長葉紫珠化學(xué)成分及抗炎活性研究

趙 璐，徐 凡，易僑祺，張?zhí)依?，王紅剛

廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006

長葉紫珠(CallicarpalongifoliaLamk.)，為馬鞭草科紫珠屬植物，產(chǎn)于我國臺灣、廣東、云南，生于海拔1 400 m下的山坡疏林中，在印度尼西亞、菲律賓、馬來西亞、越南、緬甸、印度也有分布[1]。長葉紫珠別名老哈眼，在我國福建地區(qū)其常被當(dāng)作民間草藥使用，應(yīng)用歷史悠久且有較好的療效。據(jù)《福建民間草藥》和《閩南民間草藥》記載，長葉紫珠又名山枇杷、牛舌癀，《中國藥植圖鑒》中又稱其為野枇杷，味苦辛，性溫，有微毒。具有祛風(fēng)除濕、活血止血、清痰鎮(zhèn)咳、解毒殺蟲的功效，常用作治療風(fēng)濕痛、吐血、風(fēng)寒咳嗽、蟲證等癥。紫珠屬植物當(dāng)中的許多植物在古代民間的常用草藥以及各地民族藥書籍中都有所記載，該屬在國內(nèi)共46種植物，其中20多種植物的清熱、祛風(fēng)濕、止血等藥效效果十分明顯，現(xiàn)代研究報道紫珠屬植物具有抗炎[2-6]、止血[7]、鎮(zhèn)痛[8,9]、抗氧化[10-12]、改善記憶障礙[13,14]等藥理作用。

作為一種民間用藥，長葉紫珠應(yīng)用歷史悠久、療效顯著，但一直以來有關(guān)長葉紫珠的研究報道卻很稀少。本文選取紫珠屬植物長葉紫珠作為研究對象，在紫珠屬植物的研究基礎(chǔ)上，以期從長葉紫珠中尋找出具有良好抗炎效果的活性成分，為抗炎藥物的開發(fā)提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

核磁共振儀(AVANCE III 500MHz，瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司)、高分辨質(zhì)譜(maXis impact，德國Bruker公司)、半制備高效液相色譜儀(北京賽譜銳思科技有限公司)。

硅膠(100～200、200～300目，青島海洋化工有限公司)；MCI(三菱化學(xué)公司)；ODS(日本YMC公司)；Sephadex LH-20(北京賽譜銳思科技有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)；甲醇(瑞典歐普森試劑公司，色譜級)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(美國Gibco)；二甲基亞砜(美國Mpbio)；CCK8細(xì)胞計數(shù)試劑盒(美國APExBIO)；地塞米松、脂多糖(LPS)(美國Sigma)；Griess試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

長葉紫珠CallicarpalongifoliaLamk.采集于廣東藥科大學(xué)大學(xué)城校區(qū)中藥學(xué)院藥用植物園，經(jīng)中國科學(xué)院華南植物園葉華谷教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物長葉紫珠(CallicarpalongifoliaLamk.)的枝葉。憑證標(biāo)本(標(biāo)本號201980723)存放于廣東藥科大學(xué)中藥標(biāo)本館。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取與分離

長葉紫珠干燥枝葉5.5 kg，粉碎成粗粉，以甲醇冷浸方式提取5次(前3次冷浸提取48 h，后2次冷浸提取72 h)，每次約20 L，合并甲醇提取液，減壓濃縮，回收溶劑后得甲醇浸膏888.65 g。將甲醇浸膏用溫水進(jìn)行分散(浸膏∶水 ≈ 1∶1，V/V)后，分別用石油醚(6×1.2 L)、乙酸乙酯(6×1.2 L)、正丁醇(6×1.2 L)依次萃取，再分別合并有機(jī)層并減壓濃縮，最終得石油醚浸膏222.15 g，乙酸乙酯浸膏271.02 g，正丁醇浸膏182.12 g。

