基因編輯治療視網(wǎng)膜疾病的研究進(jìn)展

周紫依 游志鵬

視網(wǎng)膜疾病可以是遺傳來源或多危險(xiǎn)因素共同作用的結(jié)果。遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(IRD)是一種罕見的遺傳性視網(wǎng)膜疾病，可由280多種基因突變引起，除線粒體遺傳外，還以常染色體顯性、隱性或X連鎖方式遺傳，均可導(dǎo)致功能性視力喪失，并常常發(fā)展為失明[1]。迄今為止，臨床上最先進(jìn)的IRD基因治療方法是采用基因擴(kuò)增策略，將突變基因的野生型(WT)cDNA包裝在腺相關(guān)病毒(AAV)載體或慢病毒(LV)載體中，并將該載體轉(zhuǎn)運(yùn)入視網(wǎng)膜中。目前至少有10種不同的基因增強(qiáng)療法正處于臨床試驗(yàn)中，并且發(fā)展迅速[2]。

然而，提供突變基因正?？截惖幕蛟鰪?qiáng)療法僅適用于治療單倍體功能不足或功能缺失的突變，并不能直接影響致病基因。成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)和CRISPR相關(guān)核酸酶(Cas)系統(tǒng)(CRISPR/Cas)是最有效且通用的基因編輯工具，能簡單地將Cas核酸酶與控制基因組位點(diǎn)識(shí)別的RNA結(jié)合起來，有直接糾正患者DNA中的突變或抑制顯性突變表達(dá)的可能。Cas9/gRNA復(fù)合物通過在特定位點(diǎn)切割DNA，觸發(fā)2種修復(fù)機(jī)制：同源介導(dǎo)修復(fù)(HDR)和非同源末端連接(NHEJ)。在外源性供體DNA存在的情況下，基因組中的突變可以通過HDR來替代/糾正。而NHEJ作為一種普遍的修復(fù)過程，通過在目標(biāo)位點(diǎn)引入錯(cuò)誤序列導(dǎo)致致病基因失活?；蚓庉嫷陌l(fā)展異常迅速，CRISPR/Cas系統(tǒng)加速了基因編輯的革命。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的來源與發(fā)展

20世紀(jì)90年代，研究人員在細(xì)菌與古菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas系統(tǒng)，其為一種依賴于小RNA的適應(yīng)性防御系統(tǒng)，可特異性檢測(cè)和沉默入侵質(zhì)粒和病毒的核酸。2012年，Doudna和Charpentier團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，通過融合crRNA和tracrRNA，可以構(gòu)建出一種特異性的單鏈向?qū)NA(gRNA)，其可與SpCas9偶聯(lián)，從而誘導(dǎo)靶DNA雙鏈斷裂(DSB)[3]。有趣的是，Kleintiver等[4]還設(shè)計(jì)了SpCas9的變異株，命名為VQR和VRQR，該變異株具有新的原間隔序列鄰近基序(PAM)特異性，實(shí)現(xiàn)了基因組編輯在大范圍位點(diǎn)上的應(yīng)用。最近，SpCas9的變體xCas9被發(fā)現(xiàn)，與WT-SpCas9相比，具有更強(qiáng)大的PAM兼容性和更低的脫靶活性[5]。

