從腫瘤免疫微環(huán)境角度看免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物

白日蘭 崔久嵬

作者單位：130021 長春 吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治療開創(chuàng)了抗腫瘤治療的新紀(jì)元，目前已在多個腫瘤中觀察到持久應(yīng)答和顯著的生存優(yōu)勢[1-2]。然而，大多數(shù)患者并不能從ICIs治療中獲益。近年來，對ICIs療效預(yù)測生物標(biāo)志物的鑒定和開發(fā)越來越受到重視。腫瘤組織往往與其賴以生存的微環(huán)境相依相行，而腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment，TIME）是一個極為復(fù)雜的體系，其內(nèi)在的各種免疫細胞、基質(zhì)細胞及細胞因子均可與腫瘤細胞相互作用，且這些免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控與腫瘤存在著復(fù)雜的相互作用并對腫瘤發(fā)生發(fā)展和免疫治療應(yīng)答產(chǎn)生重要影響。同時，TIME也是一個異質(zhì)性環(huán)境，個體的免疫狀態(tài)往往是各因素隨機化的結(jié)果，因此需要尋找所有因素相互作用的結(jié)果總和，才能有效并準(zhǔn)確地預(yù)測TIME對腫瘤免疫應(yīng)答的整體影響。近年來，隨著多重免疫組化技術(shù)、高通量測序和微陣列技術(shù)的發(fā)展和不斷完善，人們對TIME的了解也逐步深入，并開發(fā)了基于腫瘤和微環(huán)境的ICIs療效聯(lián)合預(yù)測生物標(biāo)志物模型。而這些生物標(biāo)志物的開發(fā)有助于揭示ICIs的治療機制及腫瘤與TIME的相互作用機制，實現(xiàn)個體化抗腫瘤免疫治療決策，監(jiān)測治療療效和疾病發(fā)展，指導(dǎo)臨床試驗設(shè)計并進一步了解耐藥機制及預(yù)后。本文從TIME角度出發(fā)，概述免疫治療療效預(yù)測生物標(biāo)志物的研究進展，以及基于腫瘤和免疫微環(huán)境因素開發(fā)的聯(lián)合預(yù)測模型。

1 腫瘤微環(huán)境免疫表型

1.1 腫瘤微環(huán)境整體免疫表型

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）的整體狀態(tài)與免疫治療療效具有相關(guān)性，基于深度學(xué)習(xí)衍生的“計算機染色”可獲得標(biāo)準(zhǔn)的病理癌癥圖像并用于鑒定腫瘤TILs[3]。根據(jù)TIME中免疫細胞狀態(tài)可將腫瘤免疫浸潤模式大致分為免疫炎癥型、免疫排除型和免疫沙漠型三種[4]。免疫炎癥型的特征是腫瘤實質(zhì)中存在CD8+和CD4+T細胞，并伴隨免疫檢查點分子的表達[5]，提示此類腫瘤對ICIs治療具有潛在的抗腫瘤免疫反應(yīng)[6]。免疫排除型的特征是在腫瘤侵襲性邊緣或間質(zhì)中存在不同的免疫細胞類型，但不能浸潤到腫瘤實質(zhì)中[4，7]。有研究對抗程序性細胞死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）/及其配體（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）治療前的樣本進行分析，結(jié)果顯示，應(yīng)答者侵襲性邊緣的CD8+T細胞豐度相對較高，治療期間連續(xù)采樣顯示CD8+T細胞浸潤腫瘤實質(zhì)增加[8]。免疫沙漠型的特征是腫瘤實質(zhì)或間質(zhì)中缺乏豐富的T細胞，對ICIs治療反應(yīng)不佳[6]。最近，有研究提出將免疫評分作為表征TME免疫狀態(tài)、腫瘤分類以及預(yù)測治療反應(yīng)和預(yù)后的有效指標(biāo)[9]，其涉及中心和腫瘤侵襲邊緣的兩個淋巴細胞群（CD8+和記憶[CD45RO+]T細胞）的密度[10]。MLECNIK等[11]在599例Ⅰ～Ⅳ期結(jié)直腸癌標(biāo)本中評價了免疫評分，證實其與腫瘤患者無進展生存期（progression-free survival，PFS）、總生存期（overall survival，OS）顯著相關(guān)，多因素分析也顯示了免疫評分在預(yù)測疾病復(fù)發(fā)和生存方面的優(yōu)越性。國際上正在黑色素瘤和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）臨床試驗中驗證免疫評分預(yù)測ICIs治療療效的價值[9]。

