SIRT3-FOXO1介導(dǎo)自噬在H9C2心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用

王尚徐，林先和

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于心臟冠狀動(dòng)脈狹窄、閉塞而導(dǎo)致的心肌急性缺血缺氧［1］。急診介入手術(shù)可迅速疏通病變的血管，恢復(fù)缺血心肌的血氧供應(yīng)，是目前治療時(shí)間窗內(nèi)AMI的主要治療方法［2］。然而，在血供恢復(fù)的同時(shí)，缺血部位血流的再灌注也會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成額外的損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。MIRI涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能紊亂和細(xì)胞內(nèi)鈣超載，并可通過細(xì)胞凋亡發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞死亡［3-4］。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類3（silent mating type information regulator 2 homolog 3，SIRT3）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙?；?，為線粒體蛋白去乙?；闹饕{(diào)節(jié)因子［5］。已有研究發(fā)現(xiàn)，在MIRI過程中，SIRT3通過激活A(yù)MPK-mTOR、FOXO3a-Pink1-Parkin通路激活自噬，同時(shí)也可通過SIRT3-SOD2-mROS通路抑制自噬過程［6］。叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）參與細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬，并且響應(yīng)細(xì)胞刺激，發(fā)揮維持組織穩(wěn)態(tài)的作用［7］。既往研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3可通過促使FOXO1去乙酰化來誘導(dǎo)自噬，從而改善心肌細(xì)胞肥大現(xiàn)象［8］。目前有關(guān)SIRT3-FOXO1調(diào)控自噬在MIRI過程中發(fā)揮作用的研究甚少，本研究在細(xì)胞水平構(gòu)建MIRI模型，旨在探究SIRT3-FOXO1通路在MIRI過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑及儀器 大鼠H9C2心肌細(xì)胞及高糖DMEM培養(yǎng)基購自武漢普諾賽公司。慢病毒感染試劑盒購自上海漢恒公司，SIRT3抑制劑3-TYP購自GLPBIO公司，乙?；疐OXO1（Ac-FOXO1）抗體購自賽默飛公司，SIRT3抗體及GAPDH抗體購自Affinity公司，LC3B抗體及Beclin1抗體購自Cell Signaling公司，Bcl-2抗體及Bax抗體分別購自Bioss公司和Abcam公司。逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。Annexin V-APC∕7-AAD熒光雙染凋亡試劑盒購自Elabscience公司，乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒購自日本世諾公司，倒置熒光顯微鏡購自蔡司公司，流式細(xì)胞儀及全自動(dòng)生化儀分別購自貝克曼和日立公司。

1.2 SIRT3穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建及效果驗(yàn)證 大鼠H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，同時(shí)準(zhǔn)備無糖DMEM培養(yǎng)基（不含胎牛血清及抗生素）用于模擬缺血處理。所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在缺血再灌注干預(yù)前均置于普通培養(yǎng)箱（95%空氣，5%CO2，37℃）中培養(yǎng)。選擇生長狀況良好的H9C2心肌細(xì)胞，分為SIRT3過表達(dá)組和空病毒對(duì)照組，分別用帶有SIRT3+綠色熒光蛋白（GFP）基因和只帶GFP基因的病毒，以感染復(fù)數(shù)（MOI）值=40進(jìn)行慢病毒感染72 h，嘌呤霉素（1 mg∕L）篩選后獲得SIRT3穩(wěn)定過表達(dá)株。倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。采用qPCR檢測SIRT3過表達(dá)效果。Trizol法提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。SIRT3引物上游5'-GGTCCAGCTAGGGGATGTAGT-3'，下游5'-CCCGCAGGTGAAGAAGTAAG-3'。內(nèi)參β-actin引物上游5'-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3'，下游5'-CCTTCTGACCCATACCCACC-3'。20μL反應(yīng)體系包含TB Green Premix Ex TaqⅡ（2×）10μL，上、下游引物（10μmol∕L）各0.8μL，cDNA（50μg∕L）2.0μL，滅菌水6.4μL。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。SIRT3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法進(jìn)行半定量分析。

1.3 體外構(gòu)建缺血再灌注損傷模型及實(shí)驗(yàn)分組 H9C2細(xì)胞設(shè)正常對(duì)照（NC）組、缺血再灌注（IR）組、SIRT3過表達(dá)+缺血再灌注（S+IR）組、SIRT3過表達(dá)+IR+SIRT3抑制劑（S+IR+3-TYP）組。NC組細(xì)胞置于普通培養(yǎng)箱中添加高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。IR組細(xì)胞置于缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱（1%O2，5%CO2，37℃）中，添加無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h；隨后更換為高糖DMEM培養(yǎng)基，置于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。S+IR組將SIRT3過表達(dá)的H9C2心肌細(xì)胞用無糖DMEM培養(yǎng)基缺氧培養(yǎng)3 h，隨后更換為高糖DMEM培養(yǎng)基，置于普通培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。S+IR+3-TYP組將SIRT3過表達(dá)的H9C2心肌細(xì)胞置于含有3-TYP（50μmol∕L）無糖DMEM培養(yǎng)基中，缺氧培養(yǎng)3 h，隨后更換為含3-TYP（50μmol∕L）的高糖DMEM培養(yǎng)基，在95%空氣，5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.4 Western blot法檢測SIRT3、Ac-FOXO1、LC3B、Beclin1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 將RIPA和PMSF按100∶1比例混合，用于提取各組心肌細(xì)胞總蛋白。配制10%的SDS-PAGE分離膠，上樣進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶中封閉2 h。一抗SIRT3、Ac-FOXO1、LC3B、Bax（均為1∶1000稀釋），Beclin1、Bcl-2、GAPDH（均為1∶2000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次。二抗（1∶3000）孵育1 h，TBST洗膜后顯影。檢測SIRT3、Ac-FOXO1，自噬標(biāo)記蛋白LC3B、Beclin1及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。