如前所述，DSB可激活修復(fù)機(jī)制NHEJ或HDR。除目標(biāo)位點(diǎn)上的單個(gè)DSB外， NHEJ還可修復(fù)2個(gè)連續(xù)的DSB，使DSB之間的DNA序列被高效且精確的刪除[6]，或者利用多個(gè)DSB同時(shí)敲除若干基因組位點(diǎn)，都是可行的。值得注意的是，同時(shí)存在一個(gè)以上的DSB可能導(dǎo)致基因組重排，包括gRNA靶位點(diǎn)區(qū)域的倒轉(zhuǎn)或重復(fù)，以及染色體易位[6-7]。另外，通過將CRISPR組分與靶位點(diǎn)同源的雙鏈或單鏈供體DNA一起引入細(xì)胞，HDR機(jī)制可精確糾正特定的點(diǎn)突變或在內(nèi)源性調(diào)控元件的控制下引入基因的WT序列。CRISPR/Cas系統(tǒng)的主要局限在于可能導(dǎo)致部分同源DNA位點(diǎn)發(fā)生意外突變(稱為脫靶)，從而限制了該技術(shù)在臨床治療中的應(yīng)用。目前通過使用在視網(wǎng)膜細(xì)胞中特別活躍的啟動(dòng)子來限制Cas核酸酶的表達(dá)，從而減少脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。除此之外，還有其他數(shù)種方法可將脫靶概率降到最低。首先被提出的方法依賴核酸內(nèi)切酶(Cas9n D10A)[4]以及兩股互補(bǔ)于目標(biāo)位點(diǎn)相反鏈的gRNA，此二者識(shí)別并切割特異性DNA位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA雙鏈缺口，使特定位點(diǎn)的DSB被NHEJ高效修復(fù)，并使脫靶效應(yīng)最小化[8]。其次通過特定殘基的誘變產(chǎn)生4種SpCas9變體，分別是SpCas9-HF1、eSpCas9、HypaCas9和evoCas9，這些變體相比于WT SpCas9，在保持靶點(diǎn)編輯效率的同時(shí)，降低了脫靶可能[9]。最近，Vakulskas等[10]在SpCas9中引入單點(diǎn)突變(R691A)，當(dāng)其編碼的蛋白質(zhì)與gRNA結(jié)合形成核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物時(shí)，可以保持精確的靶向裂解以及減少靶外編輯，確保了Cas9/gRNA復(fù)合物能夠介導(dǎo)高水平的基因編輯任務(wù)。再者，加快蛋白質(zhì)的降解可使脫靶效應(yīng)降低[11]。

除基因編輯外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可以用于轉(zhuǎn)錄水平的細(xì)胞編程，無需對(duì)基因組進(jìn)行永久性的修改。為此，可以將催化失活的“死亡”Cas9(dCas9)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子融合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，使其能夠識(shí)別靶位點(diǎn)而不發(fā)生任何裂解作用[8,12]。

另一種CRISPR介導(dǎo)的基因編輯方法允許1個(gè)堿基直接且不可逆地替換另一個(gè)堿基，而不需要誘導(dǎo)DSB或利用HDR的過程。為了在基因組DNA中實(shí)現(xiàn)4種轉(zhuǎn)換突變(C到T、A到G、T到C和G到A)的可編程安裝，有研究開發(fā)了一種融合蛋白，包括dCas9或nicks D10A、大鼠胞苷脫氨酶APOBEC1或腺嘌呤脫氨酶，以及細(xì)胞堿基切除修復(fù)機(jī)制的抑制劑，如尿嘧啶糖基化酶抑制劑。所得到的堿基編輯器在多個(gè)細(xì)胞系中顯示出較高的堿基編輯效率和較低的插入/缺失錯(cuò)誤[13-14]。進(jìn)一步改變PAM的堿基編輯器，提高了產(chǎn)品純度和特異性[15]?！八阉骱吞鎿Q”是基因編輯方法的最新突破，用于介導(dǎo)所有可能的堿基之間的相互轉(zhuǎn)換、靶向插入和刪除[16]。該系統(tǒng)依賴于Cas9-nickase(H840A)、M-MLV-RT和先導(dǎo)編輯擴(kuò)展的指導(dǎo)RNA(pegRNA)，為反轉(zhuǎn)錄提供遺傳信息。

2 CRISPR/Cas體內(nèi)外的傳遞系統(tǒng)

CRISPR/Cas系統(tǒng)病毒和非病毒載體傳遞系統(tǒng)將CRISPR/Cas組分在體內(nèi)或培養(yǎng)細(xì)胞中傳遞。目前為止，AAV已成為視網(wǎng)膜靶向基因編輯最常用的傳輸載體，但也有其他的病毒載體存在，如LVs和腺病毒載體(Ads)。AAV是一種具有廣泛傳染性的非致病性DNA病毒，但由于AAV相對(duì)較小的裝載容量使得SpCas9和gRNA的同時(shí)運(yùn)送難以達(dá)成，因而促使雙載體AAV系統(tǒng)的開發(fā)，使其能分別攜帶SpCas9和gRNA，并在需要時(shí)攜帶外源性的健康cDNA。此外，為了避免裝載容量有限的問題，許多研究小組使用了來自金黃色葡萄球菌(SaCas9)、空腸彎曲菌(CjCas9)、嗜熱鏈球菌(StCas9)、腦膜炎奈瑟菌(NmCas9)和屬于V型CRISPR系統(tǒng)的AsCpf1、LbCpf1核酸酶的Cas序列，其特點(diǎn)是編輯效率與SpCas9相當(dāng)，且能識(shí)別出NGG以外的PAM，從而擴(kuò)展了目標(biāo)序列的組合[9]。除病毒傳遞外，非病毒傳遞同樣也是CRISPR/Cas系統(tǒng)的有效傳輸手段。第1種也是最簡單的方法是依賴質(zhì)粒對(duì)靶組織的電穿孔[17]。然而，這種技術(shù)對(duì)組織有很強(qiáng)的損傷，這使得質(zhì)粒電穿孔不適合用于患者的治療干預(yù)。第2種則是利用RNPs作為Cas9/gRNA復(fù)合物的傳遞方法，由于其能實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯和有效減少脫靶效應(yīng)，目前備受矚目[18]。除上述外，將陽離子脂質(zhì)包裝的Cas9-RNP進(jìn)行體內(nèi)注射的方法也被報(bào)道[19]。

