旋毛蟲抗原成分抗腫瘤作用的研究進(jìn)展

李美辰，潘靖丹，吳合亮，張晶晶，徐雯雯，杜孌英

（承德醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，河北承德 067000）

惡性腫瘤是臨床上常見的疾病，多年來，放療和化療等有效的治療方法不斷發(fā)展，但副作用大、生存率低等弊端仍是治療過程中面臨的主要挑戰(zhàn)之一。腫瘤生物治療是指運(yùn)用生物工程技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)腫瘤進(jìn)行防治的新療法[1]。國(guó)內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)，天然的抗腫瘤活性物質(zhì)存在于多種生物中，除多種動(dòng)、植物外，一些寄生蟲也具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)，目前報(bào)道的主要有弓形蟲[2]、瘧原蟲[3]和糞類圓線蟲[4]等，從19世紀(jì)70年代起，旋毛蟲的抗腫瘤研究就進(jìn)入了研究者們的視野。

旋毛蟲（Trichinellaspiralis）寄生于多種食肉動(dòng)物和雜食動(dòng)物的小腸及骨骼肌細(xì)胞內(nèi)，陸續(xù)有研究表明，感染活體旋毛蟲除了可引起旋毛蟲病以外，還可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的防御機(jī)能[5]，但是活體旋毛蟲寄生抵御腫瘤生長(zhǎng)有一定的潛在危害性。近年來，天然混合抗原的抗腫瘤作用研究比較多，如排泄分泌（Excretory-secretory，ES）抗原、蟲體抗原等，但是混合抗原抗腫瘤存在很多問題，混合物難以獲得，難以應(yīng)用于臨床實(shí)踐，實(shí)驗(yàn)過程較為復(fù)雜。為了解決這些問題，研究者們通過實(shí)驗(yàn)深入篩選和獲得其中有抗腫瘤作用的有效成分，如TSL-1抗原、原肌球蛋白、小凹蛋白1、核糖體蛋白、TCTP和熱休克蛋白等，讓單克隆抗體研究在生物療法抗腫瘤領(lǐng)域發(fā)展成為可能。本文就這些成分的研究近況加以綜合論述，以為今后的研究提供思路。

1 旋毛蟲天然混合抗原的抗腫瘤作用

旋毛蟲蟲體本身或蟲體排泄分泌物中都含有復(fù)雜的抗原成分，其中不乏抗腫瘤活性抗原，這些抗原均屬于旋毛蟲天然混合抗原。在諸多實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)表明，感染旋毛蟲不同時(shí)間點(diǎn)以及旋毛蟲在宿主體內(nèi)發(fā)育的不同階段，這些混合抗原均有不同程度的抗腫瘤作用，被認(rèn)為參與了自身免疫、過敏和惡性疾病的改善[6]。

1.1 旋毛蟲ES抗原的抑制腫瘤作用

旋毛蟲ES抗原是指旋毛蟲感染宿主過程中激活宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)而天然孔分泌或者排泄的復(fù)雜活性抗原[7]。當(dāng)前，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使學(xué)者對(duì)排泄分泌產(chǎn)物的研究比較深入，羅靖梅[8]用質(zhì)譜法鑒定分析得到旋毛蟲肌幼蟲ES抗原的具體組分，共鑒定出162 種蛋白質(zhì)，其中有63 種已明確鑒定的蛋白質(zhì)，并且通過查找對(duì)比發(fā)現(xiàn)有6 種與抗腫瘤作用相關(guān)的抗原，即原肌球蛋白、犰狳極性蛋白和真核起始因子4A、Kazal 4型絲氨酸蛋白酶抑制劑、組蛋白H2A、剪切聚腺苷酸化特異因子亞基2。該研究明確指出旋毛蟲排泄分泌抗原中存在抗腫瘤活性物質(zhì)，使今后的研究更有方向性和針對(duì)性。

體外實(shí)驗(yàn)研究中，Luo等[9]采用噻唑藍(lán)比色法(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、RT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)探究旋毛蟲肌幼蟲期ES抗原對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株的凋亡作用及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ES抗原能夠在體外抑制H446細(xì)胞的增殖，且有時(shí)間劑量依賴性，ES抗原還能通過線粒體途徑使細(xì)胞發(fā)生凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，劉菁等[10]將BALB/c-nu小鼠腹腔注射旋毛蟲ES抗原誘導(dǎo)的健康人外周靜脈血樹突狀細(xì)胞（DC），用藥9d后建立人H7402肝細(xì)胞癌細(xì)胞株的BALB/c-nu小鼠實(shí)體瘤模型，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤增長(zhǎng)速度趨勢(shì)小于對(duì)照組，腫瘤重量與對(duì)照組相比也有明顯差異，實(shí)驗(yàn)組抑瘤率達(dá)到了37.04%，證實(shí)旋毛蟲ES抗原誘導(dǎo)的健康成年人外周靜脈血DC對(duì)人H7402肝細(xì)胞癌具有一定預(yù)防性作用。這些體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均表明，旋毛蟲排泄分泌抗原具有積極的抗腫瘤作用，具有一定的臨床參考價(jià)值。