一項研究使用轉(zhuǎn)錄組分析對TME進行分類并證實微環(huán)境亞型可作為免疫治療療效預(yù)測指標(biāo)[12]。研究人員首先在已發(fā)表的文獻中搜索出TME各組分（如腫瘤主要成分、免疫細胞、基質(zhì)細胞和其他細胞群）的功能基因表達譜特征（functional gene expression signatures，F(xiàn)ges）；然后構(gòu)建出全面描繪TME的單一模型；接著利用腫瘤基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）、國際癌癥基因組聯(lián)盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）或基因型-組織表達（Genotype-Tissue Expression，GTEx）等多種數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集對Fges分類的準(zhǔn)確性進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有高度細胞類型特異性，例如與正常組織和黑痣相比，腫瘤增殖特征基因的表達（包括細胞周期和腫瘤進展相關(guān)基因）與惡性黑色素瘤具有強相關(guān)性[12]；最后利用29個Fges對黑色素瘤TME進行分類并劃分出以下4種微環(huán)境亞型：⑴免疫富集且纖維化（immuneenriched，fibrotic，IE/F）；⑵免疫富集，非纖維化（immune-enriched，fibrotic，IE）；⑶纖維化（fibrotic，F(xiàn)）；⑷免疫耗竭（immune-depleted，D）[12]。以上不同TME亞型間差異顯著，與免疫治療具有相關(guān)性，可作為潛在的預(yù)測生物標(biāo)志物。例如，在抗細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）免疫治療中，IE型皮膚黑色素瘤患者對治療的應(yīng)答率為82%，而F型為10%，且IE型OS最長[12]。此外，通過對免疫治療前后進行分析，還能觀察到TME對免疫治療的動態(tài)進化。例如，接受抗PD-1治療的黑色素瘤患者中，應(yīng)答者基本為IE/F型或IE型，在治療中保持不變或向免疫富集型環(huán)境發(fā)展；而無應(yīng)答者的TMEs多為F型，在治療中似乎維持或趨向免疫抑制性TME移動[12]。這種TME分類系統(tǒng)也可以解釋低腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）患者免疫治療的有效性，而且在沒有TMB數(shù)據(jù)的擴大隊列中，利用治療前和治療中的活組織檢查進行TME分類仍具有很好的預(yù)測潛力。因此，TME分型和TMB分析這兩種分類系統(tǒng)可作為免疫治療生物標(biāo)志物的相互補充。

1.2 特定微環(huán)境免疫表型

除了微環(huán)境整體免疫表型外，TME中免疫細胞或基質(zhì)細胞上一些分子的表達也可表征微環(huán)境中特定的免疫表型，從而影響免疫治療療效，目前已作為免疫治療預(yù)測標(biāo)志物被逐步探索。最近研究發(fā)現(xiàn)CD28可作為免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物，并以此開發(fā)新型的免疫療法。與CTLA-4相反，CD28是一種與CD80/86相互作用而調(diào)節(jié)免疫功能的共刺激受體，能激活促進免疫反應(yīng)的多種機制[13]。T淋巴細胞酪氨酸激酶（lymphocyte cell kinase，LCK）、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等信號通路可激活CD28，進而激活下游多種轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）和核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）。這些轉(zhuǎn)錄因子對IL-2的產(chǎn)生以及T細胞的活化和存活至關(guān)重要[13]。KAMPHORST等[14]研究發(fā)現(xiàn)CD28信號對CD8+T細胞增殖和抗腫瘤應(yīng)答的激活和恢復(fù)具有重要作用，抗PD-1治療對CD28+細胞具有選擇性增殖作用，因此建議將CD28作為預(yù)測腫瘤患者CD8+T細胞應(yīng)答的潛在生物標(biāo)志物。此外，PD-1被其配體PD-L1激活后，通過T細胞受體（T cell receptor，TCR）抑制信號傳導(dǎo)。HUI等[15]通過在生化重建系統(tǒng)中檢測PD-1信號，發(fā)現(xiàn)共刺激受體CD28較TCR更可能作為PD-1募集Shp2磷酸酶去磷酸化的靶標(biāo)；且在完整的細胞系統(tǒng)中，CD28在PD-L1激活PD-1后優(yōu)先去磷酸化，而不是TCR。因此認為，PD-1主要通過滅活CD28信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制T細胞功能，說明共刺激通路在調(diào)節(jié)效應(yīng)T細胞（effector T cells，Teffs）功能和抗PD-L1/PD-1治療應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。未來，通過更好地阻斷PD-1與CD28結(jié)合來挽救T細胞耗竭表型可能是潛在的有效抗腫瘤免疫治療策略。