將乙酸乙酯浸膏(271.02 g)以硅膠為固定相，以二氯甲烷-甲醇(200∶1、100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1，V/V)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢查后合并相同部分，得到16個組分(Y1～Y16)。Y3組分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(1∶1，V/V)洗脫，得到13個組分(Y3.1～Y3.13)；Y3.4組分經(jīng)MCI及數(shù)次Sephadex LH-20凝膠柱分離純化后，得到化合物9(99.2 mg)。Y4組分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離后，得到5個組分(Y4.1～Y4.5)；Y4.5組分再次經(jīng)硅膠、MCI柱分離純化后，得到化合物3(7.0 mg)。Y5組分經(jīng)硅膠柱層析分離，使用石油醚-乙酸乙酯(200∶1、100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、9∶1、7∶1，V/V)以及純甲醇洗脫，得8個組分(Y5.1～Y5.8)。Y5.3組分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離后，得到6個組分(Y5.3.1～Y5.3.6)；Y5.3.3組分經(jīng)半制備高效液相色譜純化后，得到化合物2(85%甲醇-水，tR=12.032 min，5.0 mg)；Y5.4組分經(jīng)MCI、Sephadex LH-20凝膠柱分離純化后，得化合物4(2.3 mg)。Y7組分經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(200∶1、100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1，V/V)以及純甲醇洗脫后，得到8個組分(Y7.1～Y7.8)； Y7.3組分經(jīng)重結(jié)晶純化后得到化合物5(111.9 mg)；Y7.4組分經(jīng)MCI、凝膠柱色譜，以及半制備高效液相色譜分離純化后，得到化合物10(80%甲醇-水，tR=15.408 min，3.1 mg)；Y7.6組分經(jīng)MCI柱色譜分離后得到12個組分(Y7.6.1～Y7.6.12)。其中Y7.7組分經(jīng)MCI、硅膠和多次凝膠柱色譜分離后，得到化合物1(205.4 mg)和6(5.0 mg)。Y10組分則經(jīng)重結(jié)晶純化后得到化合物7(92.6 mg)。

正丁醇浸膏(182.12 g)，以MCI為固定相，以甲醇-水(10%→100%)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢查，合并相同部分后，得到4個組分Fr.W1～Fr.W4。Fr.W 2組分經(jīng)半制備液HPLC分離純化后，得到化合物8(42%甲醇水，tR=17.036 min，25.0 mg)。

1.2.2 抗炎活性研究

用CCK8法測定RAW 264.7細(xì)胞在不同濃度化合物環(huán)境下的存活率來評價對應(yīng)化合物的細(xì)胞毒性作用。根據(jù)細(xì)胞毒性測試結(jié)果對本實驗化合物的給藥濃度進(jìn)行設(shè)計。

將處于對數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7稀釋并接種于96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞密度4×104個/孔，孔板邊緣加入100 μL PBS，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行下一步實驗。將不做處理的完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對照，將僅加入100 ng/mL LPS的細(xì)胞設(shè)為模型組。以100 ng/mL LPS及0.5 μmol/L地塞米松作為陽性組，以不同濃度化合物及100 ng/mL LPS作為實驗組。加入藥物后，培養(yǎng)18 h。分別取各組細(xì)胞上清液用Griess法檢測NO釋放量水平。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色棒狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z303.233 0 [M+H]+(calcd for C20H31O2，303.231 9)。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：2.24(1H，m，H-1a)，1.34(1H，m，H-1b)，1.67(2H，m，H-2)，1.56(1H，m，H-3a)，1.37(1H，m，H-3b)，1.67(1H，m，H-5)，1.85(2H，m，H-6)，2.79(2H，m，H-7)，3.20(1H，p，J= 6.9 Hz，H-15)，1.19(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.20(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，3.46(1H，d，J= 11.1 Hz，H-18a)，3.13(1H，d，J= 11.1 Hz，H-19b);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：39.9(C-1)，19.8(C-2)，36.3(C-3)，38.4(C-4)，45.0(C-5)，20.1(C-6)，30.4(C-7)，127.0(C-8)，149.2(C-9)，38.9(C-10)，111.1(C-11)，153.2(C-12)，133.3(C-13)，127.2(C-14)，27.2(C-15)，23.2(C-16、17)，72.0(C-18)，18.0(C-19)，25.7(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)進(jìn)行對照，同時經(jīng)二維核磁譜圖進(jìn)行驗證，確定為文獻(xiàn)[15]報道的化合物18-hydroxyferruginol 。