3 基因編輯在視網(wǎng)膜疾病中的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)有可能直接糾正患者DNA中的突變，或消除顯性突變的表達(dá)，達(dá)到從源頭上治療疾病的目的，為遺傳性疾病的治療提供了更多的可能性和新的途徑。

3.1 基因編輯在隱性基因突變引起的視網(wǎng)膜色素變性中的應(yīng)用引起IRD的基因突變中約有1/3會(huì)導(dǎo)致非綜合征性視網(wǎng)膜色素變性(RP)[20]，由于RP中大多數(shù)突變基因編碼的蛋白質(zhì)在光感受器或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞中表達(dá)，因此RP的特征是視桿細(xì)胞變性，繼而視錐細(xì)胞丟失，最終導(dǎo)致患者的視覺缺損甚至失明。迄今為止，RP的治療方案旨在通過基因治療來糾正基因缺陷，或?qū)⒁暰W(wǎng)膜前體細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)移入玻璃體或視網(wǎng)膜下腔，同時(shí)利用膳食補(bǔ)充劑或細(xì)胞替代療法發(fā)揮獨(dú)立于遺傳缺陷的治療效果。盡管基因增強(qiáng)治療仍在進(jìn)行，但已有人用CRISPR/Cas9觸發(fā)的HDR來研究由不同基因(RPGR、MERTK、PDE6b、MAK、CEP290等)隱性突變引起的多種RP[21-24]。如前所述，CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的DSB可利用細(xì)胞HDR機(jī)制進(jìn)行精確的基因修飾，這一過程依賴于同源雙鏈DNA作為修復(fù)DNA合成的模板。在外源DNA模板存在的情況下，HDR途徑的精確修飾作用可以潛在地糾正導(dǎo)致RP的所有基因缺陷。然而，自然發(fā)生的HDR修復(fù)依賴于細(xì)胞有絲分裂，對(duì)于出生后失去分裂能力的多種體細(xì)胞(例如感光細(xì)胞)來說，HDR發(fā)生效率極低，難以實(shí)現(xiàn)在體基因修復(fù)。因此，對(duì)患者來源的iPS細(xì)胞進(jìn)行基因矯正，然后通過自體移植分化從而矯正視網(wǎng)膜細(xì)胞功能是一種有效的治療方案。Bassuk等[25]報(bào)道了一種新的CRISPR/Cas9方法，其可用來修復(fù)iPS細(xì)胞中RP調(diào)節(jié)基因ORF15外顯子的一種無意義突變，該突變可導(dǎo)致X性染色體連鎖遺傳性RP。HDR通過轉(zhuǎn)染含有SpCas9/gRNA成分的患者來源的IPS細(xì)胞和攜帶正確氨基酸序列的單鏈供體寡核苷酸(ssODN)模板，使13%無義突變得到糾正。這項(xiàng)研究將CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯與自體IPS細(xì)胞移植相結(jié)合，是開發(fā)針對(duì)IRD的個(gè)性化移植策略的第一步。