1.2 旋毛蟲蟲體抗原的抑制腫瘤作用

旋毛蟲蟲體抗原是指將旋毛蟲AD期、NBL期、ML期三個(gè)不同時(shí)期的蟲體從寄生宿主體內(nèi)提取出來，通過人工消化法[11]，經(jīng)洗滌、離心、勻漿、超聲作用等操作提取而得到的旋毛蟲粗提取物，這種粗提取物是一種可溶性混合抗原，即旋毛蟲蟲體抗原。據(jù)現(xiàn)有報(bào)道得知，旋毛蟲蟲體抗原含有多種蛋白酶、熱休克蛋白和磷酸膽堿，均有一定的抗腫瘤作用。

體外實(shí)驗(yàn)研究中，王學(xué)林等[12]分別制備旋毛蟲AD期與NBL期的蟲體抗原，用不同濃度蟲體抗原與H7402 細(xì)胞共培養(yǎng)，得到結(jié)論，旋毛蟲AD期與NBL期蟲體抗原可以抑制肝癌H7402細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，旋毛蟲蟲體抗原還能誘導(dǎo)H7402細(xì)胞S期發(fā)生凋亡。于莉等[13]采用MTT法、FCM法、RT-PCR及Western Blot檢測(cè)表明，旋毛蟲ML期蟲體抗原對(duì)H446細(xì)胞增殖活性有抑制作用，且呈劑量依賴性，旋毛蟲ML期蟲體抗原作用細(xì)胞24h后，可通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人H446細(xì)胞株發(fā)生凋亡。Wangxl等[14]通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)分別探究了旋毛蟲蟲體抗原的抗腫瘤作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立腹水性肝癌（H22細(xì)胞系）、肉瘤（S180細(xì)胞系）和賁門竇癌（MFC細(xì)胞系）ICR小鼠實(shí)體瘤模型，將實(shí)驗(yàn)組各組荷瘤小鼠尾靜脈注射旋毛蟲粗提蟲體抗原，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，旋毛蟲粗提蟲體抗原體內(nèi)抑制H22、S180、MFC腫瘤生長(zhǎng)，呈劑量依賴性；體外實(shí)驗(yàn)用粗提抗原作用于H22、S180、MFC、肝癌細(xì)胞株H7402和人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞，結(jié)果表明，旋毛蟲粗抗原可抑制H22、S180、MFC、肝癌細(xì)胞株H7402和人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，且相同劑量的旋毛蟲粗提蟲體抗原可以誘導(dǎo)H7402和K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。這些研究數(shù)據(jù)也為旋毛蟲抗腫瘤的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

2 旋毛蟲抗腫瘤作用的具體抗原成分

雖然旋毛蟲ES抗原和蟲體抗原均具有明顯的抗腫瘤作用，但均需人工感染動(dòng)物獲得旋毛蟲蟲體，制備抗原過程中很難做到統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化，從而導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室、不同批次的抗原質(zhì)量不同。而且由于蟲體來源困難，大量生產(chǎn)抗原難度很大，使這些抗原的免疫學(xué)方法始終未被納入法規(guī)方法，嚴(yán)重影響了旋毛蟲抗腫瘤技術(shù)的發(fā)展和抗腫瘤藥物的研制。因此，篩選和獲得高特異性以及高敏感性的抗原基因成為旋毛蟲病抗腫瘤研究的焦點(diǎn)。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究者通過基因工程技術(shù)篩選和獲得了大量不同的旋毛蟲抗原基因，并對(duì)其進(jìn)行克隆、表達(dá)、抗原性分析及抗原表位預(yù)測(cè)等，使得未來大量制備抗腫瘤理想抗原成為可能。

2.1 TSL-1 抗原

旋毛蟲排泄分泌產(chǎn)物中，分子量為43，53和45kDa的糖蛋白的表達(dá)量較高，這是由于43，53和45kDa 糖蛋白均含有一種特殊的抗原TSL-1（Trichinella Spiralis Larvae 1，TSL-1）抗原，可以引起旋毛蟲寄生宿主強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。Niborski等[15]通過免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析表明，TSL-1 抗原可以促進(jìn)編碼不同細(xì)胞因子基因的 mRNA 轉(zhuǎn)錄效率，它所特有的3,6-雙脫氧阿拉伯已糖可以激活機(jī)體內(nèi)的肥大細(xì)胞產(chǎn)生TNF-β和 IL-4等細(xì)胞活性因子，發(fā)揮了一定的抗腫瘤作用。

