循環(huán)生物標(biāo)志物在直腸癌新輔助放化療療效預(yù)測中的應(yīng)用

周小妹 羅波 梁新軍

直腸癌是世界上致死率較高的四大腫瘤之一［1］，目前直腸惡性腫瘤有效的治療手段之一是新輔助放化療。在局部進展期直腸癌（locally advanced rectal cancer，LARC）中，美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）認(rèn)為新輔助治療能導(dǎo)致約21.1%患者達(dá)到病理完全緩解（pCR）。先前研究顯示評估pCR的標(biāo)準(zhǔn)方法是對組織學(xué)標(biāo)本的檢查，并且進一步觀察到達(dá)到病理緩解的患者有腫瘤組織的消退；但是臨床反應(yīng)并不總是與組織學(xué)變化有關(guān)，可能也與循環(huán)中的標(biāo)記物有關(guān)；所以需要進一步的對循環(huán)中的預(yù)測性生物標(biāo)志物進行研究，由于循環(huán)標(biāo)志物在癌癥治療中的影響越來越大，并且為預(yù)測患者是否對新輔助治療有無應(yīng)答提供了依據(jù)。因此本文對預(yù)測性循環(huán)生物標(biāo)志物在直腸癌新輔助治療中的應(yīng)用進行了總結(jié)。

一、循環(huán)腫瘤細(xì)胞

離開原發(fā)腫瘤部位，通過血管和淋巴系統(tǒng)在血液中傳播，并導(dǎo)致遠(yuǎn)處繼發(fā)性腫瘤形成的上皮細(xì)胞被定義為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells， CTCs）［2-3］。CTCs轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大多數(shù)腫瘤治療失敗的主要原因，并且外周血中CTCs又被認(rèn)為是導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的主要原因。所以對外周血中CTCs精準(zhǔn)的檢測和分析對研究出有效的治療方法至關(guān)重要。但是在大多數(shù)腫瘤患者的外周血中CTCs的濃度并不是很高，一般維持在1～10個細(xì)胞/10 mL之間，這使得CTCs的研究更具有挑戰(zhàn)。盡管如此CTCs仍被廣泛地應(yīng)用于各種惡性腫瘤的研究中。目前CTCs主要被用于部分疾病的預(yù)后判斷和治療方案的參考，比如轉(zhuǎn)移性前列腺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌［4-6］。CTCs正成為新型抗癌治療和療效評估的有效預(yù)后因子［7］。

通過細(xì)胞搜索系統(tǒng)的方法，Magni等［8］檢測并計算了85例LARC患者中的16例（18.8%）在nCRT之前的CTCs數(shù)，中位數(shù)為1個細(xì)胞/7.5 mL，范圍為1～27個細(xì)胞/7.5 mL。盡管術(shù)前CTCs的數(shù)量與患者的臨床或病理特征無統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性，但在連續(xù)的時間點上，CTCs計數(shù)顯著下降：術(shù)前24小時的CTCs計數(shù)為7.5%，術(shù)后6個月的CTCs計數(shù)為4.8%（分別為P=0.021和P=0.047）。幾乎63%的LARC患者對治療有病理上的完全或部分反應(yīng)，他們在nCRT前和手術(shù)前的CTCs計數(shù)與CTCs數(shù)量的減少有顯著的相關(guān)性（P=0.02）。

Sun等［9-10］通過微流控設(shè)備的技術(shù)［11］，對LARC患者在nCRT前后血液樣本中的CTCs進行了計數(shù)。nCRT前CTCs水平明顯高于nCRT后（兩項研究均P＜0.001）。根據(jù)Dworak TRG評分，在對有反應(yīng)和無反應(yīng)的患者進行分層后，在無反應(yīng)組中，nCRT后CTCs計數(shù)和nCRT前后CTCs水平的百分比差異（定義為?%CTC）均有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)ROC曲線，?%CTC值在第1次和第2次研究中正確分類的準(zhǔn)確率分別為80.6%和86.0%。

最近，Troncarelli等［12］通過評估胸苷酸合酶（TYMS）和紫外線切除修復(fù)蛋白RAD23同源物B（RAD23B）的預(yù)測價值進一步探索了CTCs在直腸癌患者接受nCRT后的作用。這項研究結(jié)果顯示，CTCs中的TYMS mRNA和RAD23B蛋白的表達(dá)可能預(yù)測nCRT的無應(yīng)答反應(yīng)，并避免對在新輔助治療后能達(dá)到pCR的LARC患者進行根治性手術(shù)治療。