除激活分子外，免疫細胞表面免疫檢查點的表達也是特定微環(huán)境免疫表型的體現(xiàn)，可影響和預(yù)測免疫治療療效。其中，PD-1是研究較多，也是較廣泛的檢查點分子。有研究發(fā)現(xiàn)TME中效應(yīng)性T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）間PD-1表達平衡可預(yù)測PD-1阻斷療法的臨床療效[16]。該研究使用流式細胞術(shù)對TILs進行檢測發(fā)現(xiàn)，PD-1單抗治療有效和無效患者TME中PD-1+CD8+T細胞/PD-1+Tregs細胞的比值差異顯著，其中治療有效患者TME中具有較高的PD-1+CD8+T細胞浸潤，且高表達PD-1的CD8+T細胞具有高親和力的抗原肽；相反，治療無效患者TME中PD-1高表達于效應(yīng)Treg細胞中[16]。另一個新型的免疫檢查點蛋白是T細胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域（T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif domain，TIGHT），其在淋巴細胞，尤其在效應(yīng)CD8+T細胞和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）中高表達[17]。TIGIT可在腫瘤免疫循環(huán)的多個步驟中抑制免疫細胞，當(dāng)NK細胞和T細胞表面的TIGIT與腫瘤細胞表面高表達的脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（poliovirus receptor，PVR，或稱CD155）相結(jié)合時，NK細胞和T細胞的腫瘤細胞殺傷作用被抑制[17]。當(dāng)阻止TIGIT與其配體結(jié)合可恢復(fù)抗腫瘤免疫功能，例如MK-7684是人源化IgG1單克隆抗體，可結(jié)合TIGIT并阻斷其與配體CD112和CD155的相互作用（NCT02964013、NCT04305041）。此外，免疫細胞還可以表達其他抑制性受體，如CTLA-4、T細胞免疫球蛋白 3（T cell immunoglobulin and mucin-containing molecule 3，TIM-3）等[18]，從而導(dǎo)致腫瘤免疫耐藥。THOMMEN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，多個免疫檢查點，如PD-1、TIM-3、CTLA-4和淋巴細胞激活基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）的共表達增加可促進T細胞進行性嚴(yán)重衰竭，進一步介導(dǎo)ICIs耐藥性的產(chǎn)生。綜上可見，這些免疫活化分子和檢查點分子的表達可能代表微環(huán)境特定免疫表型特征，不僅在預(yù)測ICIs治療療效中具有潛在價值，還有助于促進靶向這些分子的免疫治療策略的開發(fā)。

2 TME免疫細胞亞群

2.1 “正性”免疫細胞亞群

不同免疫細胞亞群對ICIs治療療效有重要預(yù)測作用。有研究使用微滴單細胞RNA-seq（droplet singlecell RNA-seq，dscRNA-seq）和配對T細胞受體測序法測序7例患者的30 604個T細胞，以評估人膀胱腫瘤和非惡性組織的T細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中富集有多種克隆擴增狀態(tài)的細胞毒性CD4+T細胞，由表達調(diào)節(jié)或細胞毒性基因的離散細胞群組成，且這些CD4+T細胞可以主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ類依賴性方式殺死自體腫瘤，并被Tregs抑制[20]。該研究還發(fā)現(xiàn)，基因標(biāo)記的細胞毒性CD4+T細胞（包括在增殖或非增殖細胞毒性CD4+T細胞中特異性上調(diào)的基因如ABCB1、APBA2、SLAMF7、GPR18和PEG10等）還能預(yù)測膀胱癌對抗PD-L1的反應(yīng)，并在使用來自阿替利珠單抗治療轉(zhuǎn)移性膀胱癌的單獨Ⅱ期試驗（IMvigor210）中證實，該基因標(biāo)記與炎癥樣本中抗PD-L1治療的臨床反應(yīng)顯著相關(guān)（P=0.037）[20]。

