斑馬魚模型的毒理學研究進展及其在法庭科學中的應用前景

李亦凡，程亦斌，田志嶺，劉寧國

1.復旦大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學系，上海 200032；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海200063

斑馬魚是一種原產(chǎn)于南亞河流的小型熱帶魚，因體側(cè)具有像斑馬一樣縱向的暗藍與銀色相間的條紋而得名。斑馬魚作為模式生物的優(yōu)點主要是易于飼養(yǎng)、操作、觀察和分析，研究結(jié)果具有很大參考價值，現(xiàn)已成為發(fā)育生物學、生物遺傳學和分子生物學等研究領域的理想模型，也是進行藥物篩選、疾病研究和生態(tài)環(huán)境評價等的模型生物之一。作為一種理想的動物模型，斑馬魚既可用于行為學觀測，也可觀察器官變化和免疫反應，還可分析毒（藥）物在體內(nèi)吸收、代謝、分布的整個過程，因此其在法醫(yī)毒理學和環(huán)境損害司法鑒定等研究中必有廣闊的應用前景。本文從斑馬魚的生物學特性出發(fā)，總結(jié)斑馬魚模型的毒理學研究進展，展望其在司法鑒定中的應用前景。

1 斑馬魚的生物學特性

在毒理學研究中，斑馬魚是一種非常適合用于觀測外源化學物及其代謝物對生物體損傷作用規(guī)律以及在體內(nèi)代謝分布的脊椎動物模型。斑馬魚具有體積小、發(fā)育快、繁殖力強、哺育周期短的特點，飼養(yǎng)簡便且經(jīng)濟；胚胎透明，對不利生存環(huán)境敏感，易于進行多種實驗處理，便于操作和觀察分析[1]；已知基因組和分子信息豐富，與人類基因組具有高度同源性，生物合成通路與人類相似，故斑馬魚模型研究獲取的結(jié)果與人體檢測數(shù)據(jù)的可融合性高，具有很大的參考價值[2]。因此，斑馬魚成為目前國內(nèi)外學者認可的理想的毒理學動物研究模型。

斑馬魚模型中常作為實驗對象的有胚胎、仔魚和成魚。斑馬魚胚胎由親代產(chǎn)卵得到，用于進行發(fā)育毒性試驗，毒物暴露處理后常以卵凝結(jié)、孵化延遲、形態(tài)畸形等致死、致畸效應作為觀測終點[3]。胚胎孵化96～120 h 后斑馬魚可以自由運動、自主取食，因此該階段多以行為作為評價指標進行毒性試驗[4]。達3 月齡的斑馬魚屬于成魚，體內(nèi)各組織器官和內(nèi)分泌系統(tǒng)已發(fā)育完畢，可進行多種生物標志的觀測，還可以取出體內(nèi)的器官來評價外源物質(zhì)對不同組織器官的影響[5]。

近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和斑馬魚基因組測序的完善，越來越多的轉(zhuǎn)基因系斑馬魚被投入應用。如WHITE 等[6]建立的去除條紋的透明成年魚，此轉(zhuǎn)基因系克服了成年斑馬魚因有條紋而不便于直接觀察的不足，可以裸眼或通過立體顯微鏡觀察成年斑馬魚體內(nèi)組織器官在外源物質(zhì)影響下的改變；BLECHINGER 等[7]建立了可監(jiān)測水環(huán)境中低濃度鎘污染的轉(zhuǎn)基因系，以熱激蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）啟動子為反應元件，驅(qū)動綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的表達，檢測濃度可低至0.2 μmol/L。相較于野生型斑馬魚，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的實驗結(jié)果在靈敏度和特異性方面都有了較大提升，既提高了低濃度范圍的監(jiān)測穩(wěn)定性，又提升了專一物質(zhì)檢測的特異性，同時使實驗器材的設計、操作和后續(xù)數(shù)據(jù)分析更為便利，節(jié)省了人力、物力、時間，也更加注重生態(tài)環(huán)保。

2 斑馬魚的毒理學研究進展

斑馬魚用于毒理學研究的基本模式：第一步，監(jiān)測毒物種類和濃度；第二步，評估斑馬魚的生物學行為并獲得數(shù)據(jù)；第三步，解釋所得現(xiàn)象和數(shù)據(jù)；第四步，證實第三步中的解釋。實現(xiàn)了從生物學行為到分子機制的解釋與證實后，該行為和分子就可以作為終點（endpoint）和生物標志（biomarker）應用于后續(xù)的監(jiān)測，該研究模式是各領域進行研究的基礎思路[8]。