Jin小組還對(duì)RPGR基因的突變進(jìn)行了糾正[26]。他們從3例RPGR基因發(fā)生移碼突變(外顯子14或ORF15的突變)的患者中獲得iPS細(xì)胞，并誘導(dǎo)其分化為RPE細(xì)胞和3D視網(wǎng)膜，該策略的實(shí)施需要SpCas9/gRNA質(zhì)粒電穿孔患者來源的iPS細(xì)胞、攜帶正確第14位外顯子序列的供體模板質(zhì)粒和一個(gè)可切除的新霉素耐藥盒。在所選的12個(gè)新霉素的克隆中，有2個(gè)基因被糾正，并且在3D視網(wǎng)膜器官中分化后，顯示RPGR轉(zhuǎn)錄完全恢復(fù)，該視網(wǎng)膜中睫狀體病變?nèi)毕莸靡孕迯?fù)。

CRISPR介導(dǎo)的HDR策略可用來糾正Pde6β基因外顯子7中的Y347X突變，該基因在rodless-rd1小鼠中突變，是一種以光感受器退化和視力喪失為特征的RP模型[27]。將Cas9/gRNA和ssODN供體模板分別注入FVB/N自交系合子的原核和細(xì)胞質(zhì)中，產(chǎn)生11個(gè)供試者，檢測(cè)其基因缺陷的糾正情況。作者報(bào)道了與Bassuk等[25]研究相同的HDR效率，11位供試者中有2位(F0)將ssODN供體分別合并到36%和19%的體細(xì)胞中。盡管視網(wǎng)膜電圖(ERG)和光學(xué)相干斷層掃描(OCT)的分析結(jié)果顯示，這些小鼠視桿細(xì)胞的功能恢復(fù)是根據(jù)糾正細(xì)胞的百分比來決定的，但本研究CRISPR介導(dǎo)的HDR在體內(nèi)的可行性提供了明確的證據(jù)，證實(shí)了該策略潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。2017年，在患者來源的iPS細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種由于用HDR的方法來糾正3種RP而引起的突變：雄性生殖細(xì)胞相關(guān)激酶(MAK)基因的外顯子突變、CEP290基因的深內(nèi)含子隱剪接位點(diǎn)突變和RHO基因的顯性功能增益突變[28]。為了解決MAK基因第9位外顯子中Alu的純合子插入問題，將攜帶SpCas9和gRNA表達(dá)盒的質(zhì)粒與攜帶正確第9位外顯子序列的HDR供體質(zhì)粒以及可切除的嘌呤霉素耐藥盒共同轉(zhuǎn)染。經(jīng)過嘌呤霉素的篩選，1/6的耐藥菌落表現(xiàn)出單等位基因的糾正，從而使包含外顯子9的轉(zhuǎn)錄和全長MAK蛋白翻譯得以恢復(fù)[28]。

最近，一種類似于HDR介導(dǎo)的方法被用來糾正Mer酪氨酸激酶受體(MERTK)基因第7外顯子Ser331Cysfs*5突變引起的常染色體隱性RP(arRP)[29]?；颊邅碓吹膇PS細(xì)胞被RNP復(fù)合物核感染，RNP復(fù)合物由增強(qiáng)的特異性eSpCas9蛋白[30]和化學(xué)合成的crRNA和tracrRNA組成。與以往的研究不同的是，患者來源的iPS細(xì)胞由RNP復(fù)合物成核，該復(fù)合物由eSpCas9蛋白20和化學(xué)合成的crRNA和tracrRNAs組成，具有強(qiáng)特異性。與RNP一起提供了攜帶外顯子7部分正確序列的ssODN。利用高通量測(cè)序篩選個(gè)體克隆，以識(shí)別純合子或雜合子的校正。2個(gè)克隆均表現(xiàn)出多能性和正常核型。

最近有一項(xiàng)關(guān)于HDR介導(dǎo)的體內(nèi)arRP突變校正的開創(chuàng)性研究。Cai等[31]開發(fā)了一種基于HDR的Cas9/RecA系統(tǒng)，用于精確糾正出生后無瘤rd1小鼠的Pde6b錯(cuò)義突變。這個(gè)新的系統(tǒng)結(jié)合了大腸桿菌重組酶A(RecA)蛋白[32]和SpCas9/gRNA?；旧希琑ecA蛋白被MS2標(biāo)記，將RecA-MS2復(fù)合物與2個(gè)連接到以Pde6b位點(diǎn)外顯子7為靶點(diǎn)的gRNA的MS2 RNA結(jié)合序列連接。將ssODN供體模板與SpCas9和RecA-MS2-gRNA共同表達(dá)在新生rd1小鼠中，將錯(cuò)義突變還原為Tyr的WT序列編碼。電穿孔小鼠光感受器標(biāo)記物的免疫熒光分析顯示，Cas9/ reca介導(dǎo)的校正促進(jìn)了視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞光感受器的存活。此外，ERG分析顯示，與對(duì)照組相比，用Cas9/RecA系統(tǒng)處理的rd1小鼠的視覺功能增強(qiáng)。

