CAR-T細(xì)胞治療面臨的挑戰(zhàn)及解決思路

朱婧涵 梁遠(yuǎn)征 王亮

作者單位：100069 北京 1首都醫(yī)科大學(xué)；100730 北京 2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院血液內(nèi)科

嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）免疫療法是將患者或異體供者體內(nèi)分離的T細(xì)胞通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行改造，使其表達(dá)嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），從而特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的一種過(guò)繼細(xì)胞療法[1]。CAR-T是近年來(lái)癌癥免疫治療領(lǐng)域的重大突破之一，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中體現(xiàn)了巨大優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的發(fā)展前景[2]。本文就CAR-T細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)與功能及其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的應(yīng)用以及面臨的挑戰(zhàn)作一綜述。

1 CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能

CAR-T通過(guò)基因修飾技術(shù)，將帶有特異性抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和T細(xì)胞激活信號(hào)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì)胞內(nèi)，使T細(xì)胞靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面上的相關(guān)抗原，從而激活效應(yīng)T細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。這種靶向識(shí)別過(guò)程不依賴于傳統(tǒng)的T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）與主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）間的相互作用，避免了腫瘤細(xì)胞通過(guò)下調(diào)MHC表達(dá)進(jìn)行免疫逃逸[3-4]。CAR-T根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)通常為靶向識(shí)別抗原的單鏈可變片段（single-chain variable fragment，scFv）?？缒^(qū)通常來(lái)源于 CD28 或 CD8，可以影響CARs間的相互作用。胞內(nèi)區(qū)為CD3ζ信號(hào)域，包含三個(gè)免疫受體酪氨酸激活模體（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs），可通過(guò)磷酸化激活啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化T細(xì)胞，促進(jìn)增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒作用[5-6]。

第一代CARs由scFv和CD3ζ信號(hào)域組成，體外具有T細(xì)胞殺傷毒性，但在臨床試驗(yàn)中沒有表現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng)。第二代CARs在第一代基礎(chǔ)上加入了一個(gè)來(lái)源于CD28或4-1BB的共刺激域，使CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間延長(zhǎng)，增殖能力和殺傷毒性也增強(qiáng)。第三代CARs在第一代CARs基礎(chǔ)上加入了兩個(gè)共刺激分子，其抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)一步提升。第四代CARs又被稱為“裝甲”T細(xì)胞（T cells redirected for universal cytokine killing，TRUCKs），通過(guò)基因修飾分泌特定的細(xì)胞因子或表達(dá)額外的共刺激配體增強(qiáng)CAR-T療效，同時(shí)引入了自殺基因系統(tǒng)控制CAR-T活性，必要時(shí)激活以降低細(xì)胞毒性[7-9]。

目前全球開展的臨床試驗(yàn)主要以CD28或4-1BB共刺激域構(gòu)成的第二代CAR-T為主。CD28或4-1BB共刺激域?qū)Υ龠M(jìn)CAR-T細(xì)胞體內(nèi)增殖和存活具有重要意義，能顯著提高接受CAR-T療法患者的完全緩解率。研究表明，CD28共刺激域可以誘導(dǎo)更迅速的抗腫瘤反應(yīng)，但持久性較差；而4-1BB的腫瘤清除速度較慢，但可誘導(dǎo)持續(xù)性的高水平反應(yīng)[4，8]，但臨床研究顯示表達(dá)CD28共刺激域的CAR-T細(xì)胞與表達(dá)4-1BB的CAR-T細(xì)胞在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床療效相似[5，8]。除了CD28和4-1BB，有關(guān)其他共刺激域來(lái)源的CAR-T細(xì)胞研究也正在積極展開，如OX40（CD137）、ICOS等[10]。

2 CAR-T細(xì)胞的臨床應(yīng)用

CAR-T免疫療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中取得了突破性進(jìn)展。目前美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）共批準(zhǔn)了四款靶向CD19的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，分別是Tisagenlecleucel（tisa-cel，Kymriah）、Axicabtagene Ciloleucel（axio-cel，Yescarta）、Brexucabtagene Autoleucel（brexu-cel，Tecartus）和 Lisocabtagene Maraleucel（liso-cel，Breyanzi），這些產(chǎn)品主要用于治療兒童和青年復(fù)發(fā)/難治性急性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）和成人特定類型的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL），包括復(fù)發(fā)/難治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、復(fù)發(fā)/難治性套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）和復(fù)發(fā)/難治性濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L），且療效顯著[11-12]。隨著大量有關(guān)CAR-T臨床研究的開展，針對(duì)不同靶點(diǎn)的有關(guān)CAR-T細(xì)胞還有望應(yīng)用于B-NHL、多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）、慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）、急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、T細(xì)胞淋巴瘤及實(shí)體瘤等領(lǐng)域[13-14]。