1.5 上清液中LDH及細(xì)胞凋亡率檢測 收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液200μL，用全自動(dòng)生化儀檢測LDH水平。隨后用0.25%胰酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，收集各組細(xì)胞沉淀。采用Annexin V-APC∕7-AAD熒光雙染凋亡試劑盒處理細(xì)胞樣本，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0和Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行分析，每組實(shí)驗(yàn)最少進(jìn)行3次。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn)，雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染H9C2心肌細(xì)胞的GFP表達(dá)及SIRT3過表達(dá)情況 慢病毒感染細(xì)胞72 h后，倒置熒光顯微鏡下可見SIRT3過表達(dá)組大量表達(dá)GFP，提示感染成功，見圖1。隨后經(jīng)qPCR驗(yàn)證，SIRT3過表達(dá)組SIRT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量（3.31±0.13）較空病毒對(duì)照組（1.00±0.14）升高（t=16.257，P＜0.01），SIRT3過表達(dá)成功。

Fig.1 The GFP expression of H9C2 cells infected with lentivirus(×100)圖1 慢病毒感染H9C2心肌細(xì)胞后的GFP表達(dá)（×100）

2.2 各組H9C2細(xì)胞SIRT3、Ac-FOXO1蛋白表達(dá)水平比較 與NC組比較，IR組SIRT3表達(dá)降低，而Ac-FOXO1表達(dá)升高（P＜0.05）；與IR組比較，S+IR組SIRT3表達(dá)升高，而Ac-FOXO1表達(dá)降低（P＜0.05）；S+IR+3-TYP組較S+IR組SIRT3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但Ac-FOXO1表達(dá)升高（P＜0.05），見圖2、表1。

Fig.2 Expressions of SIRT3,Ac-FOXO1,LC3B,Beclin1,Bcl-2 and Bax protein detected by Western blot assay in the four groups圖2 Western blot檢測各組細(xì)胞SIRT3、Ac-FOXO1、LC3B、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

Tab.1 Comparison of expression levels of SIRT3 and Ac-FOXO1 between the four groups表1 各組細(xì)胞SIRT3、Ac-FOXO1蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of expression levels of SIRT3 and Ac-FOXO1 between the four groups表1 各組細(xì)胞SIRT3、Ac-FOXO1蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與IR組比較，c與S+IR組比較，P＜0.05

組別NC組IR組S+IR組S+IR+3-TYP組F SIRT31.15±0.050.80±0.05a 1.06±0.09b 0.99±0.157.974**Ac-FOXO10.60±0.050.75±0.02a 0.60±0.07b 0.76±0.04c 10.080**

2.3 各組細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與NC組比較，IR組自噬標(biāo)記蛋白LC3B、Beclin1表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高（均P＜0.05）；與IR組比較，S+IR組LC3B、Beclin1、Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)降低（均P＜0.05）；與S+IR組比較，S+IR+3-TYP組LC3B、Beclin1、Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高（均P＜0.05），見圖2、表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of autophagy marker proteins and apoptosis-related proteins between the four groups表2 各組細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of autophagy marker proteins and apoptosis-related proteins between the four groups表2 各組細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與IR組比較，c與S+IR組比較，P＜0.05

組別NC組IR組S+IR組S+IR+3-TYP組F LC3B 0.62±0.030.88±0.10a 1.14±0.04ab 0.88±0.08ac 28.900**Beclin10.79±0.040.95±0.02a 1.27±0.07ab 1.06±0.04ac 63.190**Bcl-21.33±0.060.82±0.06a 1.27±0.04ab 1.07±0.11ac 30.930**Bax 0.80±0.071.04±0.11a 0.74±0.03b 0.93±0.03ac 11.730**

2.4 各組細(xì)胞上清液LDH水平及細(xì)胞凋亡率的比較 與NC組比較，IR組細(xì)胞上清液LDH水平升高，細(xì)胞凋亡率升高；與IR組比較，S+IR組上清液LDH水平降低，細(xì)胞凋亡率下降；與S+IR組比較，S+IR+3-TYP組上清液LDH水平升高，細(xì)胞凋亡率升高（均P＜0.05），見圖3、表3。

