幼齡反芻動物胃腸道發(fā)育與微生物演變及其調(diào)控

郭蕓芳， 徐曉鋒， 張力莉

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

瘤胃是反芻動物最重要的消化器官， 飼料營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃內(nèi)消化通過瘤胃上皮吸收， 未被瘤胃消化的營養(yǎng)物質(zhì)在小腸內(nèi)進一步被消化吸收。因此，胃腸道發(fā)育對反芻動物的生長、生產(chǎn)性能和健康起著關(guān)鍵作用； 胃腸道微生物對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、 代謝和胃腸道發(fā)育方面的作用也是不可忽視的；由于幼犢牛免疫力差，消化系統(tǒng)發(fā)育不完全， 任何外部環(huán)境的干擾或營養(yǎng)水平的變化都會影響犢牛的發(fā)育（Diao，2017）和微生物區(qū)系的建立；同時越來越多的研究表明，胃腸道微生物群在黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用（Malmuthuge，2015），而幼齡是反芻動物胃腸道發(fā)育及微生物區(qū)系建立的關(guān)鍵時期， 因此了解并根據(jù)幼齡反芻動物年齡階段來采取相關(guān)調(diào)控策略對生產(chǎn)實踐有重要意義。

1 幼齡反芻動物胃腸道發(fā)育的規(guī)律

反芻動物與單胃動物的主要區(qū)別在于具有龐大的復(fù)胃消化系統(tǒng)，瘤胃在出生時尚未發(fā)育，隨著日齡的增長和飼糧及飼養(yǎng)管理的影響， 使胃腸道的發(fā)育呈現(xiàn)一定規(guī)律；因此，深入了解胃腸道的發(fā)育狀態(tài)對于動物營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、 健康和生產(chǎn)性能都尤為重要。

1.1 瘤胃容積發(fā)育變化 犢牛出生時， 網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃的重量分別占整個胃重量的38%、13%和49%，隨著日齡的增長，瘤胃重量占比增加，并成為消化營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所（Davis，1998）。 瘤胃發(fā)育一般為3 個階段：0 ~ 3 周齡為非反芻階段；3 ~ 8 周齡為過渡階段；8 周齡時瘤胃發(fā)育完全，進入反芻階段（Lane，2002）。研究表明，犢牛早在胚胎時期胃腸道開始發(fā)育，瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃在母畜妊娠56 日齡時已經(jīng)基本成形 （鄧由飛，2017）； 犢牛消化功能在胎兒時期發(fā)育， 出生48 h 內(nèi)，由于與母體分離以及飼喂初乳，使胃腸道形態(tài)和菌群變化較大， 哺乳期幼畜的消化功能從消化鮮奶或流體飼料向固體飼料過渡， 這期間瘤胃和網(wǎng)胃快速發(fā)育，重量占比增加（Guilloteau，2009）。 羔羊瘤胃重量、肌層厚度和乳頭長度隨日齡的增長而增加，在70 日齡時趨于穩(wěn)定，而瘤胃乳頭數(shù)量在14 ~ 28 日齡時顯著降低，在0 ~ 70日齡， 放牧山羊的瘤胃乳頭面積比補飼山羊的瘤胃乳頭面積增長速度更快（Jiao，2015）。 王佳堃等（2020）研究表明，瘤胃發(fā)育成熟的標(biāo)志是丙酸等生酮物質(zhì)含量增加； 常用血漿中β–羥丁酸含量來說明瘤胃發(fā)育的狀態(tài)。研究表明，犢牛皺胃重量相對于體重變化不大， 但皺胃黏膜重量在妊娠最后一個月增加25%， 在出生2 ~ 7 日齡顯著增加20% ~ 30%（Guilloteau，1984）。

