可測量殘留病與兒童急性髓系白血病治療反應(yīng)與預(yù)后的關(guān)系研究進(jìn)展

霍 婭 綜述，于 潔 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400013)

急性髓系白血病(AML)是一種侵襲性極強(qiáng)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病，其特征是骨髓中未成熟的髓系前體細(xì)胞不受控制的增殖，導(dǎo)致造血功能損傷及骨髓衰竭，占兒童急性白血病的20.00%～25.00%。在AML治療反應(yīng)的評估中光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)完全緩解(CR，三系造血恢復(fù)，骨髓原始細(xì)胞小于5.00%)被認(rèn)為是預(yù)測AML患者預(yù)后的一個重要因素，但有研究發(fā)現(xiàn)，即使獲得形態(tài)學(xué)CR的患者仍有相當(dāng)部分最終復(fù)發(fā)，表明以形態(tài)學(xué)作為評估AML患者預(yù)后的指標(biāo)具有局限性。更重要的是，AML具有明確的遺傳學(xué)及免疫表型的異質(zhì)性，單純細(xì)胞遺傳學(xué)異常及基因突變不能完全預(yù)測患者預(yù)后，迫切需要一個能更好地評估治療反應(yīng)、實(shí)現(xiàn)個體化治療的生物學(xué)標(biāo)志物。

可測量殘留病(MRD)在20世紀(jì)90年代初首次被提出，是指AML患者經(jīng)化療或骨髓移植治療后在形態(tài)學(xué)CR測定的閾值以下檢測到持續(xù)存在的白血病細(xì)胞群?？捎糜诒O(jiān)測AML細(xì)胞對治療的反應(yīng)及早期預(yù)測分子復(fù)發(fā)，目前，已被用于急性淋巴細(xì)胞白血病及急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療標(biāo)準(zhǔn)制定與預(yù)后評估，同時，越來越多的血液學(xué)專家研究分析了MRD作為成人及兒童AML預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物的應(yīng)用價(jià)值[1]，結(jié)果表明，相較于形態(tài)學(xué)評估，MRD能更精確地評估治療反應(yīng)，通過結(jié)合傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)分層方法能幫助制定更加個性化的緩解后治療策略，而非既往“一刀切”的治療方式，從而明顯降低復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，提高遠(yuǎn)期總生存率(OS)。由此可見，MRD有望成為一個獨(dú)立的、有力的兒童AML的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)[2-3]。

1 MRD檢測方法

MRD檢測原理是通過檢測在白血病發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)的基因及免疫表型改變，從而區(qū)分正常細(xì)胞與白血病細(xì)胞。但AML的遺傳異質(zhì)性為MRD檢測的臨床應(yīng)用帶來了嚴(yán)峻的考驗(yàn)，目前尚無統(tǒng)一的檢測方法，主要通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(MFC)、定時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)、二代測序(NGS)等進(jìn)行MRD檢測。

1.1MFC MFC主要基于2種部分重疊的手段進(jìn)行MRD檢測：(1)通過檢測診斷時確定的白血病相關(guān)免疫表型(LAIPs)識別白血病細(xì)胞和正常細(xì)胞；(2)基于識別供MRD檢測的標(biāo)本中與健康者不同的任何免疫表型(DFN)[4]。其中LAIPs主要包括4種類型，即抗原交叉表達(dá)、抗原異步表達(dá)、抗原過表達(dá)及缺失表達(dá)。基于LAIPs的MFC-MRD檢測方法主要使用多參數(shù)單克隆抗體板，在兒童AML患者中適用范圍廣泛(>90.00%)，但現(xiàn)有研究表明，在AML患者中抗原漂移的頻率達(dá)到50.00%～91.00%，嚴(yán)重影響了檢測準(zhǔn)確性[5]。而基于DFN的MFC-MRD檢測方法可識別免疫表型與正常骨髓干/祖細(xì)胞不同的原始細(xì)胞群，而無須診斷時預(yù)先確定的LAIPs，從而有效避免了免疫表型漂移[6]。

