機械牽張促進干細胞衍生心肌樣細胞進一步成熟的研究進展

古興旺 周帆 穆軍升

(1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京100069； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心超聲科，北京100039； 3.北京市安貞醫(yī)院心外科，北京100029)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)發(fā)生后，梗死的心肌將逐漸由纖維組織代替，并永久地造成心功能下降，而干細胞由于其多向分化潛能，在組織修復(fù)重生方面有著巨大的潛能。因此，將干細胞療法應(yīng)用于MI來逆轉(zhuǎn)下降的心功能，是一條前景可觀的思路。早期嘗試直接心肌內(nèi)和靜脈內(nèi)注射干細胞等方式有一定療效[1-2]，但其弊端在于過低的干細胞生存率[3]和心肌組織處的低停留率[4]，所以借用心肌補片等心臟組織工程技術(shù)[5]，并結(jié)合一些方式促進其預(yù)先向心肌細胞分化，可在一定程度上應(yīng)對這些問題。在這方面，一般選擇全能干細胞和多能干細胞，如胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)、誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和脂肪干細胞(adipose stem cell，ASCs)等。而由于應(yīng)用ESCs存在的倫理和免疫排斥問題[6-7]，研究方向已轉(zhuǎn)向以多能干細胞為主[8-10]，其中，ASCs分化為心肌細胞的潛能可能要高于BMMSCs[11]。既往已有多種方法可促進干細胞分化為有功能的心肌樣細胞，即干細胞衍生心肌樣細胞(stem cell-derived cardiomyocytes，SCCMs)，然而研究表明，此種心肌細胞主要為幼稚型，其在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面類似于原生心肌細胞發(fā)育的早期階段[12]，很難進一步應(yīng)用于臨床治療MI等疾病。因此，如何提高其成熟度來達到臨床應(yīng)用的要求便成了目前亟待解決的問題。在目前被探索的多種方法中，機械牽張作為心肌細胞受到的主要機械刺激之一，被認為在這方面具有較大的潛能，但以往尚無對機械牽張研究的單獨梳理，現(xiàn)從機械牽張的參數(shù)、機械牽張對SC-CMs成熟的影響和可能存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制等方面對相關(guān)研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 促進SC-MCs成熟的機械牽張參數(shù)

體內(nèi)搏動的心臟不斷受到回心血流充盈心腔所致的前負荷和心臟射血時主要來自主動脈壓的后負荷，機械牽張主要通過模擬正常心肌細胞受到的前負荷來促進SC-CMs的進一步成熟。牽張的施加方式多種多樣，最主要的原理是將工程化組織兩端分別固定在機械臂上，由一端可移動的機械臂控制牽張的幅度和頻率，也有基于磁力和氣壓控制等的牽張力施加設(shè)備[13-14]，由于種類和型號繁多且均能按設(shè)定的參數(shù)施加牽張力，也無不同設(shè)備間區(qū)別的相關(guān)研究，現(xiàn)不展開討論。牽張刺激的參數(shù)可分為牽張軸向、牽張幅度(以細胞被拉長的比例計算)、牽張頻率和牽張時間等。在牽張軸向上，盡管在研究機械牽張促進干細胞分化為SC-CMs時還有雙軸、多軸和等軸等多種方式[15-17]，但在促進SC-CMs進一步成熟時，單軸牽張仍是更主流的選擇[14，18-19]，且少有研究去探索軸向區(qū)別所造成的影響。牽張幅度方面，雖然Gir?o-Silva等[16]發(fā)現(xiàn)12%拉伸度未能誘導(dǎo)人ASCs中心血管標(biāo)志物的表達，間充質(zhì)細胞表面標(biāo)志物(CD29和CD90)也保持不變，但他們說明以前有實驗證明10%甚至以上的牽張幅度可促進ASCs向心肌分化；其他眾多學(xué)者的研究表明，10%左右的牽拉程度可促進SC-CMs在心肌標(biāo)志物和肌節(jié)發(fā)育等方面的成熟[13，15，17，20-21]，Huang等[22]通過對照實驗發(fā)現(xiàn)10%可能為最佳的牽張幅度，這可能與其接近生理狀態(tài)有關(guān)。在牽張頻率方面，Zhang等[21]和Ruan等[23]通過靜態(tài)(0 Hz)和循環(huán)(非0 Hz)牽張的對照實驗，肯定了后者的效果。為模擬正常的心臟搏動，循環(huán)牽張的頻率基本被選定為1 Hz，Huang等[22]進一步指出1 Hz或1.5 Hz的循環(huán)牽張可誘導(dǎo)干細胞表達心肌細胞相關(guān)基因，且1 Hz可能最為合適。另外，Morgan等[24]發(fā)現(xiàn)相比固定的頻率(1 Hz)，動態(tài)變化的牽張頻率對新生小鼠心肌細胞的細胞間偶連有所影響，但收縮功能在兩組間無明顯區(qū)別。牽張時間在大多數(shù)實驗中為1～7 d，也有學(xué)者將其細分至每天有固定的拉伸時間(如0.5 h/d)[19，25]，但和牽張軸向一樣，其和施加全天候牽張力的區(qū)別并未被研究。綜上所述，一組參數(shù)為10%、1 Hz和1～7 d(全天候)的單軸機械牽張可被視作較為通用的選擇。