2.1 B細(xì)胞惡性腫瘤

CD19是一種B細(xì)胞特異性靶點(diǎn)，廣泛表達(dá)于幾乎所有的B細(xì)胞惡性腫瘤。CD19靶向CAR-T療法在兒童和成人復(fù)發(fā)/難治性B-ALL、復(fù)發(fā)/難治性DLBCL、復(fù)發(fā)/難治性FL和CLL等B細(xì)胞惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出快速而持久的抗腫瘤效應(yīng)[13，15-16]。CD20表達(dá)于除漿細(xì)胞外的所有分化階段的B細(xì)胞，CD20靶向CAR-T細(xì)胞目前處于早期臨床研究階段，在DLBCL、惰性非霍奇金淋巴瘤患者中有較高的反應(yīng)率[9]。此外，CD19、CD20雙特異性CAR-T細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出低毒性和高效性，可能成為克服抗原下調(diào)導(dǎo)致耐藥復(fù)發(fā)的有效手段[7]。CD22是唾液酸黏附素家族成員，為B細(xì)胞所特有，在絕大多數(shù)B細(xì)胞惡性腫瘤中表達(dá)[17-19]。由于接受CD19靶向CAR-T治療的患者中，約有50%發(fā)生耐藥復(fù)發(fā)，且主要機(jī)制是抗原丟失導(dǎo)致的免疫逃逸，因此CD22靶向CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用可能對(duì)CD19靶向CAR-T治療后復(fù)發(fā)的患者有效[19-21]。在一項(xiàng)采用CD22特異性CAR-T細(xì)胞治療B-ALL患者的臨床試驗(yàn)中，完全緩解率＞70%，其中包括大量CD19靶向CAR-T治療后復(fù)發(fā)的患者[19]。

2.2 MM

B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation protein，BCMA）是TNF超家族成員，表達(dá)于部分成熟B細(xì)胞、漿細(xì)胞及幾乎所有MM細(xì)胞。BCMA靶向CAR-T細(xì)胞在MM治療中表現(xiàn)出令人滿意的完全緩解率，但患者在治療后12個(gè)月內(nèi)易出現(xiàn)復(fù)發(fā)[22]。Ciltacabtagene Autoleucel（cilta-cel）是一種表達(dá)雙重BCMA表位的CAR-T細(xì)胞，包含一個(gè)4-1BB來(lái)源的共刺激結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CD3ζ胞內(nèi)信號(hào)域。有研究顯示單次輸注cilta-cel在復(fù)發(fā)/難治性MM患者中可產(chǎn)生深度而持久的反應(yīng)，其中輸注1個(gè)月內(nèi)完全緩解率為67%，3個(gè)月內(nèi)為62%[23]。此外，其他潛在治療MM的靶點(diǎn)還有SLAM7、CD38、CD138、免疫球蛋白κ輕鏈以及GPRC5D等，這些靶點(diǎn)在臨床試驗(yàn)中也初顯療效[24]。

2.3 霍奇金淋巴瘤

CD30是TNF受體超家族成員，在Reed-Sternberg細(xì)胞中普遍表達(dá)，是治療復(fù)發(fā)/難治性霍奇金淋巴瘤安全、有效的靶點(diǎn)[9]。在臨床Ⅰ期試驗(yàn)中，靶向CD30的CAR-T細(xì)胞在經(jīng)高強(qiáng)度淋巴清除預(yù)處理后的復(fù)發(fā)/難治性霍奇金淋巴瘤患者中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性和較低的毒性[25]。