除CD4+T細胞外，還有研究使用單細胞mRNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)分析從而確定了黑色素瘤內(nèi)的兩種主要CD8+T細胞表型：記憶樣和耗竭型[21]，且兩者比例與ICIs治療反應(yīng)密切相關(guān)；進一步研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子7（transcription factor 7，TCF7）選擇性表達于記憶樣CD8+T細胞中，CD8+TCF7+與CD8+TCF7-TILs的比值與接受抗PD-1治療的黑色素瘤患者的緩解率和生存期改善密切相關(guān)[21]。BALATONI等[22]研究發(fā)現(xiàn)TME中11種免疫細胞有7種與伊匹木單抗治療后的OS呈正相關(guān)，包括CD4+T細胞、CD8+T細胞、FOXP3+T細胞、CD20+B 細胞、CD134+細胞、CD137+細胞、NKp46+細胞，且不同部位的不同免疫細胞與臨床結(jié)局的相關(guān)性不同。一項涉及多種類型實體瘤組織樣本的研究也表明，CD8+TILs包括組織駐留記憶T（tissueresident memory T，TRM）細胞亞群在人和小鼠的外周免疫監(jiān)視和病毒免疫中發(fā)揮作用[23]。該研究發(fā)現(xiàn)，TRM細胞的特征性標(biāo)志是表達CD103（整合素αE）且大多與CD69和/或PD-1共表達，并對患者預(yù)后及抗腫瘤免疫治療療效具有潛在的預(yù)測作用，其中TME攜帶更高水平TRM細胞的早期三陰性乳腺癌患者的預(yù)后顯著改善，且對抗PD-1抗體的應(yīng)答率增加[23]。最近一些研究也報道了CD8+T細胞中CD39的表達，并提示其變化或能預(yù)測ICIs治療療效。2018年有研究首次發(fā)現(xiàn)了腫瘤中一群不敏感的旁觀者細胞——CD39-CD8+T細胞[24]，而在1例應(yīng)用帕博利珠單抗治療后快速免疫應(yīng)答的結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)，外周血CD8+TIL CD39表達增高[24]。與此證據(jù)一致，許多研究也將CD39+CD8+TIL描述為腫瘤抗原特異性和反應(yīng)性細胞[25-26]，這些功能與多種腫瘤類型（包括肺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌、頭頸癌和胰腺癌等）中CD103共表達相關(guān)[26-28]。同樣，近期一項研究發(fā)現(xiàn)，接受PD-1/PD-L1抑制劑治療應(yīng)答人群和無應(yīng)答人群中CD39+CD8+T細胞比例差異顯著（28%vs7%，OR=1.250，95%CI：1.044～1.505，P=0.016），且基于mIHC多色熒光分析的CD39+CD8+T細胞比例可有效區(qū)分患者免疫治療反應(yīng)，應(yīng)答組客觀緩解率（objective response rate，ORR）為63.6%，無應(yīng)答組ORR為0[29]。因此，CD39+CD8+T細胞亞群比例可能作為預(yù)測PD-1/PD-L1抑制劑療效的潛在生物標(biāo)志物，但目前研究證據(jù)尚不完全一致，其作用需進一步研究明確。此外，有研究通過單細胞測序探索T細胞亞克隆及其在肺癌中的作用，發(fā)現(xiàn)新抗原負荷與CD45RO+細胞有關(guān)，而與CD3+T細胞和CD8+T細胞密度無關(guān)[30]。因此認為，CD45RO+細胞可能是預(yù)測ICIs治療療效的潛在細胞亞群。

