MicroRNA 在皮膚損傷時間推斷中的應(yīng)用前景

程劍，索朧朧，王林林，趙銳，官大威

1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理教研室，遼寧 沈陽 110122；2.長沙市公安局刑事偵查支隊，湖南 長沙 430100；3.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院司法鑒定中心，山東 濰坊261000

損傷時間推斷是法醫(yī)學(xué)實踐的重要工作之一和研究熱點，對限定犯罪時間、劃定嫌疑人范圍、判斷損傷順序以及分析案件性質(zhì)等具有重要作用[1-2]，可為案件偵破、司法審判、民事賠償?shù)忍峁┛茖W(xué)依據(jù)。鑒定實踐中，損傷時間推斷會受到多種因素干擾，包括損傷部位、損傷方式、年齡、營養(yǎng)狀況、既往病史、用藥情況、死后變化等[1，3]，各種干擾因素相互作用，給準確推斷損傷時間帶來了極大的影響[4-5]。

皮膚是人體最大的器官，約占人體質(zhì)量的15%。皮膚組織作為人體抵御外界刺激的第一道屏障，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能眾多，由于其直接暴露于外界環(huán)境中，是人體最易受損的器官，所以國內(nèi)外對損傷時間推斷的研究也始于皮膚組織損傷[2]。皮膚損傷愈合過程通?？煞譃檠装Y期、增殖期和重塑期[6-8]，三期相互重疊，大量細胞及細胞因子參與調(diào)控，形成了一個復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)[1]。

法醫(yī)學(xué)實踐中用于皮膚損傷時間推斷的尸體檢材多已發(fā)生不同程度死后變化，包括組織自溶甚至腐敗等，而現(xiàn)階段用于皮膚損傷時間推斷的技術(shù)方法主要基于檢驗皮膚損傷后的形態(tài)學(xué)變化、mRNA 及蛋白質(zhì)等生物大分子含量的變化，這些指標易受死后變化的影響。微RNA（microRNA，miRNA）因其具有片段小、性質(zhì)穩(wěn)定、耐受死后變化影響等特性，有望成為皮膚損傷時間推斷的新生物學(xué)指標。

1 miRNA 的發(fā)現(xiàn)及生物學(xué)功能

1.1 miRNA 的發(fā)現(xiàn)

1993 年，LEE 等[9]發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲中一種名為lin-4的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種短序列非編碼RNA，并能夠與lin-14mRNA 的3′非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）互補配對，顯著降低LIN-14 蛋白含量，促進線蟲從第一幼蟲期細胞分裂到第二幼蟲期細胞分裂，但對lin-14mRNA 含量沒有影響。當時，這種現(xiàn)象并未引起生物學(xué)界的重視。直到2000 年，REINHART 等[10]發(fā)現(xiàn)由21 個核糖核苷酸構(gòu)成的let-7也能夠調(diào)控秀麗隱桿線蟲發(fā)育，學(xué)者們才意識到這可能是生物界廣泛存在的一種基因調(diào)節(jié)機制，而這種短序列非編碼RNA 也被命名為miRNA。

1.2 miRNA 的生物學(xué)功能

miRNA 作為內(nèi)源性非編碼RNA，長度為20～24 個核苷酸，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA 在基因中大多以單拷貝、多拷貝或基因簇的方式存在于基因組中[11]，miRNA 5′端由2～8 個堿基組成miRNA 的種子序列，對靶基因mRNA 的識別至關(guān)重要[12]。miRNA 經(jīng)典的作用方式是與靶基因mRNA 的3′-UTR 互補配對，切割降解或（和）抑制mRNA 翻譯：與靶基因完全互補，切割降解mRNA；與靶基因mRNA 不完全互補，則抑制其翻譯[13]。有報道[14-15]指出，miRNA 也能夠與5′-UTR 和編碼序列（coding sequences，CDS）結(jié)合，與5′-UTR結(jié)合能夠促進mRNA的翻譯[14]，而與CDS 區(qū)結(jié)合則能抑制mRNA 的翻譯[15]。在植物中miRNA 與mRNA 傾向于完全互補配對，使mRNA 降解；在動物中則幾乎均是不完全互補配對，抑制mRNA 翻譯[16]。但研究[17]結(jié)果顯示，動物中也有近乎完全互補配對切割mRNA 的情況。如在人類，miR-196 能夠與HOXB8近乎完美地互補配對，切割HOXB8的mRNA。miRNA發(fā)揮其生物功能主要定位于細胞質(zhì)，但某些miRNA在胞質(zhì)中加工成熟后也可以進入細胞核內(nèi)發(fā)揮作用[18]。最新發(fā)布的miRBase v22 數(shù)據(jù)庫（https://www.mirbase.org/）收錄了271 個物種38 589 個前體miRNA，這些前體miRNA 能產(chǎn)生48 860 個不同的成熟miRNA序列，其中脊椎動物基因組包含了數(shù)千個miRNA[19]，這些miRNA 幾乎參與了所有的細胞生物學(xué)過程，對動物的生長發(fā)育，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，細胞的增殖、分化、遷移、凋亡等過程起著重要的調(diào)控作用[20-21]。