1.2 瘤胃上皮與肌肉層的發(fā)育 瘤胃上皮的發(fā)育是由瘤胃微生物群和宿主之間相互作用引起的， 并隨著飼糧而發(fā)展變化（Malmuthuge，2017）；研究表明，10 周齡內(nèi)羔羊瘤胃乳頭長度和乳頭表面發(fā)生了顯著變化，1 ~ 4 周齡羔羊瘤胃乳頭表面較光滑，瘤胃上皮細胞發(fā)育程度較低，6 ~ 10 周齡羔羊瘤胃乳頭長度增加， 瘤胃上皮明顯增厚且粗糙（Zitnan，1993）。 張科等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，羔羊采食粗飼料后， 瘤胃背囊乳頭高度和寬度隨著日齡的增加均呈現(xiàn)出增高或增寬的趨勢， 瘤胃肌層逐步增厚；角化層從42 日齡開始出現(xiàn)，皺胃黏膜層厚和皺胃肌層厚沒有明顯變化規(guī)律。 值得注意的是， 羔羊采食開食料顯著提高了瘤胃乳頭的長度和寬度，改變了瘤胃發(fā)酵參數(shù)，可能是由于飼料進入瘤胃后，刺激生酮能力和丁酸代謝，從而促進了瘤胃乳頭的發(fā)育 （Wang，2016）。 盧勁曄等（2018） 給90 ~ 120 日齡波爾山羊每天飼喂精料400 g，持續(xù)42 d，結(jié)果表明，飼糧添加精料可加速瘤胃上皮細胞增殖，促進瘤胃上皮細胞生長，阻滯瓣胃上皮細胞增殖，抑制瓣胃上皮細胞生長。飼糧中添加苜蓿干草或起始料， 促進了牦牛犢牛的胃腸道發(fā)育， 原因可能是干物質(zhì)采食改變了瘤胃發(fā)酵狀態(tài)，使得瘤胃丁酸濃度升高，瘤胃產(chǎn)丁酸菌的數(shù)量增加，因此，可進一步促進瘤胃上皮的發(fā)育，但因兩種飼糧成分不同， 其瘤胃丁酸產(chǎn)量也有差異（Wu，2021）。 犢牛出生 5 周齡內(nèi)無限量或限量飼喂代乳品， 兩組瘤胃上皮的表面積無明顯差異，瘤胃pH 和揮發(fā)性脂肪酸濃度不受代乳品飼喂量的影響代乳品與起始料配合飼喂，可以增加犢牛瘤胃上皮重量，瘤胃乳頭表面積也顯著增加， 同時增加腸道基底細胞的增殖率（Yohe，2019）。 斷奶前舍飼有利于牦牛的胃腸發(fā)育及消化吸收， 瘤胃上皮乳頭的長度和寬度均顯著升高， 而瘤胃基底層厚度未受影響（Jonova，2021）。 研究表明，長期飼喂高谷物飼糧會改變奶牛和綿羊的瘤胃發(fā)酵以及瘤胃和瘤胃上皮相關(guān)的微生物群， 并導(dǎo)致瘤胃損傷和代謝紊亂（Hua，2017）。