2.4 T/NK細(xì)胞惡性腫瘤

針對(duì)T/NK細(xì)胞淋巴瘤的CAR-T研究目前仍處于早期階段，發(fā)展較緩慢，主要的限制是難以找到合適的靶點(diǎn)回避CAR-T細(xì)胞的“自相殘殺”[25]。目前處于臨床研究階段的主要靶點(diǎn)為CD5和CD7[25-27]。其中CD5靶向CAR-T細(xì)胞通過(guò)下調(diào)內(nèi)源性CD5的表達(dá)避免了“自相殘殺”，在臨床試驗(yàn)中對(duì)外周T細(xì)胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphoma，PTCL）和急性T淋巴細(xì)胞白血?。═ cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL））患者有效[3，25]。CD7靶向 CAR-T細(xì)胞不能顯著下調(diào)自身CD7的表達(dá)，但通過(guò)CD7靶向基因破壞可以在不影響抗原識(shí)別的情況下使CAR-T細(xì)胞抵抗“自相殘殺”，從而證實(shí)了CD7靶向治療的可行性[27]。在一項(xiàng)供者來(lái)源的靶向CD7的CAR-T細(xì)胞臨床試驗(yàn)中，CAR-T細(xì)胞對(duì)復(fù)發(fā)/難治性T-ALL患者有較高的緩解率和較小的毒性，雖然CD7陽(yáng)性的T細(xì)胞和NK細(xì)胞被迅速清除，但CD7陰性的T細(xì)胞和NK細(xì)胞發(fā)生了急劇擴(kuò)張，且對(duì)真菌和病毒刺激具有效應(yīng)性，表明這些細(xì)胞具有免疫保護(hù)作用[26]。

2.5 AML

AML細(xì)胞表面抗原與正常髓系細(xì)胞表面抗原共享，因此直接靶向AML抗原會(huì)產(chǎn)生對(duì)正常髓系細(xì)胞的嚴(yán)重毒副作用，從而限制CAR-T細(xì)胞的治療潛力[28]。一項(xiàng)臨床前試驗(yàn)利用基因編輯技術(shù)將自體CD33敲除的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞轉(zhuǎn)入動(dòng)物模型，建立了一個(gè)對(duì)靶向CD33治療有抵抗力的造血系統(tǒng)，并使靶向CD33的CAR-T細(xì)胞定位到AML。盡管目前難以將研究推進(jìn)到臨床，但這項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果提供了一種解決問(wèn)題的新思路[29]。尋找正常組織耐受的AML靶點(diǎn)的相關(guān)研究也在積極展開中[28]。

3 CAR-T細(xì)胞治療面臨的挑戰(zhàn)

了解CAR-T細(xì)胞治療面臨的挑戰(zhàn)，明確導(dǎo)致局限性的機(jī)制并克服這些障礙，能使CAR-T細(xì)胞更好地發(fā)揮其潛能，優(yōu)化治療策略，改善患者預(yù)后。目前發(fā)現(xiàn)的可影響CAR-T細(xì)胞治療療效的幾個(gè)關(guān)鍵因素包括CAR-T細(xì)胞的制造、毒副作用的管理以及耐藥復(fù)發(fā)等。

3.1 CAR-T細(xì)胞制造中的問(wèn)題

CAR-T細(xì)胞制造面臨的挑戰(zhàn)涉及T細(xì)胞的獲取、分離篩選、轉(zhuǎn)導(dǎo)、培養(yǎng)擴(kuò)增、起始T細(xì)胞表型選擇等多個(gè)環(huán)節(jié)，通過(guò)各環(huán)節(jié)方法的優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品更高的臨床療效與更小的毒副作用[21]。目前FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞都是自體來(lái)源的，沒有同種異體排斥和移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）風(fēng)險(xiǎn)，但獲取難度較大，且細(xì)胞質(zhì)量往往得不到保障[30]。使用健康捐獻(xiàn)者的細(xì)胞生產(chǎn)CAR-T產(chǎn)品是解決低質(zhì)量CAR-T細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題的一種方案。早期臨床研究證實(shí)了異基因移植后疾病復(fù)發(fā)的患者使用供體來(lái)源CAR-T細(xì)胞的可行性，其GVHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較低[9]。此外，供者來(lái)源的T細(xì)胞有助于開發(fā)通用的CAR-T產(chǎn)品，這對(duì)克服CAR-T細(xì)胞來(lái)源不足、質(zhì)量低劣以及生產(chǎn)周期長(zhǎng)等現(xiàn)存問(wèn)題有重要意義，但需要額外的基因修飾來(lái)降低免疫排斥和 GVHD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[16，21，30]。此外，CAR結(jié)構(gòu)往往含有外源序列，由于制備具有一定難度，目前多數(shù)CAR-T細(xì)胞的scFv是鼠源的，具有免疫原性，在接受治療的患者中已檢測(cè)到針對(duì)scFv的人抗鼠抗體[31]。

