青蒿素及其衍生物抗真菌研究進展

駱萬婷，李海濤，楊蓉婭

真菌感染是全球性健康問題，侵襲性真菌感染每年導(dǎo)致＞150萬人死亡。據(jù)估算，全球近10億人患有皮膚、甲和頭發(fā)真菌感染，超過1.5億人患有嚴重的真菌疾病，對患者產(chǎn)生重大的或致命的影響。臨床常用的抗真菌藥主要為唑類，多烯類和棘白菌素類3類，抗真菌藥的耐藥問題已成為全球性棘手問題。此外，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的某些唑類殺菌劑，例如丙環(huán)唑或戊唑醇，具有與臨床唑類藥物相同的抗真菌作用機制，長期應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域可誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株，從而可以間接引起人類的感染耐藥菌。因此，迫切需要開發(fā)新的抗真菌藥，或篩選非專利藥物庫中具有抗真菌作用的藥物。

1972年，中國科研人員成功地從黃花蒿中提取得到能有效抗瘧疾的青蒿素。青蒿素屬倍半萜類化合物，而青蒿素衍生物，如雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等，保留了至關(guān)重要的過氧基。目前，青蒿素及其衍生物在抗瘧疾、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等方面研究廣泛。近幾年，青蒿素類藥物抗真菌的作用和機制研究有所進展。本文就青蒿素及衍生物抗真菌方面的研究進行綜述。

1 青蒿素及其衍生物對常見醫(yī)學(xué)致病真菌的作用研究

1.1 念珠菌

青蒿素及其衍生物單用對念珠菌的作用不確切，作用機制可能是降低蛋白酶活性、磷脂酶活性，降低麥角固醇含量、干擾金屬穩(wěn)態(tài)等。

Galal等[1]使用改良版美國臨床和實驗室標準化委員會（National Committee for Clinical Laboratory，NCCLS）推薦方法對32種青蒿素類藥物進行藥敏試驗，研究顯示，青蒿素類藥物對白念珠菌的效果不佳，其中青蒿素對白念珠菌ATCC 90028的最低抑菌濃度（minium ihibitory concentration，MIC）為50 μg/ml，半數(shù)抑制濃度IC50為8 μg/ml。Slade等[2]采用改良臨床實驗室標準化研究所（CLSI）推薦方法對青蒿素、雙氫青蒿素及雙氫青蒿素縮醛二聚體進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)這些藥物對白念珠菌ATCC 90028，光滑念珠菌ATCC 90030，克柔念珠菌ATCC 6258效果不佳，但部分藥物有效并存在優(yōu)于兩性霉素B的情況。Khatoon等[3]用青蒿葉提取物制備納米銀顆粒，其對白念珠菌ATCC 90028、光滑念珠菌ATCC 90030、熱帶念珠菌ATCC 750具有顯著抗真菌功效，可顯著降低蛋白酶和磷脂酶的活性，降低麥角固醇含量，并破壞細胞膜完整性，MIC90分別為120 μg/ml、80 μg/ml、90 μg/ml。Stylianou等[4]的研究中采用微量稀釋法、吸光度測定、ATP水平測定3種方式聯(lián)合確定青蒿素對白念珠菌SC 5314在6 h和24 h的MIC值范圍為4.8×10-5～2.82 μg/ml，表明具有抑制作用。

Simm和May[5]以白念珠菌CaI4為研究對象，篩選了1 200種化合物以尋找干擾真菌金屬穩(wěn)態(tài)的現(xiàn)有藥物，結(jié)果顯示，青蒿素能夠減少細胞內(nèi)總鐵以及不穩(wěn)定的鋅，而鋅的總量不變。因此，推測青蒿素可能通過干擾細胞內(nèi)鋅池區(qū)室化或移動，或影響鋅螯合而干擾鋅和鐵的穩(wěn)態(tài)而抑制真菌生長。

Kaneko等[6]的研究表明，青蒿琥酯可以增強氟康唑?qū)τ坞x白念珠菌的抑制活性。De Cremer等[7]從1 600多種現(xiàn)有藥物中篩選與咪康唑聯(lián)用使對白念珠菌生物膜清除具有協(xié)同作用的藥物，其中篩選出青蒿琥酯與咪康唑具有協(xié)同效應(yīng)，隨后咪康唑分別與青蒿素、雙氫青蒿素及蒿甲醚的檢測也顯示對清除念珠菌生物膜具有協(xié)同作用。