二、循環(huán)腫瘤DNA

在癌癥中檢測到的由腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死后釋放到血管中的DNA為循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。ctDNA是長度約為60～110 bp固定的幾個DNA片段，它主要以核小體的形式釋放入血。血流中的ctDNA可以反映腫瘤細(xì)胞的分子變化，如突變［13］、甲基化特征［14］和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性［15］。

Sun等［16］觀察了34例LARC患者和10例健康人血漿中的ctDNA水平，發(fā)現(xiàn)LARC患者血漿ctDNA水平明顯高于健康人。新輔助治療后LARC患者的血漿ctDNA水平下降。緩解者在接受nCRT治療后不僅代表非凋亡（或可能是腫瘤）的ctDNA的較長片段降低了，而且代表總ctDNA的較小片段中較長片段的比例也降低了。這些發(fā)現(xiàn)與之前報告的結(jié)果一致［17］。這表明ctDNA水平的降低可能是放化療誘導(dǎo)腫瘤消退的結(jié)果。此外，在治療后血漿ctDNA上的KRAS基因第12位密碼子突變頻率顯著降低，緩解者（治療前：66.7%，治療后：10.0%，P＜0.001）和無緩解者（治療前：83.3%，治療后：16.7%，P=0.01）均顯著降低。相反，在nCRT前，緩解者的MGMT基因啟動子甲基化水平顯著高于無緩解者（分別為88.9%和50%，P=0.04）。

循環(huán)腫瘤特異性DNA甲基化雖然和腫瘤性疾病的預(yù)后及疾病狀態(tài)有一定關(guān)系，但是MGMT和直腸癌之間的關(guān)系一直存在爭議。Sideris等［18］表明，MGMT表達(dá)狀態(tài)和直腸癌新輔助治療的預(yù)后之間沒有聯(lián)系，然而Shalaby等［19］又證明了血液和腫瘤組織中MGMT甲基化與直腸癌的治療具有很好的關(guān)系。所以未來的研究需要進一步探索MGMT甲基化與直腸癌治療之間的關(guān)系。

最近Tong等［20］也對局晚期直腸癌患者的基因進行了分析，并且比較了30例轉(zhuǎn)移性直腸癌的患者血液中ctDNA和CEA水平對新輔助治療反應(yīng)的預(yù)測評估。結(jié)果顯示在整個治療過程中，通過CT檢查能夠檢測出20個疾病進展事件；然而ctDNA預(yù)測進展事件明顯高于CEA［分別為16例（80%）和6例（30%），P=0.04］。并且當(dāng)ctDNA和CEA都預(yù)測到這些進展事件時，ctDNA的升高明顯早于CEA的變化（P=0.046）。此外有28名直腸癌患者接受了手術(shù)治療后進行長達(dá)2年的ctDNA的監(jiān)測，有6/28例（21%）的患者出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，但是在這些復(fù)發(fā)的患者中有一部分在復(fù)發(fā)時和復(fù)發(fā)前就已經(jīng)出現(xiàn)了ctDNA的升高，由此可以看出檢測ctDNA可以應(yīng)用于臨床預(yù)測新輔助放化療的療效。

三、循環(huán)中的miRNA

長度為19～25個核苷酸的小分子microRNAs（miRNAs），而且能高度穩(wěn)定地存在于血液中［21］。有研究檢驗循環(huán)miRNAs作為非侵入性生物標(biāo)志物預(yù)測LARC患者腫瘤放化療耐藥的潛力。

Azizian等［22］檢測行同步放化療的42例LARC患者血漿中5種miRNAs的表達(dá)譜。他們證明了miRNAs的表達(dá)水平在不同的時間點發(fā)生的變化。尤其是在治療前和治療結(jié)束后，miR-18b和miR-20a水平的降低（≥4%）與術(shù)后淋巴結(jié)陰性分期顯著相關(guān)（分別為P=0.023和P=0.024）。以miRNA下降4%為界值，應(yīng)用ROC曲線評價術(shù)后淋巴結(jié)陰性分期的miR-18b和miR-20a的鑒別能力，特異性分別為50%和57%，敏感性分別為67%和75%，陽性預(yù)測值分別為35%和41%，陰性預(yù)測值分別為79%和85%，準(zhǔn)確度分別為56%和62%。研究者認(rèn)為，對兩種miRNAs血漿水平降低的評估可作為預(yù)測nCRT反應(yīng)不良的生物標(biāo)志物。