2 皮膚損傷修復(fù)各階段特定miRNA 的生物學(xué)調(diào)控作用

皮膚損傷后，炎癥期血管內(nèi)皮細胞受損，啟動內(nèi)源性凝血系統(tǒng)和外源性凝血系統(tǒng)，血小板凝聚形成血小板栓，繼而纖維蛋白基質(zhì)形成，充當損傷修復(fù)的骨架[8]，釋放一系列炎癥介質(zhì)，趨化炎癥細胞、增強炎癥細胞功能、促進再上皮化和血管新生[22]。炎癥細胞殺傷和降解病原體物質(zhì)，吞噬清除壞死組織及變性的中性粒細胞，并分泌細胞因子和生長因子，促進結(jié)締組織、內(nèi)皮和上皮組織增生[23]。增殖期，促進纖維組織增生、血管新生、創(chuàng)面收縮和表皮再生[23-24]以及角質(zhì)形成細胞增殖并向創(chuàng)面遷移[22，25-28]。通過調(diào)控成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細胞，產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)，為血管內(nèi)皮細胞生芽形成毛細血管提供框架，通過肌成纖維收縮、牽拉縮小創(chuàng)口[8，29]。重塑期，損傷區(qū)膠原纖維重新排列，形成規(guī)則、堅固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，毛細血管閉塞、數(shù)量減少，成纖維細胞的細胞核變細長、致密化，細胞數(shù)量通過凋亡的方式減少[30]，最終形成主要由膠原纖維、細胞基質(zhì)蛋白等構(gòu)成的瘢痕組織。

研究[31]表明，炎癥期某些miRNA 表達水平的變化會影響血小板的功能，并調(diào)控纖維蛋白原、組織因子和凝血因子Ⅺ表達。miR-146a 和miR-155 可以促進單核細胞分化為巨噬細胞[32]，miR-146a 還可抑制角質(zhì)形成細胞內(nèi)的過度炎癥反應(yīng)[33]。增殖期，miR-31 能促進角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移[34]，miR-210 抑制角質(zhì)形成細胞的增殖并促進血管的生成[35-36]。重塑期，miR-29a 通過靶向轉(zhuǎn)化生長因子-β 活化激酶1 結(jié)合蛋白1（transforming growth factor-β activated kinase 1 binding protein 1，TAB1）來調(diào)控真皮成纖維細胞的收縮功能[37]。miR-96 通過靶向調(diào)控Smad7 促進膠原蛋白沉積[38]。以上研究表明，不同miRNA 在皮膚損傷愈合不同階段發(fā)揮著相應(yīng)功能，協(xié)同調(diào)控皮膚損傷修復(fù)。這些miRNA 出現(xiàn)的時間及表達量具有一定的時程規(guī)律，有望成為推斷皮膚損傷時間的生物學(xué)指標。