2.2 原肌球蛋白

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）存在于多種真核生物體內(nèi)，包括酵母菌、蠕蟲、蒼蠅、甲殼類動(dòng)物、青蛙、鳥類和哺乳動(dòng)物等[16]，在肌肉和非肌肉細(xì)胞以及組織和器官中均有表達(dá)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的酸性保守蛋白。TM是細(xì)胞骨架蛋白的核心，參與細(xì)胞骨架活動(dòng)，還發(fā)揮著細(xì)胞轉(zhuǎn)化抑制劑的作用[17]。張景芝等[18]發(fā)現(xiàn)，從旋毛蟲體內(nèi)提取的TM產(chǎn)生了抗骨髓瘤的抗體，TM的細(xì)胞骨架特性決定了它與腫瘤細(xì)胞的粘附相關(guān)性，當(dāng)腫瘤患者的機(jī)體內(nèi)能夠產(chǎn)生大量的抗TM的抗體時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間的粘附功能下降或喪失，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡化死亡。

2.3 小凹蛋白1

小凹蛋白1（caveolin-1，cav-1）是細(xì)胞表面穴樣內(nèi)陷中重要的膜內(nèi)蛋白，與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系比較緊密。作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)中樞，cav-1影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性，它的缺失、突變與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移聯(lián)系緊密，cav-1的調(diào)控作用貫穿于機(jī)體正常組織發(fā)生癌變的諸多環(huán)節(jié)。有研究表明，cav-1可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡發(fā)揮腫瘤抑制作用，從而在某些腫瘤發(fā)生的早期抑制原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)[19]。Romel等[20]人通過抑制消減雜交技術(shù)從旋毛蟲成蟲中克隆出cav-1基因，通過鑒定得知cav-1是一種成蟲特異性抗原，它在成熟的旋毛蟲卵母細(xì)胞和胚胎表面均有表達(dá)，并逐漸積累，在3d內(nèi)達(dá)到最大值，由此得知，cav-1這種有抗腫瘤作用的抗原在旋毛蟲卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育過程中起著重要作用。

2.4 核糖體蛋白家族

核糖體蛋白家族通過參與細(xì)胞發(fā)育調(diào)控、細(xì)胞分化、DNA修復(fù)調(diào)控癌基因和抑癌基因表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，加速血管的生成，協(xié)同染色體基因發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。核糖體蛋白家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系極為緊密，是促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展的決定性因素[21]，在食管癌、胃癌、肝癌和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤組織中，部分核糖體蛋白有基因高表達(dá)的現(xiàn)象。段玲欣等[22]采用抗Sp2/0骨髓瘤抗體篩選ML期旋毛蟲cDNA 表達(dá)文庫(kù)，得到的旋毛蟲與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞相關(guān)抗原基因片段經(jīng)5’-RACE末端快速擴(kuò)增后，獲得含有411bp開放閱讀框的基因全長(zhǎng)，將其命名為TS2。登陸NCBI庫(kù)進(jìn)行Blast 比對(duì)，得知此基因是旋毛蟲核糖體蛋白基因。

2.5 翻譯控制腫瘤蛋白

翻譯控制腫瘤蛋白（translationally controlled tumor protein，TCTP）是一種可以在真核生物中短暫存在的抗原成分，在旋毛蟲、吸蟲、瘧原蟲亞種和其他寄生蟲中有豐富的表達(dá)和高度的保守性[23]。它是一種與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的蛋白，會(huì)在腫瘤逆轉(zhuǎn)的過程中明顯下調(diào)，與機(jī)體細(xì)胞周期進(jìn)展、抗凋亡、腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、降鈣蛋白、細(xì)胞外組胺釋放因子和免疫活性等有關(guān)[24]。

2.6 熱休克蛋白

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs）與TCTP高度同源，作為參與細(xì)胞骨架穩(wěn)定、細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化的重要的分子伴侶，它們與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[25]。HSPs隨著環(huán)境溫度的改變而不同，并引起宿主免疫系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)，可作為疫苗候選蛋白，也被認(rèn)為是一種有效的免疫佐劑，可以產(chǎn)生更強(qiáng)大的反作用[26]。旋毛蟲的體細(xì)胞提取物可分離出熱休克蛋白，如shsp、hsp60、hsp70、組蛋白h3和組蛋白h2b等[27]，在旋毛蟲蟲體中，hsps對(duì)維持體內(nèi)平衡和抗凋亡有重要意義[28]。

3 結(jié)語

近年來，旋毛蟲抗腫瘤抗原的研究逐步深入，我們對(duì)旋毛蟲抗腫瘤的認(rèn)識(shí)也越來越充分，旋毛蟲抗腫瘤抗原也是生物療法治療腫瘤的重要關(guān)注對(duì)象之一，且已有證據(jù)表明，旋毛蟲有效抗原將有可能成為腫瘤生物治療強(qiáng)有力的藥物。但是尚有許多問題沒有最終解決，仍然存在巨大挑戰(zhàn)。未來研究將關(guān)注在旋毛蟲抗腫瘤抗原的篩選、腫瘤疫苗的研發(fā)和對(duì)人體治療的轉(zhuǎn)化方面，以期早日實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。