2 機械牽張對SC-CMs成熟的影響

現(xiàn)今，研究者們已探尋出許多可促進SC-CMs分化成熟的策略，如長程培養(yǎng)、共培養(yǎng)、3D培養(yǎng)和電學(xué)刺激等，機械刺激也是其中重要的一員，主要包括流體剪切力和機械牽張等[26]。機械牽張(模擬前負荷)作為心臟組織接受的主要機械刺激之一，已被多個研究證明可有效促進SC-CMs的發(fā)育和成熟。以下將從結(jié)構(gòu)和功能兩個層面探討機械牽張的影響。

2.1 結(jié)構(gòu)層面

大量研究表明，牽張刺激可從細胞排列、細胞形態(tài)和肌節(jié)發(fā)育等方面誘導(dǎo)SC-MCs的分化成熟。Ruan等[8]的實驗表明，經(jīng)過2周的靜態(tài)牽張培養(yǎng)，組織中的細胞相比無刺激組均表現(xiàn)出更高的有序性，基質(zhì)膠原纖維的排列也更加規(guī)則；Tulloch等[27]則深入地以對準(zhǔn)值為指標(biāo)，定量分析循環(huán)牽張對誘導(dǎo)多能干細胞衍生心肌細胞(iPSC-CMs)和胚胎干細胞衍生心肌細胞(ESC-CMs)組織中細胞排列的影響，與無張力組相比，持續(xù)的靜態(tài)牽張培養(yǎng)和按一定頻率施加張力的循環(huán)牽張培養(yǎng)都成倍增加細胞排列的有序性。有趣的是，機械牽張能引起人ESC-CMs和人心房成纖維細胞在垂直于牽張方向上重新排列[28-29]，而另有實驗發(fā)現(xiàn)對于新生小鼠心肌細胞，其作用結(jié)果卻是平行[30]。此外，在Abilez等[10]的長程培養(yǎng)中，施加牽張的人iPSC-CMs在培養(yǎng)至25～28 d時表現(xiàn)出異質(zhì)的細胞表型，其中心室肌樣細胞占比超過50%。對于肌節(jié)的發(fā)育，多數(shù)研究結(jié)果表明牽張刺激可促進工程組織中細胞的成熟，如更長的長度，更清晰整齊的橫紋等[31-34]；Kroll等[9]設(shè)計了一種能對培養(yǎng)在聚二甲基硅氧烷薄膜上的單層人iPSC-CMs同時施加電學(xué)和機械刺激的設(shè)備，施加機械牽張的組別中肌節(jié)長度卻明顯縮短，推測這也許和其二維培養(yǎng)環(huán)境或施加牽張力前的其他環(huán)節(jié)有關(guān)。