1.2RT-qPCR RT-qPCR現(xiàn)已成為AML-MRD檢測最常用的分子技術(shù)。主要檢測對象：(1)融合基因，如CBFβ-MYH11、RUNX1-RUNXT1及MLL基因重排等；(2)白血病相關(guān)基因突變，如FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列(FLT3-ITD)、核仁磷酸蛋白1(NPM1)等；(3)基因過表達(dá)，如腫瘤易感基因1(WT1)、嗜親性病毒整合位點(diǎn)1等。其結(jié)果通常以被測基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的拷貝數(shù)相對于管家基因拷貝數(shù)的百分比表示，治療前后值的變化以對數(shù)形式表示[6]。其中常見融合基因及NPM1基因突變等已被研究證實(shí)作為理想的MRD檢測靶點(diǎn)，在成人及兒童AML中均具有重要的預(yù)后意義[6-8]。然而WT1基因雖然在80.00%～90.00%的兒童AML中過表達(dá)，但受正常細(xì)胞中背景表達(dá)水平的影響，其高表達(dá)水平僅在小于50.00%的患者中可檢測到，故尚未納入AML-MRD檢測常規(guī)[9]。

1.3NGS AML是一種具有高度遺傳異質(zhì)性的惡性疾病，在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中有多種基因異常參與，目前，較為重要的包括白血病啟動突變，如表觀遺傳調(diào)節(jié)因子——DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A、TET癌基因家族成員2、ASXL1、異檸檬酸脫氫酶1/2突變，與不良預(yù)后相關(guān)的RUNX1、TP53、FLT3-ITD/酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、KIT突變，以及通常提示良好預(yù)后的CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白A突變等。這些基因突變中的一部分已被確定具有直接的診斷、預(yù)后和靶向治療意義[10]。NGS的主要測序技術(shù)：(1)全基因組測序WGS；(2)全外顯子測序WES；(3)靶基因測序[9]。NGS能直接通過DNA重測序檢測到上述基因異常，其中對于將NPM1及FLT3-ITD突變作為AML-MRD的檢測靶點(diǎn)，多項(xiàng)研究已證實(shí)其具有比PCR檢測更加突出的優(yōu)勢，能有效解決其克隆異質(zhì)性的問題，甚至為靶向治療提供有力信息[11-12]。但明確有力的白血病相關(guān)基因突變可作為NGS-MRD檢測標(biāo)記及NGS的臨床價(jià)值仍需大量前瞻性研究證實(shí)，并在各個實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和協(xié)調(diào)化。NGS進(jìn)一步彌補(bǔ)了MFC及PCR的局限性。同時，新興的PCR技術(shù)——數(shù)字PCR能直接定量和克隆擴(kuò)增目標(biāo)核酸，無須標(biāo)準(zhǔn)曲線，也體現(xiàn)出相較于RT-qPCR，數(shù)字PCR具有更大的使用范圍和靈敏度[13]。

因多種檢測技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，如MFC的突出優(yōu)勢在于其廣泛的適用性，PCR、NGS卻具有更高的靈敏度；PCR的適用范圍相對狹窄，而NGS的臨床價(jià)值尚有待于驗(yàn)證等。在JONGEN-LAVRENCIC等[14]提出多種檢測技術(shù)結(jié)合可提高靈敏度，增加預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性。因此，在不同的時間點(diǎn)和不同類型AML患者中選擇合適的MRD檢測方法或組合方法也許是更高效的策略。

2 MRD評估在AML臨床實(shí)踐中的應(yīng)用

目前，兒童AML的治療藥物主要包括抗代謝藥(阿糖胞苷或6-巰基嘌呤)、蒽環(huán)類藥物(柔紅霉素或伊達(dá)比星或米托蒽醌)、依托泊苷等。治療方案經(jīng)過誘導(dǎo)化療(通常為2個療程)和緩解后強(qiáng)化化療(2個或3個療程)或造血干細(xì)胞移植(HSCT)。各個國際組織的治療方案雖然在治療藥物的強(qiáng)度、累積劑量和蒽環(huán)類藥物的選擇方面有所不同，但最終結(jié)局大致相同，誘導(dǎo)治療后CR率可達(dá)85.00%～90.00%，然而其中20.00%～41.00%的患者最終復(fù)發(fā)，5年無事件生存率(EFS)僅為40.00%～60.00%[15]，這種高復(fù)發(fā)率與MRD密切相關(guān)。2017年歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)[1]和國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)[16]關(guān)于成人AML最新的指南中已經(jīng)提議將MRD評估用于成人AML臨床實(shí)踐中。