2.2 “負性”免疫細胞亞群

除效應(yīng)免疫細胞外，TME中還存在多種免疫抑制細胞，如Tregs、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）等，它們可以通過表達抑制性受體或分泌免疫抑制細胞因子抑制效應(yīng)免疫細胞增殖、浸潤和活化，從而促進腫瘤免疫逃逸，進而促使腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[31-32]。Tregs是控制自身免疫反應(yīng)的免疫抑制細胞，可通過多種機制抑制Teffs的活化和增殖，如抑制抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）表面的MHC分子和共刺激分子（CD80和CD86）、抑制APC成熟，以及減弱其與T細胞的相互作用等[33]。Tregs還可通過分泌穿孔素和顆粒酶直接殺傷T細胞和APC，通過分泌抑制性細胞因子，如生長轉(zhuǎn)化因子-β（transforming growth factor，TGF-β）、白細胞介素（interleukin，IL）-10、IL-35和耗竭γc細胞因子而抑制T細胞的活化和增殖[34]。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，CD8+CD28-T細胞代表了一群特異性調(diào)節(jié)性T細胞，對效應(yīng)T細胞增殖和細胞毒性有抑制作用；且其絕對計數(shù)降低是PFS（6.6個月vs4.1個月，HR=3.17，P=0.0038）和OS（29.4個月vs9.6個月，HR=3.05，P=0.03）改善的獨立因素[35]。因此，CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞作為一種“負性”免疫細胞亞群值得進一步探索。MDSCs是一類具有強效免疫抑制活性的髓系來源細胞，也是一類調(diào)節(jié)性細胞，可通過產(chǎn)生免疫抑制代謝產(chǎn)物（活性氮氧化物中間體）、免疫抑制性細胞因子（如TGF-β、IL-10）、免疫活性酶[如精氨酸酶（arginase，ARG）、吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）、氨肽酶]和免疫抑制性前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等[36]，促進免疫逃逸、細胞生長、血管生成及侵襲和轉(zhuǎn)移，從而促進腫瘤進展[37]。有研究報道，MDSCs是頭頸癌局部免疫抑制的主要促成因素，可導(dǎo)致患者對ICIs耐藥，而限制MDSCs功能是增強患者對CTLA-4抑制劑反應(yīng)的合理策略[38]。還有研究報道，高腫瘤內(nèi)髓系標(biāo)志物與腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）抗PD-L1治療后中位PFS降低相關(guān)，證實了髓系細胞對ICIs的抑制作用[39]。由于集落刺激因子1（colony-stimulating factor 1，CSF-1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與趨化因子CCL2、CCL5等的作用，TAMs在腫瘤細胞周圍大量浸潤[40]，可通過過表達PD-L1、TGF-β等抑制T細胞的抗腫瘤反應(yīng)，并通過表達趨化因子CCL22促進Tregs細胞積累[41]。在黑色素瘤隊列中也報告了TAMs與抗PD-1應(yīng)答較差的相關(guān)性[42]。

此外，還有研究使用多參數(shù)流式細胞術(shù)對188例ICIs治療的黑色素瘤患者進行了免疫譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后LAG-3+免疫型黑色素瘤患者的結(jié)局較差，中位OS為22.2個月，LAG-3-免疫型黑色素瘤患者中位OS為75.8個月（P=0.031）[43]。與已知臨床預(yù)后標(biāo)志物PD-L1和TMB相比，LAG-3+免疫型是預(yù)測ICIs治療療效和患者臨床結(jié)局的獨立標(biāo)志物[43]。該研究雖是血液樣本，但可能代表了這類免疫細胞亞群對免疫治療的預(yù)測作用，需在未來研究中驗證。總之，TME中的免疫細胞亞群類型對ICIs應(yīng)答有重要影響，在預(yù)測生物標(biāo)志物開發(fā)方面顯示出廣闊前景。

3 TME免疫組庫的多樣性

有效的T細胞應(yīng)答涉及特異性抗原反應(yīng)性T細胞克隆的活化和擴增，因此微環(huán)境免疫組庫（immune repertoire，IR）的多樣性可能與ICIs應(yīng)答相關(guān)。IR是指在任何給定時間，一個個體循環(huán)系統(tǒng)中具有功能多樣性B細胞和T細胞的總和[44]。IR可量化為豐富度和克隆性這兩個指標(biāo)[45]。目前關(guān)于IR的研究結(jié)果仍有爭議，有研究發(fā)現(xiàn)TILs的克隆性與治療前[46]或治療后[47]對ICIs的反應(yīng)呈正相關(guān)。但也有研究顯示，僅治療期間TILs克隆性增加與抗PD-1反應(yīng)相關(guān)[45，48]；還有研究報道，腫瘤內(nèi)T細胞克隆性與免疫治療胰腺導(dǎo)管腺癌患者生存期無關(guān)，而外周T細胞克隆性與PFS和OS呈負相關(guān)[49]。TUMEH等[8]進一步研究了基線TILs TCR庫的范圍，并重點關(guān)注其與腫瘤特異性免疫應(yīng)答的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與基線和給藥后活檢的TCR克隆性比較，有腫瘤特異性反應(yīng)的患者樣本在抗PD-1治療后擴增的克隆是前者的10倍以上。值得注意的是，基線TCR克隆性與TILs密度并不高度相關(guān)，說明一些具有腫瘤抗原特異性的限制性TCR克隆性患者即使TILs密度較低，仍可能從抗PD-1治療中獲益?？紤]到難以分選腫瘤組織中的PD-1+CD8+T細胞，一項基于兩個獨立的患者隊列的研究證實，TCR庫多樣性和外周PD-1+CD8+T細胞的克隆性可作為NSCLC患者ICIs治療后臨床結(jié)局的非侵入性預(yù)測因子[50]。采用IR測序（IR-Seq）5′RACE或多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法擴增TCR或B細胞受體（B cell receptor，TCR）的互補決定區(qū)（complementarity-determining region，CDR），然后進行高通量測序，可用于研究免疫系統(tǒng)的多樣性及免疫庫與疾病之間的相關(guān)性，例如追蹤重排T細胞克隆的進化并預(yù)測患者療效?？傊琓ME免疫組庫多樣性作為ICIs治療療效標(biāo)志物的觀點有待在更大規(guī)?；颊呷褐序炞C。