使用組織微陣列技術(shù)，D'Angelo等［23］分析了38例LARC患者術(shù)前活檢組織中miRNAs的表達(dá)譜顯示：11個miRNAs被鑒定為能夠區(qū)分有緩解和無緩解的患者。其中miR-125b是由ROC曲線確定的最有希望的分子，其曲線下面積（AUC）為0.9026（P=0.0007）。測量發(fā)現(xiàn)同一患者術(shù)前血清中miR-125b的表達(dá)水平與在腫瘤組織中觀察到血清miR-125b反映的相同表達(dá)譜，相對于癌胚抗原（CEA）而言，區(qū)分無緩解患者的能力明顯較高。（AUC=0.7821，P=0.008和AUC=0.5781，P=0.416）。

Yu等［24］描述了一種類似的方法。在pCTR敏感和nCRT耐藥的組織之間鑒定了表達(dá)不同的16個miRNA的分子特征（P＜0.05）。經(jīng)定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證后，選擇miR-345作為87名LARC患者血清樣本分析的候選物，因為miR-345會在血清中增加且在無緩解患者中觀察到miR-345是最顯著的。無緩解患者血清中的miR-345水平顯著升高（P=0.002），計算出ROC曲線AUC值為0.69（P＜0.001）足以區(qū)分緩解者和無緩解者。并且在42名LARC患者的驗證組中將循環(huán)中的miR-345的發(fā)現(xiàn)得到了進一步證實，從而得出結(jié)論，miR-345可能被用作個性化治療策略的外周血預(yù)測生物標(biāo)記物。

四、循環(huán)蛋白

多項研究分析了治療前外周血CEA水平與治療反應(yīng)的關(guān)系，當(dāng)CEA水平在2.5～5.0 ng/mL范圍內(nèi)則反應(yīng)出與完全緩解相關(guān)[25]。但沒有真正評估或確認(rèn)CEA在預(yù)測患者對nCRT的反應(yīng)的預(yù)測能力。有一項研究報告了敏感性和特異性（分別為30%和83%），而另外兩項研究報告了ROC曲線AUC值，從0.63到0.65的CEA水平作為患者反應(yīng)的預(yù)測因子[26-28]。CEA水平與臨床參數(shù)和正電子發(fā)射斷層掃描（PET）數(shù)據(jù)的結(jié)合可以提高預(yù)測性能[29]。根據(jù)對低CEA和高CEA水平患者的簡單比較，所有這些研究都表明CEA是一個有潛力的預(yù)測生物標(biāo)志物。然而，在這里很難區(qū)分真正的預(yù)測值和CEA內(nèi)在的預(yù)后能力[30]。除了nCRT前的CEA水平外，新輔助治療后CEA水平的正?；cpCR相關(guān)，且最近有研究表明[31]，癌胚抗原指數(shù)下降的LARC患者在新輔助治療后更有可能達(dá)到病理完全緩解。

碳酸酐酶-IX（CA-IX）是在腫瘤缺氧時產(chǎn)生的一種腫瘤特異性蛋白［32］。Hektoen等［33］評估了接受短程新輔助化療和nCRT治療的LARC患者的循環(huán)CA-IX水平。結(jié)果顯示：在隨后出現(xiàn)腫瘤降期和淋巴結(jié)陰性的患者中，初始化療后血清CA-IX升高。

金屬蛋白酶可溶性組織抑制因子-1（TIMP-1）在結(jié)直腸癌患者的血漿和腫瘤組織中顯示升高［34］。在直腸癌患者中，觀察到nCRT后TIMP-1有增加，提示TIMP-1在接受了nCRT的LARC患者中具有潛在的預(yù)測作用［35-36］。也有研究顯示TIMP-1較CEA更能提供更強的療效預(yù)后信息［37］。