近10年來，大量回顧性研究表明，無論檢測方法、標(biāo)記和治療策略的不同，特定時間點(diǎn)進(jìn)行MRD檢測呈陽性或MRD水平升高是兒童AML患者復(fù)發(fā)和生存期縮短的獨(dú)立預(yù)后因素[15,17-18]。一項(xiàng)在142例兒童AML的研究中分別在2次阿糖胞苷、伊達(dá)比星聯(lián)合依托泊苷(ICE)方案誘導(dǎo)治療后使用MFC進(jìn)行骨髓MRD評估，將大于0.10%作為MRD陽性閾值，結(jié)果顯示，ICE1后8年MRD陽性和陰性患者無病生存率(DFS)分別為73.10%、35.20%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，8年OS分別為82.20%、51.60%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 5)，8年累計(jì)復(fù)發(fā)率(CIR)分別為23.50%、62.80%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 5)，ICE2后得出了相似的結(jié)果，且ICE1后MED呈陽性的患者即使在ICE2后MRD轉(zhuǎn)為陰性，仍有較差的預(yù)后，多因素分析結(jié)果顯示，誘導(dǎo)治療后MFC-MRD陽性是DFS、OS、CIR的獨(dú)立不良預(yù)后因素[15]。雖然治療策略、樣本量和MRD閾值(0.10%～0.25%)略有差異，但多項(xiàng)基于MFC的MRD評估研究中MRD陽性與較差的無復(fù)發(fā)生存率和CIR相關(guān)[3,17]。即使上述研究均為回顧性研究，在一定程度上缺乏隨機(jī)性，但已經(jīng)提示誘導(dǎo)治療后MRD陽性患者擁有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)納入臨床試驗(yàn)進(jìn)行基于風(fēng)險(xiǎn)的治療分配(如HSCT)。

以融合基因作為靶點(diǎn)進(jìn)行的MRD評估相關(guān)研究同樣證實(shí)了其臨床適用性。GAO等[18]在對初次診斷為t(8;21)AML的55例中國兒童的研究中在治療及隨訪過程中以RT-qPCR動態(tài)監(jiān)測RUNX1-RUNXT1轉(zhuǎn)錄本，首次誘導(dǎo)后將RUNX1-RUNXT1轉(zhuǎn)錄本下降小于2log的患者和大于或等于2log的患者進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，5年無復(fù)發(fā)生存率分別為71.60%、48.10%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)，5年OS分別為76.90%、48.90%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)，5年CIR分別為24.3%、52.60%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)；同時，在監(jiān)測到分子復(fù)發(fā)的16例患兒中及時采取HSCT 2例患兒未復(fù)發(fā)，其余14例未采取搶先治療措施的患兒最終均發(fā)展為血液學(xué)復(fù)發(fā)，且中位時間為4個月。其他監(jiān)測融合基因轉(zhuǎn)錄本動力學(xué)變化的兒童AML研究得出了相似的結(jié)論；多因素分析結(jié)果顯示，特定時間點(diǎn)(首次誘導(dǎo)后或鞏固治療后)融合基因轉(zhuǎn)錄本陽性或水平升高是不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19]。目前，雖然暫時缺乏將NPM1基因突變和WTI過表達(dá)作為MRD監(jiān)測靶點(diǎn)在兒童AML中預(yù)后價(jià)值的相關(guān)數(shù)據(jù)，但在成人的研究中有喜歡文獻(xiàn)報(bào)道，NPM1和WT1轉(zhuǎn)錄水平升高是高復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)的一個重要因素[20-21]。