1.3 腸道發(fā)育 腸黏膜的發(fā)育遵循近端-遠端的模式，即隱窩和絨毛首先出現(xiàn)在十二指腸，然后逐漸出現(xiàn)在腸道的更遠端（Toofanian，1976）。張科等（2017） 研究了0 ~ 56 日齡羔羊胃腸道組織形態(tài)隨日齡的發(fā)育變化規(guī)律， 發(fā)現(xiàn)小腸和大腸的重量隨著日齡的增長而增加，小腸各段的絨毛高度/隱窩深度隨日齡增長而降低， 結(jié)腸在整個階段發(fā)育最快。飼料過渡期間，營養(yǎng)物質(zhì)和物理形態(tài)均發(fā)生變化，腸道變化表現(xiàn)為微絨毛變短，后腸重量占比降低， 為營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收做好形態(tài)學(xué)的準(zhǔn)備（Guilloteau，2009）。 14 ~ 21 日齡時羔羊盲腸相對質(zhì)量增速最快，其次為42 ~ 56 日齡，各階段小腸相對質(zhì)量增速波動較小，56 日齡時大約增加了1倍（王彩蓮，2010）。 以 30 日齡的牦牛犢牛作為研究對象，發(fā)現(xiàn)與放牧方式相比，代乳品+補飼的培育方式更有利于牦牛犢牛小腸上皮組織形態(tài)發(fā)育， 并增強了小腸部分消化酶的分泌能力， 如α淀粉酶和胰蛋白酶（崔占鴻，2020）。 研究發(fā)現(xiàn)，舍飼更有利于牦牛犢牛腸道發(fā)育， 顯著增加了牦牛犢牛十二指腸、 空腸、 回腸的絨毛高度和隱窩深度，但十二指腸脂肪酶、空腸脂肪酶和回腸脂肪酶顯著降低（Hua，2017）。

幼齡反芻動物的胃腸道發(fā)育隨日齡呈現(xiàn)一定的規(guī)律，是由胃腸道微生物及其代謝產(chǎn)物、飼糧和宿主之間共同作用的結(jié)果， 幼齡反芻動物胃腸道發(fā)育程度直接影響成年動物的生產(chǎn)性能和營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。

2 幼齡反芻動物胃腸道微生物區(qū)系的演變

胃腸道微生物定植是一個復(fù)雜的過程， 分娩時與母體分離以及出生后與外界環(huán)境接觸都為微生物定植提供了一定條件； 幼齡反芻動物胃腸道微生物區(qū)系的豐富度和多樣性處于不斷變化的狀態(tài)，這些微生物與宿主相互作用，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和生產(chǎn)性能的發(fā)揮； 所以了解幼齡動物胃腸道微生物區(qū)系的演變規(guī)律， 為幼齡動物生產(chǎn)潛力的挖掘有重要意義。

2.1 瘤胃微生物區(qū)系的變化 有研究表明，反芻動物的胃腸道，包括前胃復(fù)合體，在出生時是無菌的，但在最初的24 h 內(nèi)迅速定植，厭氧菌在出生后第二天開始占優(yōu)勢（Fonty，1989）。 但也有研究表明，在產(chǎn)前羔羊腸道中檢測到一個低多樣性、低生物量的微生物組，主要由變形菌門、放線菌門和厚壁菌門組成，產(chǎn)前胎兒腸道中大腸桿菌的數(shù)量最多，說明產(chǎn)前腸道含有微生物，并且胎兒腸道的微生物定植開始于子宮（Bi，2021）。Rey（2014）和 Jimi（2013）等研究表明，犢牛瘤胃細菌群落在出生后迅速形成，瘤胃內(nèi)群落由成熟瘤胃中發(fā)現(xiàn)的許多細菌組成，在門水平上，1 ~ 3 日齡犢牛瘤胃中最豐富的菌門是變形菌門；在屬水平上，3 ~ 12 日齡時瘤胃優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬和鏈球菌屬，當(dāng)固體攝食量迅速增加時， 普雷沃氏菌屬占有主導(dǎo)地位，許多屬急劇減少或不再被檢測到（Rey，2014）。研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物的多樣性和總物種的豐度隨年齡的增長而增加，所有年齡階段的優(yōu)勢菌門主要由擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門組成，厚壁菌門在所有年齡階段中都穩(wěn)定存在，而擬桿菌門和變形菌門的相對豐度發(fā)生了變化（Wang，2016；Koenig，2011）。 Li 等（2011）研究表明，大多數(shù)瘤胃細菌如蛋白質(zhì)分解菌、纖維素分解菌和其他種類細菌在4 ~ 10 日齡羔羊的瘤胃微生物區(qū)系中即定植。