Dreyer等［38］評估了79例直腸癌患者在nCRT后系統(tǒng)性炎癥標(biāo)志物的變化，其中C反應(yīng)蛋白與白蛋白的比值與nCRT的不良病理反應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.022）。并且有研究強調(diào)其作為接受nCRT治療的直腸癌患者總體生存率和復(fù)發(fā)率的預(yù)測指標(biāo)［39］。

五、循環(huán)多肽

循環(huán)多肽組是生物標(biāo)志物的另一種來源。肽組是一種亞蛋白質(zhì)組分，腫瘤分泌的蛋白酶積極參與微環(huán)境入侵，并產(chǎn)生蛋白質(zhì)片段和肽擴散到循環(huán)系統(tǒng)［40］。

最近，利用納米多孔硅膠芯片（NSC）采集血漿多肽，對nCRT前的直腸癌患者的循環(huán)多肽進行分析［41］。通過一個簡單的MALDI-TOF/TOF分析，鑒定了肽特征，顯示了緩解者和非緩解者的LARC患者之間的顯著差異。應(yīng)用隨機森林分類來改進結(jié)果，并確定了三種肽的子集潛在地預(yù)測患者對治療的反應(yīng)，提供了77.8%的總體敏感性、91.7%的特異性和86%的總體準(zhǔn)確性，以及AUC為0.92。

六、抗腫瘤免疫相關(guān)細(xì)胞因子

抗腫瘤免疫反應(yīng)細(xì)胞因子也可能具有預(yù)測價值。有研究顯示白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8在內(nèi)的細(xì)胞因子與直腸癌的nCRT有關(guān)［42］。Tada［43］對35例直腸癌患者在nCRT前后的血清樣本進行了多重免疫測定，檢測了IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素-γ（INF-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞區(qū)劃蛋白-1（MCP-1）、C-C基序趨化因子配體-5（CCL-5）、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）和可溶性CD40配體的濃度。雖然在進行nCRT之前，細(xì)胞因子水平與對nCRT的反應(yīng)沒有顯著相關(guān)性，但在進行nCRT之后，無緩解者的白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α水平顯著高于緩解者，而且在進行nCRT之后，緩解者的可溶性CD40配體和CCL-5水平顯著降低。

七、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率

許多研究評估了中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率（NLR）對nCRT反應(yīng)的關(guān)系。Caputo等［44］檢測了87名直腸癌患者在nCRT前后的NLR和衍生的中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比率（d-NLR）。nCRT后較高的NLR和d-NLR與nCRT反應(yīng)差和術(shù)后并發(fā)癥顯著相關(guān)。Dong等［45］將959名直腸癌患者分成7個研究隊列評估NLR在直腸癌中的預(yù)測價值，研究結(jié)果表明NLR的升高與總體生存期（危險比=13.41，95%可信區(qū)間=4.90～36.72），無病生存期（危險比=4.37，95%可信區(qū)間=2.33～8.19）和無復(fù)發(fā)生存期（危險比=3.64，95%可信區(qū)間=1.88～7.05）相關(guān)。

八、結(jié)論

綜上所述，循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞、游離核酸、蛋白質(zhì)和肽等細(xì)胞和物質(zhì)會隨著腫瘤負(fù)荷、治療效果和疾病復(fù)發(fā)而變化，所以循環(huán)生物標(biāo)志物的檢測給評估腫瘤治療療效預(yù)測提供了一種潛在的微創(chuàng)方法。近年來的研究雖然不斷提示生物標(biāo)志物對新輔助治療后直腸癌完全緩解的潛在預(yù)測價值的證據(jù)，但仍存在一些問題尚未解決。優(yōu)化分離和純化相關(guān)生物標(biāo)志物的方法和檢測方案標(biāo)準(zhǔn)化是未來重要的方向，因為這是獲得良好靈敏度和正確評價結(jié)果的關(guān)鍵。另外，大多數(shù)研究本身無法達(dá)到生物標(biāo)志物預(yù)測價值的正確研究設(shè)計或納入病例數(shù)量有限，因而需要更加合理的臨床研究設(shè)計。特定的腫瘤生物標(biāo)志物和液體活檢預(yù)測nCRT的治療反應(yīng)對于優(yōu)化直腸癌局部治療是非常有前景的，同時對于檢測殘留疾病和早期復(fù)發(fā)癌癥也是非常有意義的。