肝臟細(xì)胞自噬對肝纖維化的影響研究進展*

張 喆 朱 銳 秦仁杰△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院體檢科，武漢 430014 2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022

細(xì)胞自噬對于維持細(xì)胞、組織及器官的穩(wěn)態(tài)具有重要作用，并與多種病理生理過程密切相關(guān)。肝臟接受著肝門靜脈的灌注，容易受到各種有害物質(zhì)的損傷，而細(xì)胞自噬在降低肝臟損傷、調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[1]。肝纖維化是由慢性肝損傷導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蓄積的過程，造成這一病理改變的常見誘因有病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎和自身免疫性疾病等[2]，多種細(xì)胞包括肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)、浸潤的免疫細(xì)胞、肝實質(zhì)細(xì)胞等都參與了肝纖維化過程。自噬在肝纖維化過程中亦具有調(diào)節(jié)作用，其中HSC的自噬可以促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[3]，而肝細(xì)胞的自噬則被認(rèn)為可減少炎癥、抑制肝纖維化。自噬對肝纖維化的調(diào)節(jié)是雙向且復(fù)雜的，現(xiàn)本文對肝臟中不同細(xì)胞的自噬對肝纖維化的影響進行綜述如下。

1 自噬的概述

“自噬”一詞來自于希臘語，直譯是“自我吞噬“的意思，是真核生物發(fā)展中一種進化上高度保守并受嚴(yán)格調(diào)控的過程[4]。Christian de Duve最早在1955年發(fā)現(xiàn)了溶酶體，并于1963年定義了自噬：即將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)輸送至溶酶體或液泡進行降解的細(xì)胞過程[5]。細(xì)胞自噬具有重要的生理作用，包括對物質(zhì)循環(huán)利用以適應(yīng)代謝壓力，清除細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊的蛋白及受損的細(xì)胞器等潛在有害物質(zhì)[6]。自噬發(fā)生紊亂將導(dǎo)致多種疾病，如腫瘤、帕金森病、克羅恩病等[7]。

自噬受到多種自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，ATG)的調(diào)節(jié)，其過程可大致概括如下：細(xì)胞受外界刺激于胞內(nèi)形成自噬泡，接著Atg5-Atg12-Atg16 L復(fù)合物形成并與自噬泡融合，隨后微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)由可溶解形式(LC3-Ⅰ)轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄问?LC3-Ⅱ)并與自噬泡結(jié)合形成自噬小體，最后自噬小體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，并對其內(nèi)容物進行降解[8]。根據(jù)降解的底物不同又可分為選擇性自噬和非選擇性自噬。選擇性自噬中根據(jù)來自的細(xì)胞組分不同又可分為線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、鐵蛋白自噬等[9]。肝臟一方面接受著門靜脈運輸來的可能包含炎性物質(zhì)的血液，且對嗜肝病毒十分敏感，容易受各種代謝產(chǎn)物、毒物的損傷，另一方面肝細(xì)胞周轉(zhuǎn)率較低，容易產(chǎn)生毒素堆積，需要通過自噬以減少細(xì)胞副產(chǎn)物的產(chǎn)生，因此自噬對于維持肝臟穩(wěn)態(tài)意義重大[10]。

2 肝纖維化的概述

肝纖維化是肝臟對各種原因所致肝損傷的病理改變，以ECM蓄積為主要特點。若肝損傷是急性、暫時的，纖維化可逐漸被吸收而恢復(fù)成為正常的肝臟結(jié)構(gòu)；但若損傷是慢性、持續(xù)的，ECM則會持續(xù)積累，部分纖維化會形成瘢痕組織代替肝實質(zhì)，造成不可逆的肝纖維化，最終可發(fā)展為肝硬化、肝衰竭甚至肝癌[11]。

HSC占肝臟固有細(xì)胞總數(shù)的15%，其受損傷刺激后會從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)，分化出具有增殖、遷移特性的肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞通過分泌ECM蛋白，包括膠原蛋白、層黏連蛋白和纖維連接蛋白等，以及ECM相關(guān)細(xì)胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)等，共同參與纖維化過程，可以說HSC是肝纖維化的主要促成者[12]。除HSC外，多種細(xì)胞均參與了肝纖維化過程，如炎性浸潤的巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)以及一種反應(yīng)性導(dǎo)管細(xì)胞(reactive ductular cells，RDC)等，這些細(xì)胞的自噬對肝纖維化均有調(diào)節(jié)作用[13]。