3 miRNA 作為損傷時間推斷生物學(xué)指標的優(yōu)勢

3.1 半衰期長、穩(wěn)定性好

miRNA 相對穩(wěn)定。通過RNA 聚合酶Ⅱ抑制劑或者耗竭miRNA 合成酶的方式進行研究的結(jié)果顯示，miRNA 在肝細胞、心肌細胞中的半衰期能達到數(shù)小時甚至數(shù)天[39-40]。BALZANO 等[41]比較了新鮮血漿樣品中miRNA的含量與-80 ℃凍存不同時間后的miRNA含量，-80 ℃凍存時長分為6 個月、12 個月、3 年、4 年、10 年、11 年和14 年，發(fā)現(xiàn)4 年內(nèi)miRNA 水平?jīng)]有明顯變化，大部分miRNA 從第5 年開始下降，個別miRNA（miR-212-3p）經(jīng)凍存14年后其含量亦未下降。MALL等[42]將來自8 名健康成人（4 男4 女，25～57 歲）的中段清潔尿液，采取室溫放置、4 ℃放置以及-80 ℃至室溫反復(fù)凍融處理，發(fā)現(xiàn)：室溫放置5 d 后，miRNA 實際含量為初始含量的35%；4 ℃放置5 d 后，miRNA 實際含量為初始含量的42%～56%；-80 ℃至室溫凍融10 次后，miRNA 含量仍相當于初始量的23%～37%。經(jīng)以上3 種方式處理后仍能滿足實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）的檢測要求。最新研究結(jié)果[43]還顯示，在經(jīng)歷了5 300 年冷凍保存的木乃伊多種組織中仍可檢測出特定的miRNA。

3.2 物種間保守，功能調(diào)節(jié)作用相似

動物miRNA 在進化過程中體現(xiàn)了高度的保守性。如秀麗隱桿線蟲中62%的miRNA 與果蠅相關(guān)，55%的miRNA 與果蠅或人類miRNA 具有同源性，并且這些同源數(shù)值還會隨著新發(fā)現(xiàn)的miRNA 數(shù)量的增加而增加[44]。miRNA 在物種間廣泛存在的保守性提示其在某些特定的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，如miR-21-3p 在人和小鼠中均具有促進皮膚損傷愈合的作用[45-46]，let-7miRNA 在人和鼠中均可抑制原癌基因的表達[47-48]。

3.3 耐受物理化學(xué)不良因素及死后變化

miRNA 性質(zhì)穩(wěn)定，可耐受甲醛和石蠟等組織固定、包埋等過程中的不良因素作用。NELSON等[49]應(yīng)用原位雜交技術(shù)成功檢測出腦組織石蠟切片中的多種miRNA。XI 等[50]通過比較小鼠新鮮和石蠟包埋肝組織中miRNA 表達量，并檢測最長保存了10 年的經(jīng)甲醛固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）的結(jié)直腸癌樣品中的miRNA表達量，發(fā)現(xiàn)FFPE樣品中miRNA 的表達量與新鮮凍存樣品中miRNA 的表達量具有很好的相關(guān)性，甲醛固定對miRNA 的穩(wěn)定性沒有顯著影響，保存了10 年的FFPE 樣本中miRNA的表達也相當穩(wěn)定。在（10±1）℃～（35±1）℃環(huán)境中，腦組織特異性miRNA（miR-9 和miR-125b）能在死后144 h 內(nèi)保持其自身含量不受死后變化的影響[51]。

3.4 miRNA 調(diào)節(jié)模式精密

miRNA 所調(diào)節(jié)的靶基因廣泛，一個miRNA 可以調(diào)控多個靶基因，一個靶基因也可以受到多個miRNA調(diào)控[52]，形成了異常復(fù)雜的調(diào)控系。據(jù)估算，動物中有20%～30%的基因受miRNA 調(diào)節(jié)，因此普遍認為miRNA 是“微調(diào)器”，主要作用是維持全部表達基因的穩(wěn)態(tài)[53-54]。miRNA 在正常生理條件下調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)作用相對“溫和”，而當組織損傷時其作用相對“劇烈”[55]，如：DNA 受損可激活轉(zhuǎn)錄因子包括p53、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等，上調(diào)或下調(diào)特定miRNA的表達[56]；在炎癥過程中，巨噬細胞對感染的炎癥反應(yīng)涉及多種miRNA 的上調(diào)，如miR-155、miR-146、miR-147、miR-21 及miR-9 等[57]。