化合物2透明油狀液體；HR-EI-MS：m/z287.237 7 [M+H]+(calcd for C20H31O，287.236 9)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.15(1H，d，J= 8.1 Hz，H-12)，6.94(1H，dd，J= 8.2，2.0 Hz，H-11)，6.85(1H，d，J= 2.0 Hz，H-14)，3.45(1H，d，J= 11.0 Hz，H-18a)，3.12(1H，d，J= 11.0 Hz，H-18b)，2.90～2.83(1H，m，H-6a)，2.83～2.76(1H，m，H-6b)，2.35～2.27(1H，m，H-15)，1.89～1.78(2H，m，H-7)，1.70～1.67(2H，m，H-2)，1.55(1H，m，H-5)，1.40～1.29(2H，m，H-3)，1.24～1.19(9H，m，H-16，17，20)，0.88(3H，d，H-19);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：148.6(C-9)，146.6(C-13)，135.9(C-8)，127.7(C-14)，125.2(C-12)，124.6(C-11)，72.0(C-18)，45.0(C-5)，39.8(C-1)，38.9(C-4)，38.4(C-10)，36.3(C-3)，34.8(C-15)，31.1(C-7)，25.8(C-20)，24.5(C-16，C-17)，19.9(C-2)，19.8(C-6)，18.0(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道的dehydroabietanol數(shù)據(jù)一致。

化合物3白色羽狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z427.380 2 [M+H]+(calcd for C30H51O，427.393 4)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.15(1H，t，J= 3.7 Hz，H-12)，3.25(1H，dd，J= 11.1，5.2 Hz，H-3)，2.02～1.86(3H，m，H-11，H-18)，1.09，1.03，1.02，0.98，0.94，0.82(3H×6，s，H-22～27)，0.82(6H，s，H-2,30);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：139.8(C-13)，124.6(C-12)，79.2(C-3)，59.2(C-18)，55.4(C-5)，47.9(C-9)，42.3(C-14)，41.7(C-1)，40.2(C-8)，39.8(C-19)，39.8(C-20)，39.0(C-22)，38.9(C-17)，37.1(C-4)，33.9(C-10)，33.1(C-7)，31.4(C-21)，29.9(C-27)，28.9(C-23)，28.3(C-2)，27.4(C-16)，26.8(C-11)，23.5(C-15)，23.4(C-28)，21.6(C-29)，18.5(C-6)，17.6(C-26)，17.0(C-30)，15.8(C-24)，15.8(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道的neolupenol數(shù)據(jù)一致。

化合物4黃色針狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z329.102 4 [M+H]+(calcd for C18H17O6，329.102 0)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.65(1H，s，5-OH)，8.07(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′和H-6′)，7.02(2H，d，J= 9.0 Hz，H-3′和H-5′)，6.44(1H，d，J= 2.2 Hz，H-8)，6.35(1H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，3.89(3H，s，-OCH3)，3.87(3H，s，-OCH3)，3.85(3H，s，-OCH3);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：178.9(C-4)，165.6(C-7)，162.2(C-4′)，161.8(C-5)，156.9(C-8a)，156.1(C-2)，139.0(C-3)，130.3(C-2′和C-6′)，123.0(C-1′)，114.2(C-3′和C-5′)，106.2(C-4a)，98.0(C-6)，92.3(C-8)，60.3(3-OCH3)，55.9，55.6 (4′，7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道的kaempferol 3,4′,7-O-trimethylether數(shù)據(jù)一致。