瘤胃微生物群落在不同年齡階段會發(fā)生一定變化， 其中細菌和古菌比其他微生物群對年齡的變化更敏感；細菌、古菌、原蟲和真菌在牦牛生長過程中都有相對應(yīng)的成熟軌跡， 其中瘤胃古菌大約在牦牛5 歲時完全成熟， 而其他微生物群在5~ 8 歲成熟（Wei，2020） 。

以上研究結(jié)果表明， 幼齡反芻動物出生前腸道內(nèi)已經(jīng)有微生物存在， 在出生幾天內(nèi)便可以檢測到成熟瘤胃中的細菌、古菌和真菌分類群；可以看出，細菌為各個年齡階段的優(yōu)勢類群，主要由擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門組成，但在不同年齡階段所占比例不同；在屬水平上，普雷沃氏菌屬豐度隨著日齡增長而增加。

2.2 腸道微生物區(qū)系的變化 腸道細菌多樣性從出生到2.5 歲逐漸增加，與群落多樣性的逐漸變化有關(guān)（Jiao，2015）；新生犢牛出生一周的小腸腔內(nèi)微生物群由細菌、古菌、真菌、原生動物和病毒組成，在犢牛的所有腸區(qū)都可以觀察到厚壁菌門、 擬桿菌門、 變形菌門和放線菌門（Malmuthuge，2019）。

Li 等（2019）對 0 ~ 56 日齡山羊的胃腸道細菌群落動態(tài)進行研究，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，大腸中的變形菌門被厚壁菌門取代， 而變形菌門主要存在于日齡較大的山羊小腸中，乳桿菌屬在14 日齡山羊空腸和回腸中急劇增加； 年齡較大的山羊十二指腸和空腸中， 乳桿菌屬和擬桿菌屬的比例較低，而Christensenellaceae_R_7 和反芻球菌屬的比例較高。 Song 等（2018） 研究表明，后腸微生物群在出生時具有多樣性， 黏膜附著微生物群比消化相關(guān)微生物群具有更高的個體差異， 共鑒定出16 個門，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是后腸的優(yōu)勢菌群；PCR 分析結(jié)果顯示， 年齡對黏膜附著大腸桿菌、雙歧桿菌、糞腸球菌的比例有顯著影響； 尤其在出生后第一周檢測到大量的黏膜相關(guān)埃希氏菌，表明在此階段致病感染的可能性更高。新生犢牛后腸的優(yōu)勢菌科包括擬桿菌科、 毛螺菌科、乳桿菌科和腸桿菌科（Frese，2015）。 Kimberly等（2017）研究了犢牛糞便微生物群落，發(fā)現(xiàn)斷奶前犢牛糞便細菌群落在OTU 水平上有很高的β多樣性；隨著犢牛年齡的增長，糞便中的許多細菌OTUs 數(shù)量逐漸減少，并在成年后消失，這些OTU大多是糖溶性屬，包括乳桿菌（Lactobacillu）和產(chǎn)丁酸的糞便桿菌（Faecalibacterium），這些細菌可能有助于胃腸發(fā)育。可以看出，腸道微生物群與瘤胃內(nèi)菌群相似，隨年齡而變化，不同年齡階段優(yōu)勢菌門的豐度存在差異， 不同腸段的菌屬豐度也存在差異。

3 幼齡反芻動物胃腸道發(fā)育與菌群調(diào)控

促進反芻動物胃腸道發(fā)育與微生物定植的方法有很多，比如飼糧形態(tài)及營養(yǎng)水平、添加劑、飼養(yǎng)管理方式以及微生物移植等， 通過這些調(diào)控措施可以改變胃腸道發(fā)育程度并改善動物的健康狀態(tài)；近年來，有許多關(guān)于營養(yǎng)、管理以及微生物移植等方式來直接調(diào)控幼齡動物胃腸道發(fā)育及微生物區(qū)系的相關(guān)研究，并具有一定的效果。