4 miRNA 用于損傷時間推斷的研究現(xiàn)狀及局限性

CHANG 等[58]使用活檢穿孔器在20 名健康志愿者的腹部行全層皮膚切口，通過實時qPCR 檢測分析miR-126 在皮膚損傷后的變化情況，發(fā)現(xiàn)miR-126 表達在皮膚損傷后1 d 和7 d 均顯著增加，呈上升趨勢，與損傷時間具有良好的相關(guān)性，且損傷7 d時miR-126表達量為正常皮膚中的4 倍。LI 等[59]應(yīng)用miRNA 微陣列芯片技術(shù)對人體皮膚損傷后6 個月的皮膚瘢痕組織中的多種miRNA 表達情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)與正常皮膚組織中的相應(yīng)miRNA 含量進行對比，瘢痕組織中的miR-149-5p、miR-203a、miR-222-3p、miR-122-5p 含量顯著降低。WANG 等[60]在小鼠皮膚切創(chuàng)研究中發(fā)現(xiàn)，miR-21 的表達量在傷后1、3、7 d 持續(xù)上調(diào)，具有良好的時間相關(guān)性。彭濤等[61]應(yīng)用芯片技術(shù)篩選新生大鼠腦皮質(zhì)缺氧缺血損傷后差異表達miRNA，發(fā)現(xiàn)27 個miRNA表達上調(diào)超過2倍，60 個miRNA下調(diào)超過2倍，并選取9個miRNA通過實時qPCR 技術(shù)驗證了miRNA 的芯片檢測結(jié)果，提示腦組織損傷后多種miRNA的表達量發(fā)生了改變。SUN等[62]發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦損傷1、3、5 d 后，大鼠海馬組織中有17 種miRNA 表達量在各時間點均有顯著性變化，具有良好的時間相關(guān)性。上述研究表明，腦組織損傷后miRNA 表達量可發(fā)生變化，且與損傷時間具有相關(guān)性，miRNA 也可能成為除皮膚組織外其他器官組織損傷時間推斷的生物學(xué)指標。

盡管現(xiàn)有研究結(jié)果顯示組織器官損傷后miRNA的表達量變化具有良好的時間相關(guān)性，為法醫(yī)學(xué)損傷時間推斷研究提供了新的生物學(xué)指標和研究思路，但現(xiàn)階段采用miRNA 差異表達進行損傷時間推斷的研究尚處于起步階段，相關(guān)研究較少，多為采用miRNA微陣列或二代測序技術(shù)通過動物實驗篩選差異表達miRNA，繼之通過實時qPCR 技術(shù)靶向驗證及定量檢測相應(yīng)損傷時間點的miRNA 表達，探討miRNA 表達與損傷時間的相關(guān)性，還缺乏人體樣本驗證及損傷時間推斷相關(guān)數(shù)學(xué)模型的建立。同時，miRNA 用于損傷時間推斷還存在其他方面的問題。如小鼠皮膚損傷修復(fù)過程中，8 周齡和2 年齡小鼠中有37 種miRNA表達趨勢相反[63]，表明在不同年齡段皮膚損傷愈合過程中miRNA 表達譜并不完全相同，存在年齡段差異。不同組織器官中耐受死后變化影響的miRNA 也不盡相同，需要考慮miRNA 內(nèi)參基因的選擇，如小鼠心肌組織中耐受死后變化最強的是miR-122和miR-133a，肝組織中是miR-122，骨骼肌中是miR-133a[64]，而大鼠脾組織中miR-125b 和miR-143 則對死后變化表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性[65]。另外，雖然實時qPCR 因其靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢已成為核酸定量檢測的主流技術(shù)，但目前尚缺乏標準化和規(guī)范化的檢驗策略[66]。miRNA還具有組織特異性，不同組織的miRNA 表達譜并不相同[67-69]，檢測不同組織器官miRNA 時的內(nèi)參基因也可能不同。這些因素均需要在損傷時間推斷研究或應(yīng)用中進一步探討。

5 展 望

綜上所述，多種miRNA 在皮膚損傷修復(fù)的不同階段規(guī)律性表達，與損傷時間具有良好相關(guān)性，其相關(guān)特性也為解決損傷時間推斷受死后變化影響的問題提供了可行性。同時，miRNA 與mRNA、蛋白之間具有一對多和多對一的調(diào)控機制，在同一損傷時間段可以檢測更多的生物學(xué)檢測指標，為提高損傷時間推斷的準確性提供了技術(shù)方案。此外，在皮膚受到損傷的最初幾分鐘或幾小時內(nèi)，常規(guī)的組織學(xué)檢測結(jié)果可能不能鑒別損傷是生前還是死后造成的[70]，而miRNA序列短，結(jié)構(gòu)簡單，不需要經(jīng)過炎癥因子等蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾的過程，在皮膚損傷早期即可檢測到與止血、炎癥相關(guān)的miRNA 表達量的變化，有助于判斷生前傷與死后傷。通過對miRNA 在皮膚損傷時間推斷的深入研究，結(jié)合其他生物學(xué)指標檢測，將有助于提高損傷時間推斷的準確性。