化合物5黃色針狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z389.123 3 [M+H]+(calcd for C20H21O8，389.123 1)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：12.91(1H，s，5-OH)，8.02(1H，dd，J= 8.5，2.0 Hz，H-6′)，7.98(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，7.29(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.80(1H，s，H-8)，4.28(6H，s，3′，4′-OCH3)，4.26(3H，s，7-OCH3)，4.22(3H，s，6-OCH3)，4.17(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：155.9(C-2)，138.9(C-3)，178.9(C-4)，152.9(C-5)，132.4(C-6)，158.8(C-7)，90.4(C-8)，152.3(C-9)，106.6(C-10)，123.0(C-1′)，111.4(C-2′)，148.9(C-3′)，151.5(C-4′)，111.0(C-5′)，122.2(C-6′)，60.2(3-OCH3)，60.9(6-OCH3)，56.4(7-OCH3)，56.1(3′-OCH3)，56.1(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道的artemein基本一致。

化合物6黃色針狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z359.234 0 [M+H]+(calcd for C19H19O7，359.234 1)1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.61(1H，s，5-OH)，7.71(1H，J= 2.0 Hz，H-6′)，7.67(1H，dd，J= 8.4，2.0 Hz，H-2′)，7.05(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.50(1H，d，J= 1.7 Hz，H-3)，6.01(1H，s，H-6)，3.99(3H，s，-OCH3)，3.96(3H，s，-OCH3)，3.92(3H，s，-OCH3)，3.86(3H，s，OCH3);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：179.1(C-4)，158.9(C-2)，156.1(C-9)，152.9(C-7)，152.5(C-4′)，148.5(C-3′)，146.5(C-5′)，138.9(C-8)，132.5(C-1)，122.8(C-6′)，122.6(C-10)，114.7(C-2′)，111.1(C-5′)，106.7(C-3)，90.5(C-6)，61.0(7-OCH3)，60.3(8-OCH3)，56.5(3′-OCH3)，56.3(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道的5-羥基-7,8,3′,4′-四甲氧基黃酮數(shù)據(jù)一致。

化合物7黃色針狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z345.096 5 [M+H]+(calcd for C18H17O7，345.096 9)；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：12.72(1H，s，5-OH)，9.11(1H，s，-OH)，8.05(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′，H-6′)，7.02(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，H-5′)，6.80(1H，s，8-H)，3.98(3H，s，7-OCH3)，3.88(3H，s，3-OCH3)，3.80(3H，s，6-OCH3);13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：179.9(C-4)，161.0(C-42′)，160.2(C-7)，157.1(C-2)，153.7(C-5)，153.2(C-9)，139.2(C-3)，133.2(C-6)，131.3(C-22′)，129.4(C-62′)，122.7(C-12′)，116.9(C-32′)，116.5(C-52′)，107.1(C-10)，91.7(C-8)，60.6(6-OCH3)，60.2(3-OCH3)，56.8(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道的penduleti數(shù)據(jù)一致。