對兒童AML患者的風(fēng)險(xiǎn)分層通常以診斷時參數(shù)(如診斷年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞遺傳學(xué)及法美英分型)和初始治療反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)，其中最重要的是細(xì)胞遺傳學(xué)和初始治療反應(yīng)，2017年歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)提出以細(xì)胞遺傳學(xué)將成人AML患者分為3個危險(xiǎn)組[1]。然而越來越多的證據(jù)顯示，MRD是評估早期治療反應(yīng)的重要參數(shù)。已有將成人AML患者按MFC-MRD檢測結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分組的文獻(xiàn)報(bào)道，在不同LAIPs表達(dá)水平的風(fēng)險(xiǎn)組中3年CIR也各有差異，提示將MRD用于AML風(fēng)險(xiǎn)分層的可行性；但其并未根據(jù)MRD制定特定的治療策略，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證[22]。BUCCISANO等[23]將MRD與遺傳學(xué)異常相結(jié)合的綜合評價(jià)改善了風(fēng)險(xiǎn)評估方法，并提出在高危組和緩解后MRD陽性患者中推薦使用HSCT，而對于低危組中獲得MRD陰性的患者HSCT并不能改善其預(yù)后，甚至可能因此受到損害。

兒童AML治療過程中標(biāo)準(zhǔn)化療雖然能提高AML患兒存活率，但化療藥物通常存在明顯的不良反應(yīng)，同時，在強(qiáng)化治療策略的選擇中低危者大多數(shù)采用化療的治療方式，而高危者被認(rèn)為是HSCT的適應(yīng)證，但中危、難治性及復(fù)發(fā)患者的治療方案選擇目前尚無明確的標(biāo)準(zhǔn)。因此，精確地評估初始治療反應(yīng)，進(jìn)行更準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)分層，從而確定個體化的治療方案，避免中、低危尤其是中?；颊哂捎谶^度治療帶來的損害及并發(fā)癥是必需的，同樣，早期識別高危患者，及早給予強(qiáng)化治療和HSCT以提高OS也是必要的。ZHU等[24]在成人AML的相關(guān)研究中以RUNX1-RUNXT1為MRD檢測靶點(diǎn)，僅以MRD水平作為風(fēng)險(xiǎn)分層標(biāo)記，將風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)向治療與非風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)向治療組進(jìn)行比較，接受異基因HSCT的高?；颊逤IR明顯低于僅接受化療的患者(分別為22.10%、78.90%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 1)，長期DFS明顯升高(分別為61.70%、19.60%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。證實(shí)將MRD評估納入緩解后治療決策可能是患者獲得與疾病侵襲性所需的集中治療、改善預(yù)后的關(guān)鍵措施。然而，目前尚無證據(jù)證明早期干預(yù)MRD陽性的AML患者能有效改善預(yù)后，需要在早期干預(yù)治療相關(guān)死亡方面的潛在代價(jià)和MRD陽性復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)之間權(quán)衡利弊[25]。

考慮化療藥物的不良反應(yīng)，近年來，血液學(xué)家將目光轉(zhuǎn)移到分子靶向治療方面，其中吉妥珠單抗(GO)已進(jìn)入兒童AML一線Ⅲ期臨床試驗(yàn)[26]。RUBNITZ等[27]在232例兒童AML患者中通過MFC檢測MRD，以0.10%為閾值，在第1次誘導(dǎo)后根據(jù)MRD水平?jīng)Q定第2次誘導(dǎo)治療的策略，MRD陽性患者行阿糖胞苷、柔紅霉素聯(lián)合依托泊苷(ADE)+GO方案治療，MRD陰性患者繼續(xù)ADE方案，2次誘導(dǎo)治療后根據(jù)MRD水平和遺傳異常進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層，高危組分配為HSCT，低危組行3個療程的強(qiáng)化治療，標(biāo)危組僅在同胞供體匹配情況行HSCT，結(jié)果顯示，在接受ADE+GO方案治療的MRD陽性患者中大部分MRD水平降低甚至轉(zhuǎn)陰，AML患兒整體3年EFS為63.00%，OS為71.00%，略優(yōu)于現(xiàn)有數(shù)據(jù)，提示MRD指導(dǎo)的風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)向治療可能改善AML患者的預(yù)后。然而O′HEAR等[28]研究表明，對于接受與未接受GO治療的患兒比較，雖然誘導(dǎo)治療后MRD水平降低更明顯，但5年OS、EFS、CIR并無明顯差異。提示目前尚無確鑿證據(jù)證明早期干預(yù)MRD陽性的AML患者能改善其預(yù)后，尚需大樣本前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)證實(shí)。