進行斑馬魚模型的實驗設計時，在毒物暴露的斑馬魚發(fā)育階段[9]、暴露持續(xù)時間、暴露途徑[10]、毒物濃度各方面均需針對性設計和選擇，實驗中水環(huán)境的營造即魚類共同的直接暴露介質(zhì)，也有純凈配制溶液或廢水、污水之分[11]，終點和生物標志的范圍也很廣泛，涵蓋外觀、行為、代謝、分子結(jié)構(gòu)等多層次[12]，每一層次又有大量的可觀測指標[13]。例如ZHANG 等[2]在研究手性布洛芬（ibuprofen，IBU）立體選擇性效應的實驗中，將成年斑馬魚分組后，在玻璃魚缸內(nèi)暴露于以丙酮為溶劑、環(huán)境相關質(zhì)量濃度為5 μg/L 的消旋布洛芬（rac-IBU）、左旋布洛芬［R-（-）-IBU］和右旋布洛芬［S-（+）-IBU］中，處理周期為28 d。暴露結(jié)束后取出斑馬魚腦組織，利用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技術(shù)分析腦組織的脂質(zhì)代謝物。實驗的最終目的是建立毒物與機體的交互作用流程圖，從相互作用機制的不同環(huán)節(jié)出發(fā)，獲得所需信息，應用于毒物監(jiān)測、環(huán)境保護、健康治療等領域。再如RAMESH 等[14]在研究有機磷阻燃劑（organophosphorus flame retardant，OPFR）磷酸三苯酯（triphenyl phosphate，TPhP）對水生生物潛在毒性影響的實驗中得出，飼養(yǎng)環(huán)境中的TPhP經(jīng)斑馬魚吸收后，于肝組織進行生物轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)起毒性作用的物質(zhì)是TPhP 及其代謝物磷酸二苯酯（diphenyl phosphate，DPhP），毒性作用的靶器官為腦和肝。在肝毒性方面，TPhP 造成了肝糖原蓄積和能量代謝紊亂。造成糖原蓄積的原因為肝生物代謝產(chǎn)物干擾信號傳遞導致葡萄糖代謝受影響，造成能量代謝紊亂的主要機制為肝組織中線粒體膜功能失調(diào)。在神經(jīng)毒性方面，TPhP 抑制腦組織膽堿酯酶活性，作用機制與TPhP 長期蓄積造成的氧化應激相關。

2.1 急性毒性

急性毒性是指一次或24 h 內(nèi)多次接觸較大劑量外源化學物后機體短期內(nèi)出現(xiàn)的毒性效應。致死效應、發(fā)育毒性、行為異常和生命體征是斑馬魚模型中急性毒性的常用觀測終點，其中生命體征可以通過監(jiān)測呼吸和心率進行觀測。利用斑馬魚研究水草控制劑二甲戊樂靈對非水草水生生物危害的實驗[15]發(fā)現(xiàn)，實時呼吸監(jiān)測可以有效反映農(nóng)藥對斑馬魚胚胎能量代謝的抑制，尤其是其對線粒體電子傳遞鏈復合體Ⅰ和Ⅴ的影響，從而反映其急性毒性。針對污水處理廠排出水的生態(tài)影響的研究[11]證實，幼體斑馬魚的心率監(jiān)測可作為監(jiān)控污水處理廠排出水處理效果的指標。

2.2 慢性毒性

慢性毒性是因長期接觸低濃度外源化學物而逐漸產(chǎn)生的毒性作用，在動物實驗中指在其正常生命周期的大部分時間內(nèi)接觸化學物所引起的健康損害效應。慢性毒性實驗能夠更為真實地模擬環(huán)境中化學物質(zhì)對生物體的毒性作用，研究結(jié)果在環(huán)境污染治理和非事故性損傷鑒定中具有更大的應用價值。