3 不同細(xì)胞自噬對肝纖維化的影響

3.1 HSC自噬

肝損傷過程中，受損的肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞等可通過旁分泌血小板生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、TGF-β等細(xì)胞因子激活HSC，促進其分化成為分泌基質(zhì)蛋白的肌成纖維細(xì)胞，這是肝纖維化的主要原因。有研究[14]應(yīng)用四氯化碳(CCl4)和硫代乙酰胺(TAA)誘導(dǎo)肝損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活化的HSC發(fā)生了自噬。隨后通過敲除Atg7抑制HSC的自噬能減少基質(zhì)蓄積和纖維化，提示HSC的自噬可以促進肝纖維化的進程。另外HSC細(xì)胞質(zhì)中含有大量脂滴[15]，HSC自噬可能促進了脂滴分解成游離脂肪酸，為其激活、分化及分泌ECM提供了足夠的能量，進而促進肝纖維化。目前認(rèn)為脂滴的流失是HSC激活的特征，但有研究[16]通過誘導(dǎo)HSC激活發(fā)現(xiàn)其胞質(zhì)內(nèi)脂滴含量變化不大，認(rèn)為脂滴對于激活HSC并造成纖維化的意義有待商榷。此外，有研究[17]表明HSC中維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)配體降低TGF-β/SMAD3靶基因表達并抑制纖維化。另有研究[18]發(fā)現(xiàn)p62/sequestosome-1可通過促進VDR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制HSC活化及纖維化，p62的積累量與自噬活性成反比，這意味著抑制HSC自噬亦有可能通過該信號通路抑制纖維化。然而HSC自噬普遍認(rèn)為能促肝纖維化進展，其具體機制如何、是否適用于臨床仍有待于進一步深入研究。

3.2 巨噬細(xì)胞自噬

在肝損傷過程中，巨噬細(xì)胞通過清除細(xì)胞碎片維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，同時它也通過募集免疫細(xì)胞引起炎性浸潤，激活HSC和成纖維細(xì)胞，從而引起纖維化[19]。有研究[20]顯示巨噬細(xì)胞具有潛在的促纖維化作用。也有研究[21]發(fā)現(xiàn)一類低表達Ly-6C的巨噬細(xì)胞具有修復(fù)纖維化的能力。因此，巨噬細(xì)胞對于肝纖維化表現(xiàn)出雙向作用。

關(guān)于巨噬細(xì)胞自噬對肝纖維化的影響，有研究[22]通過條件性Atg5基因敲除小鼠髓系細(xì)胞抑制巨噬細(xì)胞自噬，予以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后發(fā)現(xiàn)其巨噬細(xì)胞分泌的IL-1α、IL-1β水平升高，與此同時CCL4誘導(dǎo)的肝損傷、炎癥及纖維化程度加重。因此可以推測，巨噬細(xì)胞自噬降低了IL-1α、IL-1β的表達，進而保護肝臟，抑制了肝纖維化進程。另一項研究[23]通過LPS和D-半乳糖胺誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Atg5缺陷型小鼠肝損傷后發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中IL-1β水平上升并加重纖維化進程；研究者認(rèn)為這是NLRP3炎性小體和caspase-1的活化導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中pro-IL-1β的裂解增強所致。因此，巨噬細(xì)胞自噬可能通過抑制炎癥小體依賴性IL-1β的產(chǎn)生來限制肝損傷和纖維化。

3.3 肝細(xì)胞自噬

肝實質(zhì)細(xì)胞是肝臟中數(shù)量最多的細(xì)胞，在持續(xù)性的肝損傷中，死亡的肝細(xì)胞會釋放損傷相關(guān)的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，DAMPs一方面激活了肝細(xì)胞的NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)了其焦亡并促進炎癥反應(yīng)，另一方面也可激活HSC，促進肝纖維化[24]。在其他肝臟疾病模型中，Devhare等[25]發(fā)現(xiàn)HCV感染的肝細(xì)胞通過分泌外泌體激活HSC，促進纖維化。在非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)模型中，肝細(xì)胞通過激活TAZ-Ihh通路導(dǎo)致脂肪變性和NASH，從而促進肝纖維化[26]。可見在肝損傷過程中，受損的肝細(xì)胞主要起促進肝纖維化的作用。

而關(guān)于肝細(xì)胞自噬對肝纖維化的影響，Ni等[27]發(fā)現(xiàn)特異性敲除肝細(xì)胞Atg5基因的小鼠肝臟炎癥和纖維化程度更為嚴(yán)重。其原因是Atg5缺失導(dǎo)致p62的積聚和Nrf2的活化，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，加重肝臟炎癥，從而促進肝纖維化。Amir等[28]通過GalN/LPS誘導(dǎo)Atg7基因缺失小鼠的肝損傷，發(fā)現(xiàn)自噬缺失的肝細(xì)胞中tBid表達上升，細(xì)胞色素c釋放誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機制可能為自噬的缺乏導(dǎo)致JNK/c-Jun信號通路增強，從而促進caspase-8的活化并誘導(dǎo)凋亡。通過腺病毒誘導(dǎo)肝細(xì)胞過表達Atg7和beclin1基因進一步研究發(fā)現(xiàn)，GalN/LPS誘導(dǎo)肝損傷模型中剪切的caspase-8和Bid水平有所降低，肝組織的慢性損傷也有所減少[29]。因此肝細(xì)胞自噬可通過減少細(xì)胞凋亡、炎性浸潤及HSC的激活，從而緩解肝纖維化。