已有研究表明CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的初始T細(xì)胞表型對(duì)后續(xù)臨床反應(yīng)起重要作用。特定的T細(xì)胞表型，如中央記憶型T細(xì)胞、干細(xì)胞樣記憶型T細(xì)胞及前體T細(xì)胞可能提高CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增能力和持久性[21，32-33]。一項(xiàng)對(duì)CLL患者的CD19靶向CAR-T細(xì)胞治療的研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)反應(yīng)者相比，有應(yīng)答者的CAR-T細(xì)胞群有豐富的記憶T細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)[34]。另一研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)藥物調(diào)節(jié)系統(tǒng)或達(dá)沙替尼強(qiáng)制下調(diào)CAR蛋白誘導(dǎo)其進(jìn)入靜息狀態(tài)，從而獲得記憶樣表型，成功實(shí)現(xiàn)了耗竭的CAR-T細(xì)胞表型和轉(zhuǎn)錄特征的逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而恢復(fù)CAR-T細(xì)胞抗腫瘤功能[35]。

此外，CAR-T細(xì)胞的輸注時(shí)機(jī)也對(duì)治療反應(yīng)有重要影響。通過(guò)技術(shù)優(yōu)化縮短CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)周期，有望減少患者病情延誤，使更多患者受益[21]。另外，通常編碼CAR結(jié)構(gòu)的基因大多通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì)胞中，但隨著轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的開發(fā)，使用轉(zhuǎn)座子替代病毒載體用于CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)具有更經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)，目前睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已應(yīng)用于CD19靶向CAR-T細(xì)胞的制造[5]。

3.2 CAR-T細(xì)胞治療的毒副作用

幾乎所有接受CD19靶向CAR-T細(xì)胞治療的患者都出現(xiàn)了不同程度的毒副作用，包括細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）和免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（immune effector associated neurotoxicity syndrome，ICANS）等，后者也稱神經(jīng)毒副作用[15-16，36]。美國(guó)移植和細(xì)胞治療學(xué)會(huì)（American Society for Transplantation and Cellular Therapy，ASTCT）制定并發(fā)布了關(guān)于CRS和ICANS的標(biāo)準(zhǔn)化分級(jí)建議，對(duì)管理和治療CAR-T毒副作用具有指導(dǎo)意義[37]。

CRS的臨床癥狀常始于發(fā)熱，嚴(yán)重者可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)、低血壓、缺氧和器官功能衰竭[5]。ICANS主要表現(xiàn)為中毒性腦病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致癲癇發(fā)作、腦水腫和昏迷。發(fā)生ICANS的患者多數(shù)都有CRS病史，提示CRS可能作為ICANS的啟動(dòng)因素或促進(jìn)因素[38]。如果能及時(shí)發(fā)現(xiàn)CRS和ICANS的早期癥狀并進(jìn)行有效干預(yù)，兩者的臨床進(jìn)程都是可逆的，但嚴(yán)重的CRS和ICANS都可能致命。而了解CRS和ICANS的病理生理學(xué)機(jī)制，有助于靶向藥物的開發(fā)，在盡可能保留CAR-T細(xì)胞抗腫瘤活性基礎(chǔ)上抑制其毒性[36]。CRS與多種細(xì)胞因子水平升高有關(guān)，其中IL-6是介導(dǎo)CRS的重要免疫分子，阻斷IL-6受體的托珠單抗是目前治療CRS的主要手段[6-7，38]。臨床前試驗(yàn)表明，CRS由CAR-T細(xì)胞和宿主細(xì)胞組成的多細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)觸發(fā)，其中單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在激活過(guò)程中起核心作用。IL-1是單核-巨噬系統(tǒng)的主要細(xì)胞因子產(chǎn)物之一，可能參與CRS的驅(qū)動(dòng)環(huán)節(jié)，阻斷該靶點(diǎn)對(duì)緩解CRS有效[6，36]。TNF、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte/macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）及其他促炎細(xì)胞因子也參與CRS過(guò)程，可能是潛在的靶點(diǎn)[39]。目前臨床上對(duì)于低級(jí)別CRS主要采取退熱和支持性治療，同時(shí)積極防治其他可能導(dǎo)致發(fā)熱的并發(fā)癥，如感染。中至重度CRS一般使用托珠單抗，并根據(jù)患者情況選擇性使用類固醇藥物輔助治療，效果較顯著。對(duì)于嚴(yán)重CRS患者，一般使用類固醇抑制CAR-T細(xì)胞和其他“旁觀者”細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子分泌。需要注意的是，類固醇不能大劑量使用，其對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用會(huì)導(dǎo)致CAR-T療效下降[40]。一些小分子抑制劑如蘆可替尼、伊布替尼可廣泛抑制多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生及信號(hào)傳導(dǎo)，并可與多靶點(diǎn)結(jié)合，從而調(diào)控CAR-T細(xì)胞的免疫功能，降低毒副作用[36]。

