阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒在科研與臨床上被廣泛使用，該試劑盒檢測(cè)的抗體與中和抗體具有較好的相關(guān)性，但在中和抗體滴度為8 時(shí)，阻斷率為（36±2）%，中和抗體滴度＜8 時(shí)，則檢測(cè)結(jié)果均為陰性[11]。由此可見，在疫苗免疫早期，宜采用中和試驗(yàn)檢測(cè)豬瘟抗體，若采用商品化ELISA 檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)結(jié)果多為陰性或可疑。采用本試驗(yàn)方法，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確且更敏感，適合獸用生物制品企業(yè)進(jìn)行豬瘟疫苗免疫早期的抗體監(jiān)測(cè)。本試驗(yàn)結(jié)果為臨床評(píng)估豬瘟疫苗免疫效果提供了數(shù)據(jù)參考，后期擬進(jìn)一步開展不同抗體檢測(cè)方法的相關(guān)性試驗(yàn)。