新近研究中，Das等[8]通過研究青蒿素對游離狀態(tài)及生物膜狀態(tài)下7種不同念珠菌的抑制作用、代謝活性、生存能力及氧化應(yīng)激的影響，發(fā)現(xiàn)青蒿素能促進真菌胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累積，對游離狀態(tài)及生物膜狀態(tài)下的念珠菌均有細胞毒性作用。該研究使用了新穎的多參數(shù)評估方法論證后發(fā)現(xiàn)，青蒿素對念珠菌的抑制作用呈劑量依賴性，在抗念珠菌生物膜方面具有潛在作用。

1.2 新生隱球菌

Galal等[1]的研究中，使用了32種青蒿素類藥物對新生隱球菌ATCC 90113采用改良版NCCLS方法進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，脫水雙氫青蒿素對新生隱球菌的抗真菌活性優(yōu)于兩性霉素B，MIC低至0.195 μg/ml。青蒿素衍生物β蒿乙醚和α蒿乙醚對新生隱球菌也具有顯著抑制作用。而青蒿素對新生隱球菌抑制作用不及兩性霉素B，MIC值為50 μg/ml。Slade等[2]也發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素及多種雙氫青蒿素縮醛二聚體抗新生隱球菌ATCC 90113的抑制程度優(yōu)于兩性霉素B，IC50遠低于兩性霉素B。此外，該研究中，青蒿素對新生隱球菌的IC50為0.25 μmol/L，而兩性霉素B對新生隱球菌的IC50為0.78 μmol/L，說明青蒿素對新生隱球菌的抑制作用優(yōu)于兩性霉素B。

最新研究中，Bairwa等[9]通過血紅素傳感器監(jiān)測新生隱球菌胞內(nèi)血紅素水平，證實了青蒿素能降低胞內(nèi)血紅素并抑制新生隱球菌增殖。由于鐵的攝取對于真菌繁殖、毒力至關(guān)重要[10]，而血紅素是新生隱球菌重要的鐵來源[11]，此項新研究結(jié)果推測了青蒿素抑制新生隱球菌的可能機制。

1.3 曲霉

Gautam等[12]發(fā)現(xiàn)，青蒿素對煙曲霉菌株Af 293的MIC50和MIC90分 別 為125和250 μg/ml，效 果 不 佳。Slade等[2]發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素縮醛二聚體和單體對煙曲霉ATCC 90906整體效果也不佳。然而，青蒿素與伊曲康唑聯(lián)用對煙曲霉進行體外抗藥敏試驗時，顯示出了對煙曲霉的協(xié)同作用。為了解青蒿素對煙曲霉的分子作用，Gautam等[12]進一步研究了指數(shù)后期的煙曲霉孢子在MIC50濃度下暴露于青蒿素3 h的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)特征，根據(jù)差異表達，推測氧化磷酸化途徑中的線粒體NADH脫氫酶、細胞壁相關(guān)蛋白和酶、涉及麥角固醇生物合成的基因可能是青蒿素作用的潛在靶點。既往一項基于酵母模型的研究也提示NADH脫氫酶是青蒿素的直接靶標[13]，重要的是，煙曲霉、釀酒酵母和白念珠菌接觸抗真菌藥后并未觀察到與氧化磷酸化途徑有關(guān)的基因顯著改變，這些不同于抗真菌藥的基因表達變化可能是青蒿素與抗真菌藥產(chǎn)生協(xié)同的重要原因。

戴京京等[14]探究鼠肺部感染煙曲霉后，青蒿琥酯對肺組織自噬相關(guān)蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯注射組的肺組織病理切片中的孢子比感染組數(shù)量少且聚集在一起，未長出菌絲，青蒿琥酯組體外分離的真菌孢子的活性明顯受到抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯增強肺部巨噬細胞樹突狀細胞相關(guān)性C型植物血凝素1（den driticcell associated C typelectin-1，Dectin-1）、ROS、微管結(jié)合蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain-3，LC3Ⅱ）的表達，由此得知，青蒿琥酯可通過抑制煙曲霉生長和增強鼠肺巨噬細胞的自噬水平，對抗肺組織煙曲霉感染。隨后，該課題組構(gòu)建蠟螟感染煙曲霉模型，再次驗證青蒿琥酯對自噬相關(guān)蛋白的表達影響，也證實了青蒿琥酯提高了自噬相關(guān)蛋白表達的影響[15]。

Dhingra等[16]通過對黃曲霉、黑曲霉等采用紙片擴散法進行藥敏試驗觀察到，黃曲霉、黑曲霉在5 μg/ml的青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸作用下形成的抑菌圈與暴露于1 000 μg/ml的氟康唑、灰黃霉素下形成的抑菌圈大小相近。Shah等[17]制備青蒿素納米懸液并采用紙片擴散法檢測對黃曲霉、黑曲霉等微生物的作用，研究發(fā)現(xiàn)青蒿素納米懸液對黃曲霉、黑曲霉具有較好抑制活性，MIC分別為0.19 mg/ml、0.33 mg/ml。