ICANS的發(fā)生機(jī)制可能與CAR-T細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的積聚有關(guān)。臨床前試驗(yàn)觀察到腦脊液CAR-T細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞因子水平與ICANS嚴(yán)重程度存在相關(guān)性。CD19靶向CAR-T治療的ICANS發(fā)生率高于CD22靶向CAR-T細(xì)胞治療，這可能是因?yàn)镃D19在人腦中壁細(xì)胞有表達(dá)。ICANS患者的臨床治療手段是給予類固醇，給藥劑量宜取最低，以避免對(duì)CAR-T療效的影響及產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制[40]。托珠單抗治療CRS取得了較好的效果，但對(duì)ICANS的作用十分有限，可能與其難以透過(guò)血腦屏障有關(guān)[36，41]。

毒副作用是目前限制CAR-T療效的重要因素，阻礙了通過(guò)增加CAR-T細(xì)胞劑量或提高效應(yīng)活性增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用[9]。高腫瘤負(fù)荷、高齡、接受高強(qiáng)度淋巴清除預(yù)處理等被認(rèn)為與免疫毒副作用的發(fā)生有關(guān)[42]。隨著治療病例的增多和隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，更多的毒副作用顯現(xiàn)，如噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥/巨噬細(xì)胞激活綜合征樣毒性反應(yīng)、B細(xì)胞再生障礙性貧血相關(guān)的免疫功能受損狀態(tài)并發(fā)致命感染、致命性腦水腫等[1]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在CAR中加入自殺基因，如誘導(dǎo)型caspase-9或單純皰疹病毒胸苷激酶是降低CAR-T細(xì)胞毒副作用的可能手段，但會(huì)造成CAR-T細(xì)胞不可逆的清除，降低抗腫瘤療效[43]。

3.3 CAR-T細(xì)胞治療后的耐藥復(fù)發(fā)

盡管CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤取得了巨大突破，但是在接受CD19靶向CAR-T細(xì)胞治療的患者中，耐藥復(fù)發(fā)比例高達(dá)30%～50%，且大部分復(fù)發(fā)發(fā)生在治療后12個(gè)月以內(nèi)[44-45]。但是這種復(fù)發(fā)并不只是針對(duì)CD19靶點(diǎn)，其他靶點(diǎn)如CD22、BCMA的相關(guān)研究亦證明了耐藥復(fù)發(fā)是CAR-T細(xì)胞治療普遍面臨的重大挑戰(zhàn)[19，21，46]。目前通常將復(fù)發(fā)事件分為抗原陰性復(fù)發(fā)和抗原陽(yáng)性復(fù)發(fā)兩類[11]。

抗原陰性復(fù)發(fā)的主要機(jī)制是抗原丟失[17-19]。目前認(rèn)識(shí)到的抗原丟失機(jī)制包括剪接突變、表位隱蔽、靶表位丟失導(dǎo)致細(xì)胞譜系改變等[46]。然而，即使抗原未完全丟失，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)使抗原表達(dá)減少或密度降低也足以使腫瘤細(xì)胞逃逸[17，19]。在一項(xiàng)使用CD22靶向CAR-T細(xì)胞治療白血病患者的臨床試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)存在陽(yáng)性抗原的白血病患者復(fù)發(fā)，提示CAR-T細(xì)胞活性的維持需要達(dá)到最低抗原表達(dá)閾值[21，46]。組合多分子靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞有望克服抗原丟失或下調(diào)機(jī)制的腫瘤細(xì)胞逃逸[7，17，19，21，44]。對(duì)于 CD19靶向CRA-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)的患者，CD22是一個(gè)理想的靶點(diǎn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)CD19陰性患者的CD22表達(dá)仍是陽(yáng)性。在臨床試驗(yàn)中，靶向CD22的CAR-T細(xì)胞治療CD19陰性的B細(xì)胞淋巴瘤及白血病復(fù)發(fā)患者有效，但在序貫免疫治療過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞下調(diào)CD22表達(dá)而引起的耐藥復(fù)發(fā)。因此，開發(fā)同時(shí)針對(duì)CD19、CD22雙靶向的CAR-T細(xì)胞可能在克服耐藥問(wèn)題上具有更大潛力[19]。除了靶抗原的選擇，還需要關(guān)注CAR-T在免疫突觸形成和靶細(xì)胞殺傷環(huán)節(jié)的精確機(jī)制。天然TCR可以在低密度水平識(shí)別抗原，據(jù)此推測(cè)CAR與天然TCR間的結(jié)構(gòu)差異可能導(dǎo)致了對(duì)抗原識(shí)別密度要求的差異[46]。