3.4 LSEC自噬

LSEC是肝臟內(nèi)一種高度分化的構(gòu)成肝血竇壁的內(nèi)皮細(xì)胞，在調(diào)節(jié)肝竇血流與周圍組織的物質(zhì)交換中起著重要作用，其表型與肝纖維化進展息息相關(guān)。正常的LSEC具有正常的窗孔結(jié)構(gòu)，而毛細(xì)血管化的LSEC缺少了窗孔結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能。正常的LSEC在慢性肝損傷中能攔截凋亡小體及相關(guān)細(xì)胞因子，阻止HSC活化，并且可以逆轉(zhuǎn)活化的HSC，維持其穩(wěn)態(tài)，然而一旦LSEC丟失了窗孔結(jié)構(gòu)，它不僅不能阻止反而促進了HSC的活化?？梢奓SEC對肝纖維化的調(diào)節(jié)具有雙向作用。

有研究[30]通過CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早期肝損傷時LESC的自噬活性增強并表現(xiàn)出保護肝臟、減少纖維化的作用。而對特異性敲除小鼠LSEC的Atg7基因并予以CCL4處理，LSEC毛細(xì)血管化明顯增加，肝纖維化程度加重。這提示LSEC的自噬對于維持肝臟正常結(jié)構(gòu)、減少肝損傷并降低肝纖維化具有重要作用。而Hammoutene等[31]通過電鏡觀察NASH患者肝組織發(fā)現(xiàn)，相比于正常組，NASH患者的LSEC缺少自噬活性，體外敲除肝內(nèi)皮細(xì)胞Atg5基因誘導(dǎo)自噬缺陷導(dǎo)致炎性因子IL-6及TGF-β的表達增加。另外，通過對Atg缺陷鼠構(gòu)建NASH模型時也發(fā)現(xiàn)，LSEC自噬缺陷導(dǎo)致了其功能表型的變化，模型小鼠更容易發(fā)生凋亡并誘導(dǎo)炎癥，且肝臟更容易發(fā)生脂質(zhì)變性和肝纖維化。但用雷帕霉素誘導(dǎo)體外LSEC過度自噬則導(dǎo)致小窩蛋白降解，引起LSEC窗孔結(jié)構(gòu)的丟失，同時激活HSC[32]。故據(jù)此推測，LSEC的自噬水平高低對自身正常的功能結(jié)構(gòu)有著不同的影響，只有適中的自噬水平才可維持自身正常的結(jié)構(gòu)與功能，減少HSC的激活從而降低肝纖維化。

3.5 RDC自噬

導(dǎo)管反應(yīng)(ductular reaction，DR)是在多種肝臟損傷性疾病中可見的膽管反應(yīng)性增殖增生現(xiàn)象，參與此過程的細(xì)胞RDC可能來源于膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞或肝祖細(xì)胞，DR的發(fā)生通常還伴隨著血管增生和炎性細(xì)胞的浸潤以及HSC的激活和肝纖維化。

早期研究通過免疫熒光檢查原發(fā)性膽汁性肝硬化患者自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達發(fā)現(xiàn)，自噬與膽管細(xì)胞尤其是衰老的膽管細(xì)胞有顯著關(guān)聯(lián)[33]。Hung等[34]在肝硬化患者中也發(fā)現(xiàn)了自噬相關(guān)蛋白(LC3B、LAMP2等)與DR的共定位，隨后通過肝硬化模型發(fā)現(xiàn)，用氯喹阻斷自噬可減輕DR和肝纖維化。進一步研究[35]發(fā)現(xiàn)肝硬化模型中RDC的自噬水平不僅更高，還表現(xiàn)出向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的表型，同時敲除自噬相關(guān)基因可抑制RDC表型的轉(zhuǎn)化。故RDC的自噬有助于維持自身向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的表型，減少肝纖維化，但具體機制還需要進一步研究。

4 總結(jié)與展望

肝臟中不同的細(xì)胞自噬對肝纖維化有不同的影響。在慢性肝損傷過程中，HSC的自噬通過降解脂滴為其激活提供能量，從而促進肝纖維化；巨噬細(xì)胞自噬可減少炎癥因子的釋放，抑制肝纖維化；肝細(xì)胞自噬可減少凋亡和炎性浸潤從而降低肝纖維化；LSEC的正常自噬水平可減少毛細(xì)血管化，維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能，減少HSC的激活并抑制肝纖維化；而RDC自噬有助于維持向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的表型而保護肝臟、減少肝纖維化。

肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、LSEC等細(xì)胞自噬雖然都在一定程度上影響肝纖維化，但HSC的激活、轉(zhuǎn)化以及分泌ECM依然是肝纖維化的直接原因，且HSC與肝細(xì)胞、免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞等肝臟中多種細(xì)胞均有交流，這些細(xì)胞或通過HSC間接影響了肝纖維化進程。HBV感染的肝細(xì)胞可通過外泌體激活HSC，Zhang等[36]也發(fā)現(xiàn)在肝纖維化模型中TRIB3蛋白抑制了肝細(xì)胞自噬，并促進肝細(xì)胞分泌富含INHBA/Activin A的外泌體，從而激活HSC?？梢?，肝纖維化過程中HSC與其他細(xì)胞及組分間的交流仍需要進一步揭示，如何靶向抑制HSC凋亡或激活仍舊是治療或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要研究方向。