Usher綜合征的分子遺傳學(xué)研究及治療進(jìn)展

王肅旸 劉曉雯 郭玉芬,3

Usher綜合征(Usher syndrome, USH)又稱遺傳性聾-視網(wǎng)膜色素變性綜合征，是以感音神經(jīng)性聾和漸進(jìn)性視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)為主要臨床表現(xiàn)的一種常染色體隱性遺傳性疾病，主要影響聽覺、視覺和平衡覺。據(jù)估計(jì)全球約有40萬患者，普通人群中USH發(fā)病率約為3/100 000～6.2/100 000,占所有先天性聾的5%及RP病例的18%。Usher綜合征具有臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性，分為三種不同的臨床亞型，與多個(gè)基因位點(diǎn)相關(guān)。Usher基因編碼多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在內(nèi)耳和視網(wǎng)膜中表達(dá)，在感覺毛細(xì)胞發(fā)育和功能以及光感受器維持方面發(fā)揮重要功能。雖然許多治療相關(guān)的研究前景可觀，然而臨床上尚缺乏對(duì)其公認(rèn)有效的治療手段。

1 Usher綜合征遺傳學(xué)

目前已鑒定出USH至少10個(gè)致病基因，包括6個(gè)USH1基因、3個(gè)USH2基因和1個(gè)USH3基因。在USH家系中，NGS的診斷率可達(dá)到70%～80%左右。最新的一項(xiàng)Meta分析納入了11項(xiàng)研究報(bào)告[1]，684名USH患者，91%(624/684)的患者通過鑒定USH基因的雙等位致病突變進(jìn)行了分子診斷。對(duì)每個(gè)USH基因的雙等位基因致病突變率進(jìn)行評(píng)估，按致病頻率分類依次為：USH2A：50%(341/684)，MYO7A：21%(144/684)，CDH23：6%(39/684)，ADGRV1：5%(35/684)，PCDH15：3%(21/684)，USH1C：2%(17/684)，CLRN1：2%(14/684)，USH1G：1%(9/684)，WHRN：0.4%(3/684)，PDZD:70.1%(1/684)，CIB2:0(0/684)。按照臨床亞型的頻率分別為：①USHI：33.6%(230/684)；②USH2：55.6%(380/684)；③USH3：1%(14/684)；④USH基因未發(fā)現(xiàn)致病突變：8.8%(60/684)。

USH基因編碼的蛋白具有多種結(jié)構(gòu)和功能作用，包括肌球蛋白VII a(myosin VIIA:USH1B)，細(xì)胞粘附分子(cadherin 23:USH1D; protocadherin 15:USH1F; usherin:USH2A)，支架蛋白(harmonin:USH1C; sans:USH1G; whirlin: USH2D)，G蛋白偶聯(lián)受體(ADGRV1: USH2C)，鈣整合素結(jié)合蛋白(CIB2: USH1J)和跨膜蛋白(clarin-1: USH3A)。當(dāng)這些基因在耳蝸、橢圓囊、球囊和三個(gè)半規(guī)管的毛細(xì)胞以及視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞上高表達(dá)，參與了凝聚、機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸配對(duì)以及蛋白質(zhì)和細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)纫幌盗羞^程，將導(dǎo)致耳聾(伴有或不伴有平衡功能下降)和失明。USH分為3型:Usher Ⅰ型、UsherⅡ型、UsherⅢ型。

1.1Usher I型 Usher I型(USH1)是最嚴(yán)重的亞型，主要表現(xiàn)為先天性嚴(yán)重的耳聾及前庭功能異常，夜盲的癥狀出現(xiàn)得較USH2患者早,約占所有Usher綜合征病例的25%～44%(Reiners等，2006)。大部分患兒聽力損失較重，不能通過新生兒聽力篩查。前庭反射表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，通常在18個(gè)月前不能獨(dú)立行走。他們會(huì)通過視覺來補(bǔ)償前庭反射，直到RP發(fā)作，但在需要保持平衡的的活動(dòng)中(比如騎自行車)更容易摔倒。這類患兒往往需要早期植入人工耳蝸幫助他們回歸主流社會(huì)。