值得注意的是，并不是所有復(fù)發(fā)患者的CD19都是陰性，這也說(shuō)明除了抗原丟失、腫瘤細(xì)胞逃逸，還有其他因素導(dǎo)致了CAR-T的耐藥性?？乖?yáng)性復(fù)發(fā)的主要原因是CAR-T細(xì)胞衰竭，由于長(zhǎng)期接觸高水平抗原而導(dǎo)致自身功能減退[17，33]。一般認(rèn)為CAR-T細(xì)胞的抗原非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞衰竭關(guān)系密切，高腫瘤負(fù)荷也是導(dǎo)致衰竭的重要因素[33]。免疫檢查點(diǎn)阻斷技術(shù)與CAR-T細(xì)胞聯(lián)合在克服衰竭和增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)性和持久性上具有發(fā)展前景[6]。IL-7受體與CAR共表達(dá)可以避免刺激“旁觀者”細(xì)胞，提高CAR-T細(xì)胞的增殖能力、抗腫瘤活性和持久性。CAR-T細(xì)胞的CAR結(jié)構(gòu)含有非自身成分，具有免疫原性，可能誘導(dǎo)體液和細(xì)胞抗CAR免疫，從而限制療效，影響CAR-T細(xì)胞的增殖能力和持久性。研究表明在輸注CAR-T細(xì)胞后有5%的DLBCL患者和36.7%的B-ALL患者出現(xiàn)抗CAR抗體水平增加[3]。環(huán)磷酰胺或氟達(dá)拉濱預(yù)處理被認(rèn)為是降低抗CAR細(xì)胞免疫程度的重要因素[9]。開發(fā)人源化CAR-T產(chǎn)品是解決這一問(wèn)題的有效手段，在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)復(fù)發(fā)/難治性B-ALL的持久療效[11]。CAR結(jié)構(gòu)中的共刺激結(jié)構(gòu)域也會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的持久性[32]。通常認(rèn)為，與4-1BB共刺激域相比，CD28來(lái)源的CARs持久性較差，更傾向于發(fā)生衰竭；而含有4-1BB共刺激域的CAR-T細(xì)胞有較高水平的抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL，并可能存在一種促進(jìn)形成記憶表型T細(xì)胞的機(jī)制[31]。目前處于臨床試驗(yàn)階段的改進(jìn)措施包括使用人工抗原提呈細(xì)胞激活CAR-T細(xì)胞、調(diào)控CAR-T表型以及聯(lián)合抑制免疫檢查點(diǎn)分子等[21]，結(jié)果值得期待。

4 改進(jìn)CAR-T細(xì)胞特性的方法

4.1 CAR-T細(xì)胞設(shè)計(jì)上的改進(jìn)

4.1.1 CAR結(jié)構(gòu)的改進(jìn) CAR結(jié)構(gòu)中任何一個(gè)部分的微小改變都會(huì)對(duì)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)不同的scFv、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、共刺激域和ITAMs都可以影響CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)性[9，30]。

克服抗原丟失最直接的辦法是開發(fā)多靶向抗原CARs，目前CD20、CD22靶點(diǎn)分別與CD19串聯(lián)或聯(lián)合使用的CAR-T細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出一定的安全性和可行性[44]。另一個(gè)具有發(fā)展前景的多靶點(diǎn)開發(fā)方向是對(duì)CAR-T細(xì)胞進(jìn)行BiTEs修飾。BiTEs通常由一個(gè)CD3靶向scFv和一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）靶向scFv通過(guò)連接子連接而成，用腫瘤特異性結(jié)構(gòu)域代替scFv的設(shè)計(jì)也正處于臨床前及臨床早期評(píng)估階段[30，47]。其中scFv連接子的長(zhǎng)度改變可以影響CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)活性。研究發(fā)現(xiàn)短鏈scFv連接子可以通過(guò)促進(jìn)自主共刺激信號(hào)增加抗原非依賴性受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和下游T細(xì)胞活化，促進(jìn)免疫突觸形成，增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)[18]。雙峰駝重鏈CAR取代傳統(tǒng)的scFv，在臨床前模型中顯示出強(qiáng)大的靶向親和力和有效性，且由于省去連接子部分而減少了一個(gè)免疫原性靶點(diǎn)，因此具有一定優(yōu)勢(shì)[30]。用人源化或全人源scFv替代鼠源結(jié)構(gòu)也可以降低CAR的免疫原性，避免宿主免疫排斥，提高CAR-T細(xì)胞持久性[3]。