3.2 基因編輯在隱性基因突變引起的Leber先天性黑矇中的應(yīng)用Leber先天性黑矇(LCA)可由17個(gè)基因突變引起，通常與常染色體隱性遺傳有關(guān)。超過一半的LCA是由于GUCY2D、CEP290和RPE65基因突變引起，這些突變會(huì)對(duì)視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞或RPE細(xì)胞的存活產(chǎn)生負(fù)面影響，并從患者出生起就開始導(dǎo)致視力下降。

基因增強(qiáng)治療是某一特定基因的常染色體隱性突變引起的IRD可行的候選方案。而由CEP290基因IVS26隱性突變引起的LCA 10型(LCA10)目前通過反義ODN[33]或CRISPR介導(dǎo)的治療得到解決[28,34-35]。內(nèi)含子突變產(chǎn)生一個(gè)新的剪接供體位點(diǎn)，該位點(diǎn)在異常剪接時(shí)，導(dǎo)致一半的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中都包含一個(gè)短的外顯子密碼，從而產(chǎn)生一個(gè)提前終止密碼子。因此，刪除包含IVS26突變的內(nèi)含子區(qū)域，可以恢復(fù)CEP290的表達(dá)。最近開發(fā)了一種針對(duì)內(nèi)含子26、結(jié)合SaCas9并包裝成AAV5載體的雙gRNA，并標(biāo)記為EDI 101產(chǎn)物[35]。該研究報(bào)道了一種有效和安全的基因編輯方法，可以對(duì)經(jīng)視網(wǎng)膜下注射EDI101的猴子進(jìn)行基因編輯。此外，他們還證明了視網(wǎng)膜下腔給藥在所有動(dòng)物中都具有良好的耐受性，而在非免疫抑制的猴子中只有輕微的炎癥可能與AAV5有關(guān)，這為第1種治療LCA10的CRISPR藥物鋪平了道路。

3.3 基因編輯在顯性基因突變引起的視網(wǎng)膜疾病中的應(yīng)用依賴NHEJ途徑的基因破壞是發(fā)展中的RDs尤其是那些由顯性突變引起的RD最常用的治療方法。在功能不佳的應(yīng)激細(xì)胞中，顯性等位基因的缺失可能導(dǎo)致該等位基因編碼蛋白質(zhì)的逐漸減少，而WT基因的持續(xù)表達(dá)則可以增強(qiáng)這些剩余細(xì)胞的功能。在這方面，有效區(qū)分突變體和寬型等位基因，確保突變體的特異性中斷是成功的關(guān)鍵。Bakondi等[36]研究表明，在攜帶S334ter鼠類視紫紅質(zhì)等位基因的轉(zhuǎn)基因大鼠模型中，spcas9/gRNA組分的電穿孔導(dǎo)致突變等位基因的破壞，從而防止視網(wǎng)膜退化和改善視功能。然而該策略不能區(qū)分WT和突變等位基因，因此不能用于未來的臨床應(yīng)用。有研究者介紹了更為實(shí)用和符合生理特性的方法來抑制視紫紅質(zhì)基因的顯性突變[37-38]。兩組都設(shè)計(jì)了一個(gè)P23H特異的gRNA來敲除P23H基因敲入小鼠中的突變小鼠的等位基因，并將工程化的SpCas9 VQR變體與特異性的gRNA結(jié)合，主要插入突變等位的基因上[37]。Li等[38]將5’端截短的17-核苷酸gRNA與SpCas9 VRQR 結(jié)合，通過視網(wǎng)膜下注射質(zhì)粒和電穿孔，使突變體和WT等位基因的鑒別更為高效。然而，這種方法的臨床應(yīng)用可能很困難，因?yàn)樾枰秩胄允中g(shù)將微電極放置在目標(biāo)細(xì)胞附近以限制組織損傷。相反，Giannelli等[37]將Cas9和gRNA包裝在2個(gè)帶有人工合成衣殼變體(AAV9-php)的AAV9載體中。通過玻璃體內(nèi)注射可以更有效地高水平(70%)轉(zhuǎn)導(dǎo)視桿細(xì)胞光感受器。提示使用傳輸系統(tǒng)部分恢復(fù)視網(wǎng)膜功能具有廣大前景。