3 討論

已有研究證實(shí)，SIRT3-FOXO3a、SIRT3-SOD等信號(hào)通路的激活可以減輕氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，從而改善MIRI［9-10］。同時(shí)，SIRT3作為一種重要的去乙?；?，可促使FOXO1去乙酰化，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)Bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，在模擬心肌缺血再灌注過程中，H9C2細(xì)胞SIRT3表達(dá)下降，細(xì)胞中Ac-FOXO1表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞遭受損傷。過表達(dá)SIRT3后，Ac-FOXO1含量減少，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率降低。然而，使用SIRT3抑制劑3-TYP后，SIRT3表達(dá)水平不受影響，但活性受到抑制，乙?；疐OXO1含量增加，細(xì)胞凋亡率增加，損傷加重，SIRT3過表達(dá)發(fā)揮的保護(hù)作用被消除。本研究證實(shí)SIRT3在心肌缺血再灌注過程中使FOXO1去乙酰化發(fā)揮保護(hù)作用，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［9-11］。過表達(dá)SIRT3基因后，同時(shí)伴隨自噬標(biāo)記蛋白LC3B、Beclin1表達(dá)量的進(jìn)一步增加；但使用SIRT3抑制劑3-TYP后，LC3B、Beclin1表達(dá)量下降，提示SIRT3-FOXO1通路在MIRI中的保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)自噬水平發(fā)揮的。

Fig.3 Apoptosis was detected by flow cytometry in each group圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況

Tab.3 Comparison of LDH level in cell supernatant and apoptosis rate between the four groups表3 各組細(xì)胞上清液LDH水平及凋亡率比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of LDH level in cell supernatant and apoptosis rate between the four groups表3 各組細(xì)胞上清液LDH水平及凋亡率比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與IR組比較，c與S+IR組比較，P＜0.05

組別NC組IR組S+IR組S+IR+3-TYP組F LDH水平（U∕L）14.00±2.6553.67±3.21a 35.33±2.52ab 50.67±1.53ac 152.000**凋亡率（%）6.61±1.2720.76±1.94a 11.36±0.74ab 20.09±1.58ac 67.650**

細(xì)胞自噬是一種保守的細(xì)胞分解代謝途徑，當(dāng)受到外界損傷刺激時(shí)，自噬可以將受損的蛋白質(zhì)乃至某些細(xì)胞器進(jìn)行回收利用，以利于細(xì)胞生存［12-13］。FOXO1具有關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，在葡萄糖剝奪培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，F(xiàn)OXO1被去磷酸化并定位于細(xì)胞核，促進(jìn)自噬通路基因如Atg12的表達(dá)［14］。FOXO1去乙?；梢哉T導(dǎo)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，在心肌細(xì)胞營養(yǎng)和能量不足的情況下減輕凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用［15］。SIRT3可以與FOXO1結(jié)合使其去乙酰化，去乙?；腇OXO1轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，激活下游的E3泛素連接酶促進(jìn)自噬的發(fā)生，減輕心肌肥厚［8］。自噬與凋亡關(guān)系密切，自噬可以抑制應(yīng)激反應(yīng)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，也可以通過抑制凋亡蛋白caspase的激活來阻斷凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用，同時(shí)Bcl-2蛋白家族可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)凋亡和自噬［16］。本研究結(jié)果提示，SIRT3可能通過激活FOXO1去乙?；龠M(jìn)H9C2心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，使Bcl-2蛋白的表達(dá)增加，Bax蛋白的表達(dá)減少，減少H9C2心肌細(xì)胞在缺血再灌注損傷中的凋亡。

自噬在心肌缺血再灌注的不同階段發(fā)揮不同的作用。在心肌缺血階段，自噬通過降解損傷的蛋白，為蛋白質(zhì)和糖類的合成提供氨基酸，同時(shí)為三羧酸循環(huán)提供底物用于合成三磷酸腺苷（ATP），從而保護(hù)細(xì)胞免于死亡［17］。再灌注階段，自噬水平上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞成分的進(jìn)行性消耗，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，過度的激活自噬反而對(duì)機(jī)體造成損傷。Beclin 1作為自噬的啟動(dòng)分子，在再灌注階段其表達(dá)減少后可引發(fā)自噬水平下調(diào)，進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡［18］。Wu等［19］研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3的激活導(dǎo)致Beclin1和LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ表達(dá)減少，抑制過度線粒體自噬，在缺氧復(fù)氧損傷過程中保護(hù)H9C2細(xì)胞。本研究與上述研究相比，除缺氧復(fù)氧時(shí)間不同外，在模擬缺血處理的過程時(shí)，將高糖培養(yǎng)基更換為無糖培養(yǎng)基，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同可能由于造模方法不同。由此可見，SIRT3、FOXO1與自噬在MIRI中的關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究，如何減少自噬相關(guān)性損傷，發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)功能仍是一項(xiàng)難題。

本研究為探究SIRT3-FOXO1通路、MIRI和自噬之間的聯(lián)系提供了新的線索，有助于加深對(duì)自噬調(diào)控的理解，為靶向自噬作為MIRI的新療法提供支持。本研究局限性在于未對(duì)FOXO1進(jìn)行抑制，不排除SIRT3通過其他通路發(fā)揮作用，后續(xù)將完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。