共刺激域是CAR-T細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的重要組成部分，但過(guò)度的共刺激信號(hào)可能會(huì)促進(jìn)衰竭，降低CAR-T細(xì)胞持久性。通過(guò)突變CD28結(jié)構(gòu)域中的特定位點(diǎn)有利于控制共刺激強(qiáng)度，降低CAR-T毒副作用并提高持久性[30]。調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)的強(qiáng)度也可以影響CAR-T效應(yīng)，一種只包含一個(gè)ITAM結(jié)構(gòu)的CD3ζ截短信號(hào)域CAR-T細(xì)胞在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出更好的反應(yīng)性和持久性[31]。鉸鏈長(zhǎng)度和組成的不同也能影響CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合及信號(hào)傳遞，對(duì)鉸鏈和跨膜區(qū)的修飾還可以降低免疫原性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌[30]。

4.1.2 基因編輯 應(yīng)用基因編輯技術(shù)對(duì)CAR-T細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。CRISPR/Cas9指導(dǎo)的基因組編輯可將CAR基因整合至T細(xì)胞受體α鏈恒定區(qū)（T-cell receptor alpha constant domain，TRAC），通過(guò)破壞內(nèi)源性TCR，降低了抗原非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。破壞內(nèi)源性TCR的另一個(gè)好處是抑制GVHD，這種方法不僅增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性，還有利于通用型CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建，克服自體CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)周期長(zhǎng)的問(wèn)題[5，30-31]。程序性細(xì)胞死亡受體 1（programmed cell death 1，PD-1）是表達(dá)于多種免疫細(xì)胞上的免疫檢查點(diǎn)分子，在免疫抑制過(guò)程中起重要作用。PD-1通過(guò)與腫瘤細(xì)胞上的程序性死亡配體（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）結(jié)合，誘導(dǎo) T 細(xì)胞功能障礙和衰竭[37，48]。將CAR-T細(xì)胞與PD-1/PD-L1抗體結(jié)合是提高CAR-T療效的一種可行辦法[7，49]。應(yīng)用分泌PD-1抗體scFv段以及使用CRISPR/Cas9消融PD-1基因CAR-T細(xì)胞也顯示出通過(guò)抑制PD-1而增強(qiáng)CAR-T療效的可行性[45，49]。在 CD8+CAR-T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子ATF樣蛋白（basic leucine zipper ATF-like transcription factor，BATF）和干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）可促進(jìn)CAR-T細(xì)胞存活和擴(kuò)增，并產(chǎn)生抑制腫瘤復(fù)發(fā)的長(zhǎng)壽記憶T細(xì)胞，且該反應(yīng)依賴于BATF-IRF的相互作用，可能通過(guò)改變CAR-T細(xì)胞的表型和轉(zhuǎn)錄模式，使其遠(yuǎn)離耗竭狀態(tài)，增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)[50]。

4.1.3 同種異體CAR-T細(xì)胞 使用供者來(lái)源的同種異體CAR-T細(xì)胞具有很多潛在優(yōu)勢(shì)，如有利于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化、提高生產(chǎn)效率、降低制作成本、保證產(chǎn)品質(zhì)量。目前同種異體CAR-T細(xì)胞主要來(lái)源于外周血單個(gè)核細(xì)胞，少數(shù)來(lái)自臍帶血。臍帶血來(lái)源的T細(xì)胞具有獨(dú)特的抗原幼稚狀態(tài)，使用臍帶血來(lái)源的CAR-T細(xì)胞可以降低GVHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[51]。通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將CAR插入TRAC，破壞TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以抑制GVHD，為同種異體CAR-T細(xì)胞以及通用型CAR-T 細(xì)胞的發(fā)展提供可能性[5，30，51]。通過(guò)基因編輯構(gòu)造的UCART19在針對(duì)經(jīng)高強(qiáng)度預(yù)處理的復(fù)發(fā)/難治性B-ALL多中心臨床試驗(yàn)中也表現(xiàn)出安全性和有效性，UCART19輸注后通過(guò)同種異體干細(xì)胞移植鞏固治療可以產(chǎn)生持久療效[16]。