3.1 飼糧形態(tài)及營養(yǎng)水平 有報道稱，無論飼糧如何，7 日齡犢牛瘤胃中已經(jīng)建立了成熟瘤胃中常見的古細菌、細菌和真菌分類群，液體飼糧飼喂的犢牛瘤胃中乳桿菌、 擬桿菌和Parabacteroides等菌屬的豐度較高（Dias，2017）。有學(xué)者研究了飼喂代乳粉對羔羊的微生物區(qū)系建立的影響， 發(fā)現(xiàn)代乳粉組羔羊瘤胃微生物區(qū)系的變化明顯， 其中擬桿菌門成為優(yōu)勢菌門，琥珀酸菌屬、瘤胃桿菌屬等在25 日齡后相對豐度高于哺乳組， 乳酸桿菌屬相對豐度在 45 日齡后逐漸升高， 相反， 在25日齡后韋榮氏球菌屬（Veillonella）相對豐度明顯下降（李永洙，2019）。

羔羊補飼開食料，增加了瘤胃揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，改變了瘤胃發(fā)酵和瘤胃微生物群落，表現(xiàn)為普雷沃氏菌屬和毛螺菌科相對豐度顯著升高， 以上兩者可能是添加開食料而引起瘤胃功能變化的主要微生物（Lv，2019）。 研究表明，飼糧脂肪水平會影響瘤胃發(fā)酵參數(shù)，羔羊60 日齡時飼喂高脂肪飼糧， 瘤胃中變形菌門和纖維桿菌門豐度升高；屬水平上，琥珀酸弧菌屬、擬普雷沃氏菌屬等細菌豐度顯著升高，但羅氏菌屬、梭菌屬、 小類桿菌屬和丁酸弧菌等菌屬豐度顯著降低（李文娟，2018）。 因此，飼糧形態(tài)及營養(yǎng)水平會改變瘤胃菌群豐度， 飼糧代謝產(chǎn)物也會改變瘤胃發(fā)酵參數(shù)， 以上兩者因素共同作用來影響瘤胃菌群的建立和瘤胃發(fā)育。

3.2 添加劑 犢牛飼糧中添加鼠李糖乳桿菌GG（GG，ATCC 53013）提高了新生犢牛的主動采食量和生長性能，調(diào)節(jié)了瘤胃發(fā)酵模式，使丙酸鹽和丁酸鹽的濃度增加， 提高了瘤胃液中淀粉酶、蛋白酶活性和微生物蛋白濃度，還使瘤胃內(nèi)的細菌群落組成多樣化， 并調(diào)節(jié)瘤胃和腸道微生物的平衡（Zhang，2019）。犢牛飼糧補充釀酒酵母及培養(yǎng)物增加了瘤胃乳頭長度， 空腸隱窩深度降低，小腸絨毛高度與隱窩深度的比率增加，并提高丁酸弧菌的相對豐度， 降低普雷沃氏菌相對豐度（Xiao，2016）。 補飼丁酸鈉可以提高羔羊瘤胃液中乙酸、 丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度，增加瘤胃乳頭長度、寬度以及角質(zhì)層和總上皮的厚度（Liu，2019）。

以上研究說明，在幼齡動物飼糧中添加一些微生態(tài)制劑、 發(fā)酵劑或酸化劑可以改變瘤胃發(fā)酵模式，從而改變瘤胃代謝，促進瘤胃發(fā)育和微生物的定植，還能改變部分微生物區(qū)系的豐度。