目前已知的與USH1相關(guān)的基因有9個(gè)(USH1B-J)，已鑒定6個(gè)基因：MYO7A(USH1B)，USH1C(USH1C)，CDH23(USH1D)，PCDH15(USH1F)，USH1G(USH1G)和CIB2(USH1J)。半數(shù)以上USH1病例由MYO7A所致。USH1E、USH1H和USH1K基因座已分別定位于染色體21q21、15q22-23和10p11.21-q21.1，但尚未確定。

1.2UsherⅡ型 UsherⅡ型(USH2)發(fā)病率最高，約占70%(Reiners等，2006)，主要表現(xiàn)為先天性非進(jìn)行性中至重度感音神經(jīng)性聾，前庭功能正常，青春期或之后發(fā)生雙眼RP；聽力損失的典型特征表現(xiàn)為下降型曲線[2]。由于聽力損失為先天性，也難以通過新生兒聽力篩查，若沒有行聽力篩查，高頻聽力損失在10歲左右才被診斷[3]。但有報(bào)道USH2A患者聽力損失逐年加重(Sadeghi等，2004)。大部分患兒配戴助聽器可與人正常交流，約10%的USH 2A型患者植入了人工耳蝸。USH2患者前庭功能正常，但有眩暈發(fā)作的報(bào)道[4]，因此在后期研究中應(yīng)當(dāng)關(guān)注前庭系統(tǒng)的亞臨床變化。USH2的三個(gè)基因被鑒定為USH2A(USH2A)、ADGRV1(USH2C)和WHRN(USH2D)。USH2A突變是USH的最常見原因，約占USH2病例的80%[5]。

1.3Usher Ⅲ型 Usher Ⅲ型(USH3)主要表現(xiàn)為語(yǔ)后進(jìn)行性雙側(cè)對(duì)稱性感音神經(jīng)性聾，前庭功能可能出現(xiàn)下降，或伴有20歲以前出現(xiàn)的RP。該型主要在芬蘭和德系猶太人中流行(Ness等，2003)，大多數(shù)人群中很少見，約占所有病例的2%～4%。該型聽力及前庭特征等臨床表型變異最大，聽力損失主要表現(xiàn)為語(yǔ)后進(jìn)行性雙側(cè)對(duì)稱性感音神經(jīng)性聾,聽力圖通常顯示高頻聽力損失或中高頻損失為主。大多數(shù)患者于16個(gè)月左右可獨(dú)立行走，約一半的患者存在前庭功能異常(Sadeghi等，2005), RP發(fā)生時(shí)間和程度表現(xiàn)各異。CLRN1(USH3A)是目前唯一被證實(shí)導(dǎo)致USH3的基因，有兩個(gè)先天突變，p(Tyr176*)和p.*Asn48Lys，分別在芬蘭[8]和德系猶太人群(Rr Fields等，2002)中檢出。此外，在兩名表型與USH3相關(guān)的患者中發(fā)現(xiàn)了組氨酰-tRNA合成酶(HARS)的純合子錯(cuò)義變體(histidyl-tRNA synthetase，HARS)[6]。

近年來有學(xué)者將在臨床表型上相似但與上述三種類型不能匹配的非典型USH歸類為一個(gè)新的亞型，即USH4型[7]。

2 基因型-表型相關(guān)性

Usher基因顯示出巨大的臨床異質(zhì)性，大多數(shù)Usher基因的不同突變與常染色體隱性遺傳性RP或常染色體顯性或隱性感音神經(jīng)性聾(DFNA或DFNB)的非綜合征病例有關(guān)，例如MYO7A突變，它與顯性和隱性非綜合征型聽力損失有關(guān)(分別為DFNA11[OMIM#601317]和DFNB2[OMIM#600060])。導(dǎo)致DFNB2的MYO7A突變與引起USH1的突變相似，這種表型是由缺失的RP引起的，還是可能存在影響表型的修飾因素？有報(bào)道MYO7A突變導(dǎo)致中國(guó)人群USH1和USH2單側(cè)聽神經(jīng)病的表型，擴(kuò)大了USH的表型譜。在其他USH1基因中，CDH23和PCDH15均存在基因型-表型相關(guān)性；錯(cuò)義突變主要與非綜合征型聾(DFNB12[OMIM#601386]或DFNB23[OMIM#609533])或更輕微的RP癥狀有關(guān)，而移碼、無義和剪接位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致USH1。