微觀表現(xiàn)上，機械牽張可有效促進SC-CMs心肌標(biāo)志物的表達(包括RNA和蛋白質(zhì)含量)。在眾多實驗[11，20，27，30，32，35-36]中，肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、α-肌動蛋白、N-鈣黏蛋白、連接蛋白43、轉(zhuǎn)錄因子GATA4、轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、心房鈉尿肽和腦鈉肽等重要心肌標(biāo)志物均可被牽張刺激誘導(dǎo)表達，這些蛋白質(zhì)對干細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育具有重要作用；另外一個指標(biāo)是β-肌球蛋白重鏈/α-肌球蛋白重鏈(β-MHC/α-MHC)的比值，其值的升高與心肌細胞的成熟相關(guān)[37]，在相應(yīng)的研究中，α-MHC的含量不一定會下降，但β-MHC的表達量一般會被上調(diào)，且可高達800%[23，32]。

2.2 功能層面

在評價體外心肌細胞的功能時，收縮能力和收縮頻率是主要指標(biāo)，在許多實驗中，細胞對心血管藥物的反應(yīng)性和鈣流動力學(xué)表現(xiàn)也是重要的指標(biāo)。研究表明，機械牽張能顯著提升心肌樣組織的主動收縮力[21]，其收縮力-前負荷關(guān)系也在合適的牽拉范圍內(nèi)符合Frank-Starling定律，且循環(huán)牽張相比靜態(tài)牽張對曲線斜率的提升更加顯著[23]，但機械牽張對細胞自主收縮頻率的影響尚無定論[10，32]。對于一些藥物如異丙腎上腺素和利多卡因，給予牽張培養(yǎng)的細胞能對其作出類似原生心肌細胞的反應(yīng)，表現(xiàn)為收縮力相應(yīng)的增強[38-39]。這些提升可能得益于胞內(nèi)肌節(jié)的發(fā)育以及組織的整齊排列等[30]。在鈣流動力學(xué)方面[9-10，23，32]，較為一致的觀念是牽張刺激可明顯提升鈣瞬變峰值，這也印證了其提升細胞收縮力的作用。另外，通過進一步測量組織的收縮力-頻率曲線(評價心肌興奮收縮偶聯(lián)的一個良好指標(biāo))，發(fā)現(xiàn)機械牽張有助于減弱細胞原本的負相關(guān)關(guān)系，向著正常心肌的正相關(guān)關(guān)系發(fā)展[8]。但在是否可縮短達峰時間、50%復(fù)極時間等問題上，目前仍有爭議。

對于MI的治療，培養(yǎng)心肌樣細胞的目的是保證其在植入受損心臟后能起到足夠的治療作用，達到盡可能恢復(fù)患者心功能的目的。從這個角度說，實驗室中評價SC-CMs是否心肌向分化成熟的最終方式應(yīng)該是體內(nèi)試驗，而目前相關(guān)的研究并不多。在Mihic等[32]的MI小鼠模型實驗中，雖然有無事先經(jīng)受牽張刺激不會影響其心電圖表現(xiàn)，但2D超聲心動圖顯示牽張組的心室前壁厚度明顯增厚，對處死小鼠進行尸檢也可觀察到該組的工程組織與小鼠心臟擁有更好的嵌合度。Abd等[15]發(fā)現(xiàn)向兔MI區(qū)域注入干細胞并養(yǎng)育8周后，與未經(jīng)過牽拉刺激的干細胞組相比，受牽拉組的左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率均明顯改善，定量分析也顯示受牽拉組的MI面積明顯減小。這些實驗一定程度上說明對干細胞進行移植前牽張刺激對于恢復(fù)受損心臟結(jié)構(gòu)和功能的積極影響，但仍需更多的研究證明其真實性和重要性。