3.3 飼養(yǎng)管理方式 Abecia 等（2014）選擇了懷雙羔的妊娠母羊，羔羊出生后，分別用母乳和人工代乳品喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)的羔羊瘤胃重量更高，而兩組的瘤胃內(nèi)容物體積則沒有差異， 兩組羔羊均在出生第一天瘤胃內(nèi)檢測到細菌、 古菌和原蟲的存在；原蟲和螺旋菌門（Spirulina）在母乳喂養(yǎng)的羔羊瘤胃中逐漸增加，而在另一組中沒有變化，說明飼養(yǎng)管理（自然和人工）對微生物定植和瘤胃發(fā)育有影響。有學(xué)者研究了不同飼養(yǎng)方式對12 月齡蘇尼特羊胃腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，結(jié)果表明，放牧組蘇尼特羊胃腸道菌群的α 多樣性顯著高于舍飼組， 放牧組胃腸道菌群中厚壁菌門的相對豐度高于舍飼組， 而變形菌門的相對豐度低于舍飼組。放牧組瘤胃中普氏菌屬、RC9-gut-group、擬桿菌屬、 丁酸弧菌屬和Quinella 屬的相對豐度高于舍飼組;而舍飼組中琥珀酸弧菌屬的數(shù)量最多。 放牧組腸道中擬桿菌屬、RC9-gut-group 和Alisties的相對豐度高于舍飼組（王柏輝，2019）。上述研究表明， 不同飼喂方式和管理條件會影響胃腸道發(fā)育和微生物區(qū)系的建立以及菌群的相對豐度。

3.4 微生物移植 目前關(guān)于微生物移植相關(guān)報道有瘤胃微生物移植（RMT）和糞菌移植（FMT），是指將健康供體的瘤胃微生物或糞便微生物移植到受體牛胃腸道內(nèi)，來調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進胃腸發(fā)育并幫助治療胃腸道疾病。

研究表明， 通過給新生犢牛灌服健康成年牛的瘤胃液，改變了瘤胃和盲腸乙酸與丙酸的比例，十二指腸的絨毛高度增加， 并改善了犢牛早期腹瀉的發(fā)病率（張鑫，2017）。有學(xué)者給幼齡山羊重復(fù)接種成年山羊的新鮮瘤胃液， 發(fā)現(xiàn)接種瘤胃液加速了瘤胃微生物的定植， 與未接種的山羊相比觀察到更高的細菌多樣性（+ 234 OTUs）、產(chǎn)甲烷菌（+6 OTUs）和原蟲群落（+25 OTUs）；該研究還發(fā)現(xiàn)高壓滅菌瘤胃液的接種也促進了瘤胃功能的發(fā)育，但使用效果不如新鮮瘤胃液明顯（Palma-hidalgo，2021），可能是高壓滅菌過程中影響了部分有益菌的活性。 Kim 等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT 之后犢牛腸道微生物群落結(jié)構(gòu)逐漸類似于供體小牛的結(jié)構(gòu)，相關(guān)分析表明，腸桿菌科細菌豐度異常增加所表現(xiàn)的腸道菌群失調(diào)極有可能引發(fā)幼犢腹瀉，腸桿菌科與卟啉單胞菌科相對豐度呈負相關(guān)，而FMT 后腸道微生物區(qū)系成熟，以卟啉單胞菌科的豐度增加為特征，限制了腸桿菌科種群的擴張，所以FMT 可以改變微生物群落并降低犢牛腹瀉的發(fā)病率。

可以看出RMT 或FMT 能夠促進胃腸道發(fā)育和微生物區(qū)系的變化， 并改善幼齡動物的腹瀉發(fā)病率， 但目前關(guān)于FMT 在反芻動物上的研究較少；此外，關(guān)于這兩種移植技術(shù)的樣品前處理、移植劑量、移植細節(jié)，對動物身體機能的影響，以及這種移植可能在改善動物生長性能方面發(fā)揮的潛在作用還值得進一步研究。

4 小結(jié)

幼齡被認為是微生物調(diào)控的“窗口期”，進一步研究胃腸道微生物群演替及其功能作用， 了解不同的管理條件下胃腸道菌群的變化趨勢， 瘤胃微生物和代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)胃腸道發(fā)育過程中的深層次機制， 對于調(diào)控胃腸道健康和研究疾病的潛在機制有重要意義。