4 TME炎癥基因表達譜

炎癥基因表達特征可提供比單個分子更加全面立體的TME信息，從而有效預(yù)測免疫治療療效。通過免疫基因表達譜更廣泛地評估TME內(nèi)主動免疫應(yīng)答能有效地預(yù)測ICIs策略的臨床獲益。有研究顯示，包含外周血T細胞特征基因（包括HLA-DOA、GPR18和STAT1）及腫瘤相關(guān)巨噬細胞M1特征基因（包括CBLB、CCR7、CD27、CD48、FOXO1、FYB、HLA-B、HLA-G、IFIH1、IKZF4、LAMP3、NFKBIA、SAMHD1）的基因表達譜在預(yù)測NSCLC持久臨床獲益和PFS方面顯示出良好的敏感性和特異性，其預(yù)測性能優(yōu)于已知生物標(biāo)志物[51]。在Ⅱ期臨床試驗中，在治療開始前和治療開始后3周，對45例黑色素瘤患者采集的腫瘤活檢組織進行基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)對伊匹木單抗有反應(yīng)的患者中22個免疫相關(guān)基因的表達至少增加2.5倍，包括細胞毒性T細胞標(biāo)志物（如CD8A、穿孔素1、顆粒酶B）、Th1細胞因子或趨化因子、MHC-Ⅱ及其他免疫相關(guān)基因（如NKG7、IDO1）[52]。ASCIERTO 等[53]在治療后1～5年的復(fù)發(fā)性乳腺癌患者和7年以上無復(fù)發(fā)的患者中篩選了多個免疫相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)5個基因（IGK、GBP1、STAT1、IGLL5和OCLN）在無復(fù)發(fā)生存患者中高度過表達。還有研究建立了由40個基因（4個10-gene signature）組成的TIL特征評分，這4個基因標(biāo)記分別被用于評估淋系、髓系、基質(zhì)和腫瘤細胞含量，且發(fā)現(xiàn)TIL評分和淋巴特征評分均與免疫治療的緩解率相關(guān)，將淋巴標(biāo)志物或TIL與TMB結(jié)合，得到的評分在預(yù)測免疫治療反應(yīng)方面更高效[54]。一項涉及20種腫瘤包含313例患者的回顧性研究分析了PD-1抑制劑療效與患者腫瘤炎癥基因特征的相關(guān)性，根據(jù)18個炎癥基因的表達情況，基于相關(guān)算法計算GEPs評分，發(fā)現(xiàn)GEPs評分高的患者亞組ORR更高，PFS更長[55]。此外，干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）誘導(dǎo)的免疫基因標(biāo)簽可能是預(yù)測ICIs治療臨床獲益的有效生物標(biāo)志物。有研究結(jié)合基于10個基因標(biāo)簽的多個免疫變量開發(fā)了IFN-γ評分，并在62例黑色素瘤患者中擴展到28個基因標(biāo)記，包括編碼IFN-γ、顆粒酶A/B、穿孔素1、IDO1和其他免疫相關(guān)基因，兩種基因評分均顯示與最佳總緩解率和PFS顯著相關(guān)；而基于受試者工作特征曲線優(yōu)化的IFN-γ評分臨界值對應(yīng)答者的陽性預(yù)測值為59%，對非應(yīng)答者的陰性預(yù)測值為90%[56]。