3 移植應(yīng)用

目前，在兒童AML患者中HSCT仍是高?；颊呔徑夂笾委煹淖罴堰x擇，但對適宜進(jìn)行移植患者的選擇仍依賴于傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)分層，MRD在移植前后的預(yù)后意義和對選擇移植強(qiáng)化治療的指導(dǎo)意義仍在研究中。關(guān)于移植前MRD與AML預(yù)后關(guān)系的19篇meta分析結(jié)果顯示，移植前MRD與更差的DFS(危險(xiǎn)比=2.76，95%可信區(qū)間：1.90～4.00)、OS(危險(xiǎn)比=2.36，95%可信區(qū)間：1.73～3.22)、CIR(危險(xiǎn)比=3.65，95%可信區(qū)間：2.53～5.27)相關(guān)，但與無復(fù)發(fā)死亡率(危險(xiǎn)比=1.12，95%可信區(qū)間：0.81～1.55)無關(guān)，而且此結(jié)果在各種不同的檢測方法、治療策略和患者年齡等情況下均成立，表明移植前MRD與移植后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)以及生存時間密切相關(guān)[29]。

對于移植指征的選擇，高?；颊咄ǔＪ亲罴堰m應(yīng)證，標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)患者僅在有可匹配的供體時選擇，但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，誘導(dǎo)后MRD評估可能重新定義HSCT的指針選擇。ZHU等[24]研究表明，MRD陽性患者受益于HSCT，而MRD陰性患者則效果更差。隨后在法國的一項(xiàng)關(guān)于成人NPM1的研究中同樣證實(shí)了這一觀點(diǎn)[20]。但遺憾的是，上述研究并不具備隨機(jī)性，同時，兒童AML中也缺乏類似的多中心前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)其準(zhǔn)確性。

4 小 結(jié)

雖然已有大量證據(jù)證實(shí)MRD在AML臨床實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值，但由于當(dāng)前所面臨的挑戰(zhàn)，目前MRD在非急性早幼粒細(xì)胞白血病的AML中的重要性尚有待于提高。這些困難包括上述提出的檢測方法、檢測標(biāo)本及閾值尚有待于統(tǒng)一的問題，以及大量MRD假陽性和假陰性的存在，表明各種檢測方法的靈敏度和特異性均有待于提高，甚至需開發(fā)有更高靈敏度及適用性的檢測方法。其次，疾病異質(zhì)性也是制約條件之一，有研究表明，檢測到常見遺傳學(xué)異常，如NPM1、FLT3-ITD、RUNX1-RUNXT1、CBFβ-MYH11突變及常見LAIPs的AML患者僅占所有病例的60.00%；且作為分子靶點(diǎn)的LAIPs及基因突變拷貝數(shù)及種類在病程中可能隨著白血病細(xì)胞群數(shù)量的變化而成比例變化，缺乏白血病干細(xì)胞通用的表面標(biāo)志物；以及缺乏隨機(jī)性及前瞻性研究，現(xiàn)有的幾乎所有研究均為回顧性研究，普遍存在治療方法異質(zhì)性、研究隊(duì)列太小等問題，缺乏不同人群、不同治療方法、不同AML亞型、不同疾病狀態(tài)及不同檢測方法的前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)證實(shí)在AML中引入MRD進(jìn)行綜合評估的必要性。

目前，MRD檢測正逐步從實(shí)驗(yàn)研究階段向臨床實(shí)踐階段發(fā)展，盡管MRD檢測技術(shù)在AML臨床實(shí)踐中的應(yīng)用尚有待于進(jìn)一步研究，但從現(xiàn)階段研究來看，將MRD評估引入兒童AML患者預(yù)后分層是MRD指導(dǎo)治療新時代的開始，極有可能在不久的將來為患者制定個性化精準(zhǔn)治療，從而避免AML患者治療不足或過度。