視紫紅質(zhì)基因突變占常染色體顯性遺傳RP的30%和IRD的15%，為了將基因編輯方法擴(kuò)大到視紫紅質(zhì)基因的150多個(gè)突變的絕大多數(shù)中，提出了一種不依賴于突變的敲除策略。2016年，Latella等[17]在電穿孔的P23H轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種SpCas9表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶2個(gè)gRNA，位于人視紫紅質(zhì)基因P23H突變的兩側(cè)。該研究證實(shí)了CRISPR介導(dǎo)的人突變型視紫紅質(zhì)基因的體內(nèi)敲除效力，為Tsang團(tuán)隊(duì)最近采用的聯(lián)合基因消融和替換策略奠定了基礎(chǔ)[39]。Tsai等[39]報(bào)道了一項(xiàng)對(duì)攜帶P23H或D190N突變的2個(gè)敲入小鼠進(jìn)行的概念驗(yàn)證研究，表明切除和替換策略可以改善疾病進(jìn)展，這在2種突變均存在的敲入小鼠模型的光感受器結(jié)構(gòu)和功能檢測(cè)中得到驗(yàn)證。這一策略原則上可用于治療與RP相關(guān)的RHO基因的所有突變，從而避免疾病的等位異質(zhì)性。類似的方法也被用于治療小鼠和靈長類動(dòng)物的常染色體顯性錐桿營養(yǎng)不良癥(CORD6)[40]。該病是由編碼視網(wǎng)膜鳥苷酸環(huán)化酶-1(retGC1)的GUCY2D基因的顯性突變引起，該蛋白在光感受器受體中表達(dá)，參與光轉(zhuǎn)導(dǎo)后恢復(fù)暗狀態(tài)所需的cGMP的重新合成。Mccullough等[40]提出用非突變cas9/gRNA方法阻斷野生型和突變型內(nèi)源性GUCY2D等位基因的表達(dá)，并對(duì)抗基因編輯的野生型GUCY2D cDNA進(jìn)行補(bǔ)充，獲得了抗基因編輯的AAV載體。在這項(xiàng)研究中，作者只報(bào)道了治療策略的第一部分，即在視網(wǎng)膜下腔注射2個(gè)AAV，一個(gè)表達(dá)SpCas9，另一個(gè)攜帶與GUCY2D基因第4外顯子相結(jié)合的gRNA，消融獼猴光感受器內(nèi)源性等位基因GUCY2D。他們證明了在經(jīng)過治療的眼睛中retGC1的表達(dá)大幅降低，這證明了在靈長類動(dòng)物中使用AAV-CRISPR/Cas9進(jìn)行體細(xì)胞基因編輯的能力。

3.4 基因編輯在在非特定致病基因引起的視網(wǎng)膜色素變性中的應(yīng)用一種不針對(duì)特定致病基因的視網(wǎng)膜變性基因治療方法已被提出。棒狀神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈(Nrl)基因[41]或其下游轉(zhuǎn)錄因子Nr2e3[42]的基因敲除研究在成年小鼠視桿細(xì)胞中成功地進(jìn)行了桿狀-錐狀重編程。視錐細(xì)胞對(duì)視桿細(xì)胞感光細(xì)胞上RP特異性基因的突變具有抗性，從而防止了繼發(fā)性視錐細(xì)胞的丟失。Yu等[41]利用表達(dá)Nrl基因第3外顯子的SpCas9和gRNA的2個(gè)AAV，對(duì)3個(gè)視網(wǎng)膜退行性變小鼠模型(Rho-/-、Rd10和Rho-p347s)進(jìn)行了視網(wǎng)膜下腔注射。他們發(fā)現(xiàn)接受Nrl消融治療的視桿細(xì)胞對(duì)突變型視紫紅質(zhì)蛋白或PDE6β缺陷的有害影響更具抵抗力，從而有助于延長視錐細(xì)胞的存活時(shí)間。CRISPR介導(dǎo)的Nrl轉(zhuǎn)錄調(diào)控最近也被Mali團(tuán)隊(duì)提出作為一種治療RP的方法[43]。作者利用由dCas9融合到KRAB結(jié)構(gòu)域的AAV-split-Cas9載體平臺(tái)誘導(dǎo)Nrl的轉(zhuǎn)錄抑制而無需對(duì)基因組進(jìn)行永久性的修飾。他們報(bào)道了rd10小鼠治療后眼睛的外層核層(ONL)變厚，證明其阻止了光感受器的退化并保留了ONL，同時(shí)通過視覺運(yùn)動(dòng)性眼球震顫檢查，證明改善了視覺變性功能。