除炎癥基因表達譜外，研究者也揭示了與先天免疫治療耐藥相關(guān)的基因表達譜，這些基因同樣有助于預(yù)測免疫治療療效。BU等[57]研究顯示，在接受抗PD-1治療的無反應(yīng)黑色素瘤患者中，與傷口愈合、血管生成、缺氧、TGF-β信號傳導(dǎo)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及細胞黏附和細胞外基質(zhì)組織相關(guān)的基因集表達上調(diào)，且無應(yīng)答腫瘤中表達的E-cadherin基因（又稱CDH1基因）較應(yīng)答腫瘤少；該研究基于此總結(jié)了先天PD-1耐藥基因標(biāo)記（innate PD-1 resistance，IPRES）的關(guān)鍵特征，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達上調(diào)（AXL、ROR2、WNT5A、LOXL2、TWIST2、TAGLN、FAP）、VEGF通路基因表達上調(diào)（IL10、VEGFA、VEGFC）、巨噬細胞趨化性基因表達上調(diào)（CCL2、CCL7、CCL8及CCL13）[57]。而這些IPRES可能對預(yù)測免疫治療療效不佳有潛在作用。但值得注意的是，該研究同時也顯示超過30%表達IPRES標(biāo)記的黑色素瘤患者對CTLA-4阻斷劑（易普利姆瑪單抗）有反應(yīng)，表明IPRES標(biāo)記并不預(yù)示對每種免疫治療都有耐藥性[57]。因此，設(shè)計靶向IPRES標(biāo)記免疫逃逸特征的PD-1聯(lián)合療法可能是克服多種腫瘤類型對PD-1單藥治療耐藥的方法，有望為更多患者帶來腫瘤免疫治療臨床獲益。

5 腫瘤和微環(huán)境免疫預(yù)測標(biāo)志物聯(lián)合檢測

有研究[58]收集1 000多例接受ICIs治療的腫瘤樣本，對腫瘤和微環(huán)境中的T細胞進行全外顯子組和轉(zhuǎn)錄組測序分析，以驗證可用于預(yù)測ICIs治療效果的生物標(biāo)志物。該研究結(jié)果顯示，在免疫浸潤標(biāo)志物中，CXC 趨化因子配體 9[chemokine（C-X-C motif）ligand 9，CXCL9]是最強的預(yù)測因子，其次是CD8A、T細胞炎癥GEPs和PD-L1；對CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞單細胞RNA的測序結(jié)果顯示，CCR5和CXCL13是ICIs治療療效敏感的預(yù)測因子[58]。盡管目前已鑒定出了多個預(yù)測因子，但對ICIs治療臨床反應(yīng)的數(shù)據(jù)表明，任何單一預(yù)測生物標(biāo)志物均存在局限性，不能有效識別獲益人群。而利用聯(lián)合檢測或建立有效預(yù)測模型可能提高預(yù)測靈敏度，并有效捕獲腫瘤患者的免疫狀態(tài)。腫瘤和微環(huán)境相依相行、相互作用并共同影響免疫治療療效反應(yīng)。因此，聯(lián)合檢測腫瘤和微環(huán)境標(biāo)志物可能提高預(yù)測腫瘤對ICIs治療應(yīng)答的準(zhǔn)確性。YU等[59]研究發(fā)現(xiàn)，與 CD8+TILs、PD-L1和TMB三種預(yù)測標(biāo)志物中任一種或任兩種生物標(biāo)志物相比，三者復(fù)合變量與OS和PFS改善相關(guān)。也有研究采用多平臺免疫基因組分析轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)對ICIs應(yīng)答良好的患者，腫瘤細胞中AT豐富結(jié)構(gòu)域1A基因（AT-rich interactive domain 1A，ARID1A）突變及腫瘤周圍免疫細胞中免疫細胞因子CXCL13表達較為豐富，隨后在兩個獨立的驗證隊列（CheckMate275和IMvigor210）中證實兩者聯(lián)合能作為預(yù)測ICIs治療反應(yīng)生物標(biāo)志物時也顯示出更顯著的OS改善[60]，說明了開發(fā)既考慮腫瘤細胞因素又考慮微環(huán)境免疫細胞因素的組合生物標(biāo)志物的重要性。同樣，一項涵蓋22種癌癥類型包含超過300例患者的4項臨床試驗也證實TMB和T細胞炎性GEPs在識別PD-1抗體應(yīng)答和無應(yīng)答者方面具有聯(lián)合預(yù)測效用，顯示了同時捕獲新抗原性和T細胞活化的獨特特征[61]。