4.1.4 其他效應(yīng)細(xì)胞類型 由于自體CAR-T細(xì)胞的局限性，其他效應(yīng)細(xì)胞的CAR構(gòu)建體開發(fā)已處于臨床前和臨床階段，包括NK細(xì)胞、iNKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等[52-53]。與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-NK細(xì)胞的安全性更高，不易產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用如CRS、ICANS等，也不會(huì)誘發(fā)GVHD，這些特征使CAR-NK細(xì)胞應(yīng)用于AML和復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞惡性腫瘤成為可能[52，54]。在CAR構(gòu)建物中加入轉(zhuǎn)基因IL-15有助于提高CAR-NK細(xì)胞的持久性和抗腫瘤活性[54-55]。另一種選擇是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的類記憶型（cytokine-induced memory-like，CIML）NK細(xì)胞，可通過(guò)IL-12、IL-15、IL-18的預(yù)激活增加持久性。這種CIML-NK細(xì)胞在臨床前試驗(yàn)中對(duì)AML異種移植小鼠表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤作用，在臨床試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)能在44%的AML患者中誘導(dǎo)緩解[54]。雖然NK細(xì)胞與T細(xì)胞可以共享一些信號(hào)域和共刺激域，如CD3ζ、4-1BB，但NK細(xì)胞更特異性的共刺激域，如DAP10、DAP12和2B4等有助于提高CAR-NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)使用2B4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域替代4-1BB的CAR-NK細(xì)胞增強(qiáng)了細(xì)胞毒作用，這為治療T細(xì)胞惡性腫瘤提供了可能性[56]。

4.2 改善CAR-T細(xì)胞微環(huán)境

在進(jìn)行CAR-T細(xì)胞回輸前，應(yīng)用環(huán)磷酰胺和氟達(dá)拉濱進(jìn)行預(yù)處理，促進(jìn)體內(nèi)淋巴細(xì)胞衰竭有利于增加CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)性和持久性[9，46]。來(lái)那度胺、伊布替尼以及免疫檢查點(diǎn)抑制劑與CAR-T細(xì)胞療法聯(lián)合也可以增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)[41]。但需要注意的是，雖然提高CAR-T細(xì)胞活性有利于腫瘤清除，但是CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增性、效應(yīng)性的增強(qiáng)也往往會(huì)導(dǎo)致抗原非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，從而促進(jìn)CAR-T細(xì)胞衰竭[7，33]。在臨床前試驗(yàn)中，來(lái)那度胺與CAR-T細(xì)胞聯(lián)合使用可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞毒性、促進(jìn)Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生和免疫突觸的形成提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。伊布替尼與liso-cel聯(lián)合使用可以促進(jìn)CAR-T細(xì)胞向記憶樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，提高CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)性和持久性。通常認(rèn)為，CAR-T細(xì)胞衰竭是一種不可逆轉(zhuǎn)的T細(xì)胞功能低下狀態(tài)[33]。然而最新研究發(fā)現(xiàn)在治療早期間歇性暫停CAR-T細(xì)胞信號(hào)可以使細(xì)胞保持在分化程度較低的階段，使衰竭的CAR-T細(xì)胞進(jìn)程逆轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)表觀遺傳重編程[57]。使用酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼阻斷近端TCR信號(hào)抑制CAR-T細(xì)胞活化可以逆轉(zhuǎn)抗原非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，保留CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤功能?；诖税l(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用達(dá)沙替尼間歇治療調(diào)控CAR-T細(xì)胞“休息”可能有效緩解CAR-T細(xì)胞衰竭，提高CAR-T細(xì)胞抗腫瘤能力[35，57]。免疫記憶對(duì)抗腫瘤效應(yīng)的持久性至關(guān)重要。臨床前試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)周期蛋白依賴性激酶4/6抑制劑（cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor，CDK4/6i）能增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)性與持久性，促進(jìn)記憶表型分化，誘導(dǎo)對(duì)封鎖免疫檢查點(diǎn)有利的T細(xì)胞表型[58]。

5 小結(jié)

CAR-T細(xì)胞免疫療法給血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者帶來(lái)了新的希望，讓難治性、復(fù)發(fā)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤有了治愈的可能。盡管CAR-T細(xì)胞治療在當(dāng)下仍然存在諸多挑戰(zhàn)，如免疫原性、耐藥性、毒性等，但是隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展以及其他免疫靶點(diǎn)藥物的開發(fā)，通過(guò)設(shè)計(jì)上的不斷優(yōu)化以及與其他免疫療法的聯(lián)合使用，相信CAR-T細(xì)胞仍然是最有前景的癌癥免疫治療手段之一，并有希望在未來(lái)突破實(shí)體瘤限制，擴(kuò)大適應(yīng)證，治愈更多疾病。