3.5 基因編輯在年齡相關(guān)性黃斑變性中的應(yīng)用CRISPR基因編輯技術(shù)也可用于治療非遺傳性的多因素RD，如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)。正如抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)藥物所證明的那樣，永久性抑制RPE細(xì)胞中的VEGF可能有一定的益處。這可以通過CRISPR介導(dǎo)敲除促血管生成因子VEGF來阻止新血管生成來實(shí)現(xiàn)。Kim等[44]報(bào)道了于項(xiàng)關(guān)于CRISPR/Cas系統(tǒng)治療AMD的研究。他們開發(fā)了攜帶CjCas9的AAV9載體和根據(jù)Vegfa基因定制的gRNA,Vegfa基因在視網(wǎng)膜中的表達(dá)與脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)有關(guān)。載體經(jīng)玻璃體內(nèi)注射到RPE細(xì)胞。注射后6周，他們通過激光治療在眼內(nèi)誘發(fā)CNV，1周后，他們觀察到由于RPE 細(xì)胞中Vegfa表達(dá)的部分抑制，CNV區(qū)域明顯縮小。Kim團(tuán)隊(duì)利用SpCas9和包裝成RNP的vegfa特異性gRNA，增強(qiáng)了CRISPR/ Cas9系統(tǒng)對(duì)于AMD的效力[19]。在之前的研究中，他們觀察到在視網(wǎng)膜下腔注射Vegfa-RNP的小鼠與對(duì)照組相比，CNV區(qū)域明顯減少。雖然RPE細(xì)胞的編輯作用僅限于注射部位，激光誘導(dǎo)的小鼠CNV模型不適合多次注射Cas9 RNP，但作者證明眼內(nèi) AAV-CjCas9系統(tǒng)在注射14個(gè)月后仍具有持久、有效和安全的作用[45]。此外，Kim的研究小組利用LbCpf1核酸內(nèi)切酶下調(diào)小鼠視網(wǎng)膜Vegfa的表達(dá)[46]，LbCpf1核酸酶作為CjCas9，體積相對(duì)較小(3.7 kb)，與攜帶Vegfa特異性crRNA的AAV9載體的包裝容量相兼容。單個(gè)載體通過玻璃體內(nèi)注射進(jìn)入小鼠視網(wǎng)膜。作者觀察到Vegfa的破壞導(dǎo)致激光誘導(dǎo)的CNV面積的長期減少，而沒有引起視錐細(xì)胞的功能障礙。Huang等[47]開發(fā)了一種針對(duì)血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，作為治療AMD的一種替代策略。他們將特異性表達(dá)VEGFR2的SpCas9和gRNA包裝到AAV1中，AAV1是小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的合適血清型。在玻璃體內(nèi)注射雙重AAV載體7 d后，他們觀察到在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型中，激光誘導(dǎo)的CNV減少以及血管生成阻滯。

4 結(jié)語

運(yùn)用基因編輯技術(shù)基因治療并不局限于提供外源性轉(zhuǎn)基因治療單基因疾病這一單一現(xiàn)象。進(jìn)行精確基因組修飾的治療潛力極具吸引力，但在臨床試驗(yàn)期間必須密切監(jiān)測(cè)與CRISPR/Cas基礎(chǔ)技術(shù)有關(guān)的安全方面[9]:AAV 持續(xù)存在并可能整合到DSB中; 全基因組非靶點(diǎn); Cas9蛋白的免疫原性; 以及p53腫瘤抑制基因的激活。因此，改進(jìn)給藥方法，檢測(cè)罕見突變和量化其潛在風(fēng)險(xiǎn)，抵抗免疫反應(yīng)和凋亡信號(hào)將對(duì)未來的臨床進(jìn)展非常重要。盡管存在上述挑戰(zhàn)，針對(duì)LCA10的基因編輯治療目前正處于一期和二期臨床試驗(yàn)，這表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)治療視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良在安全性和有效性方面具有治療潛力。