多組學(xué)聯(lián)合分析也有助于提高預(yù)測標(biāo)志物的準(zhǔn)確性。有研究結(jié)合微環(huán)境免疫因子與放射組學(xué)開發(fā)了CD8細胞的放射組學(xué)特征評分，并通過TCGA數(shù)據(jù)集中CD8細胞的基因表達標(biāo)記進行驗證[62]。該研究顯示，在假定免疫表型的隊列中，這一標(biāo)記能夠區(qū)分炎性腫瘤和免疫沙漠腫瘤（P＜0.0001）；其中在接受抗PD-1/PD-L1治療患者中，較高的基線放射學(xué)評分（相對于中位數(shù)）與3個月和6個月時達ORR患者比例較高相關(guān)，多因素分析也顯示高基線放射組學(xué)評分與OS改善顯著相關(guān)（P=0.0022）[62]?？梢?，CD8細胞的放射組學(xué)特征在3個獨立的隊列中均得到驗證，因此該成像預(yù)測因子為預(yù)測腫瘤的免疫表型和接受抗PD-1/PD-L1治療患者臨床結(jié)局提供了一種有前景的方法。JIANG等[63]設(shè)計了一種全新的計算架構(gòu)——腫瘤免疫功能障礙和排斥評分（tumor immune dysfunction and exclusion，TIDE），該評分主要結(jié)合TMB、PD-L1水平和IFN-γ。該研究通過對TCGA和PRECOG（基因組圖譜預(yù)測臨床結(jié)局）數(shù)據(jù)庫進行分析（n=33 197），揭示了不同免疫細胞類型腫瘤浸潤水平對患者OS的影響，同時證實TIDE評分較既往單一生物標(biāo)志物能夠更好地評估抗PD-1和抗CTLA-4的治療療效，是已有候選生物標(biāo)志物中ICIs治療療效的最佳預(yù)測因子[63]?？傊?，多個獨立預(yù)測標(biāo)志物的聯(lián)合檢測不僅可以擴大受益人群，而且對于相互作用的標(biāo)志物，還可以根據(jù)每個因素的不同影響權(quán)重建立基于生物信息學(xué)的預(yù)測模型，以綜合評估，提高篩查受益人群的準(zhǔn)確性。此外，如何更好地利用各種標(biāo)志物的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并達到最佳成本效益，是構(gòu)建綜合預(yù)測模型時需考慮的問題。未來，通過大樣本分析腫瘤和微環(huán)境免疫特征，利用機器學(xué)習(xí)和人工智能構(gòu)建多變量模型進行免疫治療療效預(yù)測，將有助于構(gòu)建腫瘤精準(zhǔn)治療新模式。

6 小結(jié)與展望

近年來，ICIs療效預(yù)測標(biāo)志物的開發(fā)從腫瘤細胞內(nèi)的分子逐漸拓展到TME中各種分子和細胞，人們也進一步認識到TME中免疫和炎癥因素對ICIs治療應(yīng)答的關(guān)鍵作用。從TIME角度出發(fā)，對ICIs療效預(yù)測生物標(biāo)志物的探索有助于闡明免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控與腫瘤間存在的復(fù)雜相互作用，更全面地反映ICIs治療對腫瘤影響的復(fù)雜性和多樣性。未來，隨著多重免疫組化染色、高通量測序、微陣列等高新技術(shù)研究的發(fā)展，越來越多的潛在微環(huán)境生物標(biāo)志物將可在基因組規(guī)模上被廣泛篩選，多種蛋白質(zhì)和細胞群也可被量化。但是，關(guān)于TME標(biāo)志物的探索仍存在諸多挑戰(zhàn)。首先，目前研究多為探索性、回顧性研究數(shù)據(jù)，缺乏前瞻性研究驗證，如何有效應(yīng)用于臨床實踐還存在挑戰(zhàn)；然后，對單一生物標(biāo)志物的認知有待進一步增強，標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)志物精準(zhǔn)檢測平臺亟需探索；最后，鑒于各種新型生物標(biāo)志物的出現(xiàn)及單一標(biāo)志物的局限性，結(jié)合腫瘤、TME及宿主等多方面因素建立復(fù)合預(yù)測模型以全面捕獲機體免疫狀態(tài)可能是提高ICIs療效預(yù)測的有效策略。目前，使用機器深度學(xué)習(xí)和人工智能探索ICIs治療療效和耐藥性生物標(biāo)志物已逐步走向臨床實踐。未來，隨著對這些生物標(biāo)志物研究的深入和數(shù)據(jù)的積累，有望建立更完整的預(yù)測體系，從而在分子定義的患者隊列中加強免疫監(jiān)測和疾病控制。