2.2.1 行為學改變

行為學改變作為觀測終點具有可觀測項目多、操作簡便的優(yōu)勢，但行為反應的高度復雜性也使得目前缺乏行為實驗操作和評估的規(guī)范標準，以致對于結(jié)果有效性的評價成為難點。含有草甘膦成分的農(nóng)藥對水環(huán)境生態(tài)影響的實驗[16]結(jié)果顯示，環(huán)境相關質(zhì)量濃度（0.3、3 μg/L）草甘膦的長時間（2 周）接觸可導致成年斑馬魚的探索行為減少、社交行為改變，進一步對斑馬魚的生存產(chǎn)生不利影響。水環(huán)境中地西泮殘余物對斑馬魚行為干擾的研究[17]結(jié)果顯示，將成年斑馬魚暴露于12 μg/L 和120 μg/L（均處在亞致死濃度范圍內(nèi)）的地西泮21 d 后，雌性、雄性斑馬魚的求偶相關實驗行為均受到顯著影響。

2.2.2 致畸效應

在二氧化鈦納米微粒（titanium dioxide nanoparticle，nano-TiO2）神經(jīng)毒性機制的研究[18]中，斑馬魚胚胎對梯度質(zhì)量濃度（0.01、0.1、1.0 mg/L）微粒的暴露結(jié)果顯示，微粒處理會對斑馬魚胚胎運動神經(jīng)元軸突的生長產(chǎn)生不利影響，實時聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）顯示微粒暴露處理影響了神經(jīng)元發(fā)生和軸突生長的相關基因表達，且高濃度微粒可降低斑馬魚仔魚的身長和體質(zhì)量。在斑馬魚胚胎的致畸效應與哺乳動物致畸效應相關性研究[19]中，斑馬魚胚胎對于丙戊酸及其9 種類似物的暴露結(jié)果顯示，其中4 種物質(zhì)的亞致死劑量暴露可導致斑馬魚的小眼和顱面畸形，這與哺乳動物的神經(jīng)管缺陷具有相關性。

2.2.3 內(nèi)分泌干擾毒性

甲狀腺是機體激素調(diào)節(jié)的重要樞紐，下丘腦-垂體-甲狀腺軸（hypothalamic-pituitary-thyroid axis，HPTA）更是維持機體穩(wěn)態(tài)的重要因素?？股赝撩顾兀╫xytetracycline，OTC）的毒性研究[20]證實，環(huán)境濃度OTC 可使成年斑馬魚血漿中三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）水平顯著增高。關于可用于生產(chǎn)塑料杯的雙酚芴對HPTA 影響的研究[21]結(jié)果顯示，雙酚芴可通過影響HPTA 相關基因的表達從而影響甲狀腺激素水平。

2.2.4 神經(jīng)毒性

神經(jīng)毒性的產(chǎn)生可由神經(jīng)元受損或神經(jīng)傳導通路中任一環(huán)節(jié)的異常導致。LAM 等[1]將斑馬魚胚胎暴露于800 μmol/L 的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP），2 d 后對斑馬魚進行腦組織原位雜交檢測，發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎對MPTP 的暴露會特異性損傷多巴胺能神經(jīng)元。馬兜鈴酸的神經(jīng)毒性實驗[22]結(jié)果顯示，斑馬魚胚胎持續(xù)暴露于非致畸濃度（≤4 μmol/L）的馬兜鈴酸可導致幼體斑馬魚視覺感受相關基因表達受損。在三丁基錫對魚類焦慮行為的干擾及其可能機制的研究[23]中，成年雄性斑馬魚暴露于100、500 ng/L 三丁基錫28 d 后，水箱行為測試結(jié)果顯示三丁基錫的處理提高了斑馬魚的焦慮感，該研究指出這可能與血漿皮質(zhì)醇濃度的提高，5-羥色胺、多巴胺、γ-氨基丁酸神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)中與遞質(zhì)的合成和活化有關的基因表達下調(diào)有關。

3 斑馬魚在法庭科學研究中的應用前景

法庭科學是利用不同領域的基礎研究成果進行鑒定的應用科學，主要目的在于通過識別、評估、追蹤和溯源為偵察提供線索或為審判提供依據(jù)，為法庭證據(jù)科學化服務。斑馬魚模型在基礎科學、環(huán)境科學和毒理學研究中已有大量應用，作為一種成熟、高效、便捷的毒理學研究模型，隨著各項研究的開展和深入，斑馬魚模型未來在法庭科學中必然有廣泛的應用前景。

3.1 環(huán)境損害司法鑒定

環(huán)境損害司法鑒定是一門新興的司法鑒定門類，雖然大多數(shù)技術(shù)可以直接借鑒環(huán)境科學的研究方法和成果，但作為法庭證據(jù)，必然在法律意義上更為嚴謹。當前，斑馬魚模型水環(huán)境毒理學研究成果在環(huán)境污染事件監(jiān)測、追蹤以及對污染區(qū)域動植物、人群健康評估方面，可提供科學數(shù)據(jù)支撐。