化合物8紅棕色粉末；HR-EI-MS：m/z625.213 9 [M+H]+(calcd for C29H37O15，625.212 7)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.62(1H，d，J= 15.9 Hz，H-β′′′)，7.08(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′′′)，6.98(1H，dd，J= 8.2，2.1 Hz，H-6′′′)，6.80(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5′′′)，6.72(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2)，6.70(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，6.59(1H，dd，J= 8.0，2.1 Hz，H-6)，6.30(1H，d，J= 15.9 Hz，H-α′′′)，5.21(1H，d，J= 1.8 Hz，H-1′′)，4.94(1H，t，J= 9.5 Hz，H-6′)，4.40(1H，d，J= 7.9 Hz，H-1′)，4.07～3.41(10H，m，H-α、2′、3′、4′、5′、2′′、3′′、4′′、5′′)，2.87～2.77(2H，m，H-β)，1.11(3H，d，J= 6.2 Hz，H-6′′);13C NMR(125 MHz，C5D5N)δ：167.6(C=O)，151.1(C-4′′′)，148.2(C-β′′′)，147.7(C-3′′′)，147.3(C-3)，146.1(C-4)，130.9(C-1)，127.5(C-1′′′)，122.8(C-6′′′)，121.0(C-6)，118.0(C-5)，117.3(C-5′′′)，117.0(C-2)，116.3(C-2′′′)，115.3(C-α′′′)，104.7(C-1′)，103.6(C-1′′)，81.1(C-3′)，76.9(C-4′)，76.4(C-2′)，74.5(C-4′′)，73.1(C-2′′)，73.1(C-3′′)，71.8(C-α)，70.8(C-5′)，70.7(C-5′′)，62.6(C-6′)，36.6(C-β)，19.7(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報道的毛蕊花糖苷數(shù)據(jù)一致。

化合物9透明油狀物；C24H38O4，ESI-MS：m/z391.8 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.70(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-2，5)，7.53(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-3，4)，4.26～4.17(4H，m，3′，3′′)，1.68(2H，m，H-4′，4′′)，1.42(4H，m，H-5′，5′′)，1.37～1.23(12H，m，H-6′，6′′，7′，7′′，8′，8′′)，0.91～0.89(6H，m，H-12′，12′′);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：167.9(C-1′，1′′)，132.6(C-1，6)，131.0(C-3，4)，129.0(C-2，5)，68.3(3′，3′′)，38.9(4′，4′′)，30.5(C-11′，11′′)，29.8，29.1(C-9，9′)，23.9(C-5′，5′′)，23.1(C-6′，6′′)，14.2(C-10′，10′′)，11.1(12′，12′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報道的鄰苯二甲酸-二-(2-乙基己基)酯數(shù)據(jù)基本一致。

化合物10透明油狀物；HR-EI-MS：m/z279.159 0 [M+H]+(calcd for C16H23O4，279.159 1)；1H NMR(500 MHz，CD3OD )δ：7.75(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-3，6)，7.64(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-4，5)，4.32(4H，t，J= 6.6 Hz，H-8，8′)，1.75(4H，m，H-9，9′)，1.53～1.44(4H，m，H-10，10′)，1.01(6H，t，J= 7.4 Hz，H-11，11′);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：169.3(C-7，7′)，133.6(C-1，2)，132.4(C-4，5)，129.9(C-3，6)，66.7(C-8，8′)，31.7(C-9，9′)，20.3(C-10，10′)，14.0(C-11，11′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報道的鄰苯二甲酸二丁酯的數(shù)據(jù)一致。

2.2 抗炎活性結(jié)果

所述單體化合物的抗炎活性測定結(jié)果顯示，化合物1、2、4、10具有一定的抑制NO生成作用，其IC50值分別為25.2、34.6、109.6、104.8 μmol/L。其中，兩個松香烷型二萜(化合物1、2)較其他化合物有著更好的活性效果，而化合物5、8、9均未表現(xiàn)出顯著的抑制NO生成作用。

3 結(jié)論

本實驗從長葉紫珠中分離并鑒定出10個化合物，包括二萜類化合物、三萜類化合物、黃酮類化合物、苯乙醇苷類化合物、芳香族化合物。10個化合物均為首次從長葉紫珠中分離得到。抗炎活性實驗結(jié)果表明，部分化合物具有一定的抗炎活性，這提示我們長葉紫珠具有較大的被開發(fā)利用的潛能。通過對長葉紫珠的化學(xué)成分及抗炎活性進(jìn)行研究，為明晰長葉紫珠化學(xué)的成分構(gòu)成及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)，同時也為長葉紫珠的開發(fā)利用提供一定參考依據(jù)。