1.4 卡氏肺孢子菌

有研究報道，低濃度（0.5 μmol/L）青蒿素即可對卡氏肺孢子菌產(chǎn)生顯著體外抑制作用，且高濃度（100 μmol/L）的青蒿素對貂的上皮樣肺細胞系未觀察到明顯作用，提示其抑制肺孢子菌同時對正常的肺上皮細胞無明顯影響[18]。雙氫青蒿素、青蒿琥酯對卡氏肺孢子菌也有抑制作用[19]，50 μmol/L的雙氫青蒿素對肺孢子菌的抑制率與15 μmol/L的噴他瞇相似[20]。雙氫青蒿素治療大鼠卡氏肺孢子菌肺炎的體內(nèi)研究也顯示有效[21]。研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素和青蒿琥酯分別作用于卡氏肺孢子菌2 h后，表面微絨毛開始脫落變形，隨著作用時間延長，細胞膜上出現(xiàn)大小不等的凹陷性損傷，甚至內(nèi)部結(jié)構(gòu)外露，與噴他脒作用后細胞膜的蜂窩狀空洞結(jié)構(gòu)相似[22]。葉彬等[23]用雙氫青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯治療實驗大鼠肺孢子菌肺炎，并探究治療實驗結(jié)束后鼠肺中卡氏肺孢子菌 5SrRNA基因、線粒體rRNA大亞基基因 、胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因的影響，發(fā)現(xiàn)3種青蒿素衍生物可破壞肺孢子菌胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因，雙氫青蒿素可致 5SrRNA基因、線粒體rRNA大亞基基因序列發(fā)生變異。

1.5 尖孢鐮刀菌

有研究報道，5 μg/ml的青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸作用于尖孢鐮刀菌形成的抑菌圈與暴露于1 000 μg/ml的氟康唑、灰黃霉素下形成的抑菌圈大小相近，其中青蒿素的抑制作用優(yōu)于青蒿乙酸、青蒿酸[16]。Buragohain等[24]合成了9種青蒿素新型氟芳烴衍生物，檢測了青蒿素與這些衍生物對真菌尖孢鐮刀菌的抗真菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青蒿素和4種新合成化合物的抑制率高于70%，另外5種化合物的抑制率高于57%，青蒿素的抑制活性高于新合成的化合物。

1.6 皮膚癬菌

劉碧鳳等[25]觀察到青蒿酯鈉對鐵銹色小孢子菌、絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌有不同程度抑制作用，其中抗鐵銹色小孢子菌顯著，MIC低至0.625 mg/ml。金慧玲等[26]報道，青蒿琥酯對石膏樣小孢子菌、紅色毛癬菌等癬菌的MIC為0.9%～1.2%，隨后用1.5%青蒿琥酯外用對豚鼠體癬模型，實驗組查菌陽性率數(shù)明顯低于對照組。由此推測，青蒿素類藥物或?qū)Χ喾N癬菌有抑制作用。

1.7 釀酒酵母

既往由于缺乏良好的模型研究青蒿素類藥物的作用機制，對青蒿素類的生物學(xué)作用了解甚少且存在爭議。10余年前研究鐵和青蒿素相互作用時偶然發(fā)現(xiàn)釀酒酵母可被青蒿素抑制，隨后一直采用釀酒酵母作為模型探究青蒿素及其衍生物在活細胞中的作用。研究發(fā)現(xiàn)青蒿素、雙氫青蒿素、青蒿酸和青蒿琥酯對釀酒酵母細胞均具有抑制作用，其抑制作用途徑可分為線粒體介導(dǎo)途徑和血紅素介導(dǎo)途徑[27]?；卺劸平偷难芯匡@示，青蒿素能夠使線粒體膜去極化，破壞線粒體的正常功能[28]，其中NADH脫氫酶是青蒿素的直接靶點，青蒿素對線粒體的電子傳遞鏈和隨后局部產(chǎn)生的活性氧損傷起了重要作用[13]。青蒿素類中重要的過氧鍵會因血紅素而斷裂，血紅素降低能明顯增強青蒿素類藥物的抗線粒體作用[27]。

2 結(jié)語

臨床真菌耐藥問題日益嚴峻，而農(nóng)業(yè)中使用抗真菌劑，更加劇了耐藥性的發(fā)展。青蒿素及其衍生物對多種臨床致病真菌具有抗真菌或增效作用，青蒿素類藥物的作用靶點與常規(guī)使用的抗真菌藥有所區(qū)別，如氧化磷酸化、金屬穩(wěn)態(tài)，因而青蒿素類藥物有潛力用于抗真菌治療中。未來基于動物模型的研究將有助于進一步探索其體內(nèi)功效。