3.1.1 水環(huán)境重金屬元素的毒理研究

重金屬污染物的常見類別有金屬單質(zhì)（如鋁、硒、碲）、氧化物（如二氧化鈦）、甲基化物（如甲基汞）、納米微粒［如銀納米微粒（silver nanoparticle，AgNP）］。利用金屬反應元件（metal response element，MRE）等反應元件驅(qū)動報告基因（如熒光蛋白）的表達，監(jiān)測金屬污染物，再利用終點和生物標志如生命體征、微量元素的組織分布、氧化反應或降解反應相關酶的表達等[24]，分析污染物的作用通路，并通過反應元件的創(chuàng)新、融合、最優(yōu)重復次數(shù)嘗試等，提高監(jiān)測的效率和特異性。

在AgNP 對于水生生物的全身性毒性研究中，MARINHO 等[25]將成年斑馬魚分別暴露于1、3、5 μg/L的AgNP 處理96 h 后，獲取器官，分析不同質(zhì)量濃度AgNP 對斑馬魚腦、肌肉、鰓、肝組織的毒性。結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度暴露均使得腦和肌肉組織中膽堿酯酶活性顯著降低，肝和鰓組織中的過氧化氫酶活性顯著降低，鰓中過氧化氫酶活性是AgNP 檢測的最佳生物標志。ZHAO 等[26]在探究16 種稀土元素（rare earth element，REE）對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的實驗中，利用轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)分析暴露于與受污染較嚴重地區(qū)的水環(huán)境鑭和鐠殘余量相當質(zhì)量濃度（1.1～10 mg/L）的斑馬魚，結(jié)果顯示兩者具有相似的作用機制，如5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)信號通路受干擾，心臟組織DNA 受損和凋亡活動增加，心肌肥大，心肌收縮功能受損，進而影響胚胎心血管形態(tài)以及出現(xiàn)運動行為、心臟生理異常等。

3.1.2 水環(huán)境有機污染物的毒理研究

有機污染物的常見類別有內(nèi)分泌干擾物（endocrine disruptor，EDC）、芳香烴類污染物、手性有機物、阻燃劑（flame retardant，F(xiàn)R）、抗生素、農(nóng)藥、藥品和個人護理用品（pharmaceutical and personal care product，PPCP）、商業(yè)合成物等。這些合成有機物的廣泛使用和不當處理使其在水環(huán)境污染監(jiān)測中被檢測到的頻率逐漸提高。如果有機污染物能夠被生物吸收且不易在生物體內(nèi)代謝分解，就會造成污染物在生物體內(nèi)蓄積并沿著食物鏈富集。因此，提高水環(huán)境污染檢測的敏感性，了解污染物對生物體的毒性作用機制，對于污染監(jiān)測和損傷鑒定都具有重要意義[27]。利用各種類型的敏感反應元件，監(jiān)測有機污染物，進行分離后可分析其作用通路。有機污染物的常見作用方式是干擾機體內(nèi)源激素代謝，可導致出生缺陷、發(fā)育異常、行為異常、代謝紊亂、生存障礙、繁殖問題等[28]。

REN 等[29]將成年斑馬魚暴露于阻燃劑（磷酸三甲苯酯、磷酸甲苯二苯酯）和殺蟲劑（氯氰菊酯、“滅多蟲”）中處理15 d，暴露濃度均為5 μL/L 和25 μL/L，暴露期間定量監(jiān)測斑馬魚的運動活力和生物節(jié)律，以研究斑馬魚對不同環(huán)境的適應性。結(jié)果顯示，實驗中的有機污染物處理均使斑馬魚運動行為受損，生物節(jié)律幾乎無影響，濃度越高運動受損越嚴重，阻燃劑和殺蟲劑的損傷效果相似。WU 等[30]對nmol/L 水平濃度雌酮和雙酚A 進行長期［0～5 dpf（days post fertilization，受精后天數(shù)）］、短期［4～5 dpf］暴露的毒理學影響研究結(jié)果顯示，長期暴露于雌酮會降低斑馬魚的運動行為活躍性，長、短期暴露于雙酚A 導致的骨骼異常、運動行為改變和轉(zhuǎn)錄組反應均較雌酮更為顯著，短期暴露于濃度大于100 nmol/L 的雙酚A 中即可影響神經(jīng)疾病相關的雌激素基因的表達。