3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

如前所述，目前的研究大多停留在探究機械牽張的影響上，內(nèi)在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制尚不明確，有如下兩條研究進展較大。(1)TRPV4/PI3K/Akt信號通路。TRPV4通道是允許Ca2+通過的非選擇性陽離子通道，其活動導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+升高，研究證明，單軸循環(huán)牽張能激活TRPV4通道引起Ca2+內(nèi)流，并激活經(jīng)典的調(diào)控多種細胞生命活動的PI3K/Akt信號通路，最終導(dǎo)致人ESC-CMs在垂直于牽張方向上的重排[29]。類似的，也有研究者發(fā)現(xiàn)對于毛細血管內(nèi)皮細胞，機械牽張可通過TRPV4通道促進其重排，進一步驗證了該通道的作用[40]。深入的實驗表明，激活TRPV4通道引起的Ca2+內(nèi)流只占牽張刺激引起的一部分，也就是說在牽張刺激和Ca2+內(nèi)流之間，還有其他機制起著作用，如TRPV2通道[29]。(2)(miR-27a)/SCF通路。miR-27a參與調(diào)控細胞的多態(tài)性、腫瘤發(fā)生、增殖和凋亡等病理生理過程。Cao等[17]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BMMSCs被施加循環(huán)牽張刺激時，miR-27a的表達有所降低，而過表達它則會下調(diào)GATA4、TNNT2、MEF-2C和連接蛋白43等心臟標(biāo)志物的表達，這意味著miR-27a在機械牽張的條件下抑制了BMMSCs的心肌向分化；同時，作者通過一系列步驟證明SCF基因是miR-27a的作用靶點，轉(zhuǎn)染SCF基因表達的siRNA可下調(diào)心肌標(biāo)志物的表達，且同時轉(zhuǎn)染這些siRNA和miR-27則會進一步增加下調(diào)的幅度。這些結(jié)果綜合說明(miR-27a)/SCF通路在調(diào)控機械牽張對SC-CMs分化成熟的影響，但詳細的內(nèi)容仍需更多的研究加以闡述。

4 問題和展望

綜上所述，機械牽張確實可在細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等方面促進SC-CMs的成熟。但這方面研究存在的一個問題是研究的多樣性，差異巨大的研究設(shè)計和設(shè)備使不同研究之間的可比性很差，相應(yīng)的，在開發(fā)出能滿足大多數(shù)學(xué)者要求的通用牽張施加設(shè)備和細胞培養(yǎng)環(huán)境上仍需更多研究和努力。此外，大多數(shù)研究的對照組僅設(shè)置在了是否施加機械牽張以探究其對SC-CMs成熟的影響，卻缺乏這些細胞與原生心肌細胞的對比，因而無從得知這些衍生心肌細胞的實際分化成熟度，不利于其臨床應(yīng)用。事實上，即便機械牽張能有效促進SC-CMs的成熟，這種程度也遠不及原生心肌細胞[27]，這也不難理解，成熟的心肌細胞是在復(fù)雜的生理環(huán)境下接受各種刺激并經(jīng)過長時間的生長發(fā)育而來的，從理論上來說，單獨模擬生理條件的牽張刺激自然很難在幾天內(nèi)讓SC-CMs接近前者的分化程度。因此，內(nèi)在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制作為重要的啟發(fā)和推進動力就顯得格外重要，但目前也少被深入研究，且體內(nèi)試驗也屈指可數(shù)，更不用說進一步應(yīng)用于臨床。種種跡象均表明這方面的研究尚未成熟。結(jié)合目前的研究狀況，未來研究需重點突破低促成熟效率和低分子機制認知程度，在充分認識內(nèi)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用不同的策略，也許有助于盡早達到理想的效果。