3.2 法醫(yī)毒理學

3.2.1 藥物濫用或吸毒的毒理學研究

藥物濫用或吸毒的毒理學研究目的是了解高濃度或低濃度多次給予藥物或毒品在機體內(nèi)的代謝和轉(zhuǎn)化，以建立物質(zhì)的體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化途徑模型，研究結(jié)果除了可以應用于司法鑒定外，還有助于分析藥物或毒品對機體的影響，尋找解決濫用和成癮問題的有效物質(zhì)或與濫用和成癮物具有相似效果的替代物[31]。

針對常見濫用藥物尼古丁對神經(jīng)和生理長期影響的研究[31]發(fā)現(xiàn)，斑馬魚模型中的焦慮、記憶、社交行為及其相關分子機制均可作為評估尼古丁作用效果的指標。新型合成鎮(zhèn)痛藥物選擇性阿片受體激動劑U-47700（3，4-dichloro-N-[2-（dimethylamino）cyclohexyl]-N-methylbenzamide）的濫用可導致興奮、呼吸抑制等神經(jīng)毒性，嚴重者可致死。利用斑馬魚進行U-47700 的精神藥理學和毒理學研究[32]中，檢測其對成年斑馬魚的急性（1、5、10、25、50 mg/L，處理20 min）和慢性（0.1、0.5、1 mg/L，處理14 d）影響。結(jié)果顯示，U-47700 可透過血腦屏障，對斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，其表現(xiàn)因劑量和處理手段不同而異，急性處理產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)靜效應，慢性處理產(chǎn)生快速移動增加和焦慮樣行為。

3.2.2 毒理學研究成果在司法鑒定中的應用前景

在司法鑒定中，可通過斑馬魚毒理學實驗模型獲取代謝機制數(shù)據(jù)，然后建立開放更新的代謝機制標準化數(shù)據(jù)庫，再將司法鑒定中檢測的人體數(shù)據(jù)與之關聯(lián)，從而達到獲取更為客觀準確的法庭證據(jù)的目的。具體方法如下：

（1）建立標準化代謝通路數(shù)據(jù)庫，如經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）于2016 年建立的有害結(jié)局路徑知識庫（Adverse Outcome Pathway Knowledge Base，AOP-KB）[8，33]、BOUé 等于2015 年建立的因果關系生物網(wǎng)絡（Causal Biological Network，CBN）數(shù)據(jù)庫[8，34]。（2）從知識推動型思維出發(fā)，建立可以從物質(zhì)結(jié)構(gòu)推斷其作用的模式框架[35]，如BURGOON 等于2020 年建立的貝葉斯網(wǎng)絡（Bayesian networks）[8，36]、MARTIN等于2014 年建立的因果模型（causal modeling）[8，37]。（3）根據(jù)這些標準數(shù)據(jù)信息即可進行司法鑒定，具體思路為：①應用毒理學研究建立的實驗模型，在環(huán)境損害司法鑒定中根據(jù)實際鑒定需求進行檢測，得到數(shù)據(jù)的支持；②探索斑馬魚實驗模型數(shù)據(jù)和人體檢測數(shù)據(jù)融合的途徑，將毒理學研究所得的數(shù)據(jù)應用于人體相關鑒定。

4 展 望

斑馬魚的毒理學研究不斷推進，實驗技術(shù)不斷發(fā)展，其毒理學研究成果可以應用于生態(tài)領域進行環(huán)境保護，應用于醫(yī)藥領域促進人類健康發(fā)展。同時，可將斑馬魚毒理學研究引入法醫(yī)學領域，應用于法庭科學中的環(huán)境損害鑒定、中毒鑒定、藥物濫用鑒定。斑馬魚模型在法庭科學的應用研究，可以通過先建立斑馬魚模型，研究毒物的特定毒性機制，然后將斑馬魚實驗結(jié)果與人體檢測結(jié)果、法醫(yī)病理學結(jié)果相結(jié)合，探索斑馬魚實驗模型數(shù)據(jù)和人體檢測數(shù)據(jù)融合的途徑，實現(xiàn)斑馬魚模型在環(huán)境科學中的毒理學研究成果向法庭科學應用的轉(zhuǎn)化，探索毒（藥）物引起人身損害的識別、評估和追蹤方法，創(chuàng)新司法鑒定方法和工作模式。