USH2A有多種突變譜，包括無義突變、移碼突變、錯(cuò)義突變和剪接突變，以及缺失和重復(fù)。在USH2A中發(fā)現(xiàn)的最常見的突變是外顯子13 c.2299delG p.(Glu767Serfs*21)的單堿基對(duì)缺失，這已被證明與外顯子剪接有關(guān)[8]。USH2A的突變與23%的非綜合征型RP病例有關(guān)，在這些患者和家系中特定的突變等位基因更常見，最常見的是錯(cuò)義變體c.2276G>T p(Cys759Phe)。Lenassi等[9]報(bào)道了一個(gè)罕見家系，一名非綜合征型聽力損失患者被檢出USH2A復(fù)合雜合突變——c.1036A>C p.(Asn346His)和c.13316C>T p.(Thr4439Ile)，但是他的兄弟姐妹攜帶相同的突變，并被診斷為典型的USH2。

到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了數(shù)項(xiàng)USH2A表型相關(guān)研究。Lenassi等[10]對(duì)USH2A相關(guān)RP患者進(jìn)行的一項(xiàng)調(diào)查報(bào)告了幾個(gè)在USH2家族中很少發(fā)現(xiàn)的“視網(wǎng)膜疾病特異性”等位基因，大多是危害較小的錯(cuò)義變異，而Usher相關(guān)變異大多包括那些被預(yù)測(cè)不會(huì)產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)的基因(例如，那些導(dǎo)致過早截?cái)嗟幕?。他們提出了一個(gè)等位基因?qū)哟文Ｐ?，USH2A相關(guān)視網(wǎng)膜病變患者中，至少有一個(gè)視網(wǎng)膜疾病特異性等位基因的存在。雖然沒有得到后續(xù)研究的支持，但對(duì)不同的隊(duì)列研究分析發(fā)現(xiàn)，等位基因?qū)哟文Ｐ驮?6%的非綜合征型USH2A——RP個(gè)體中是有效的。此外，據(jù)報(bào)道，與普通的USH2患者相比，攜帶p.(Cys759Phe)等位基因的USH2A患者出現(xiàn)RP的時(shí)間更晚，聽力損失也更輕[4]，而p.(Cys759Phe)變異的純合突變或與其他USH2A的復(fù)合雜合突變與孤立性RP/RP伴發(fā)遲發(fā)性聽力損失相關(guān)。相比之下，p.(Glu767Serfs*21)變異導(dǎo)致病情進(jìn)展迅速，預(yù)后不良，需要?jiǎng)討B(tài)的聽力學(xué)監(jiān)測(cè)并考慮早期人工耳蝸植入[11]。一般來說，嚴(yán)重的聽力障礙與USH2A基因的截?cái)嗤蛔冇嘘P(guān)。對(duì)USH2A基因型-表型相關(guān)性的進(jìn)一步研究表明，該基因N端層粘連蛋白結(jié)構(gòu)域存在兩個(gè)截?cái)嗤蛔兓騼蓚€(gè)錯(cuò)義變異與USH 2患者相關(guān)，而與非綜合征型RP患者無關(guān)，且至少一個(gè)截?cái)嗤蛔兊拇嬖谂c早期視力下降有關(guān)，而與表型無關(guān)[12]。

1999年，Adato等在一個(gè)非近親的猶太也門裔家庭中發(fā)現(xiàn)2例患者具有不同的臨床表型，其中1例患者表現(xiàn)為USH1的臨床表型，另外一例患者表現(xiàn)為USH3的臨床表型。作者在此后的研究中發(fā)現(xiàn)，在同一家系中出現(xiàn)不同的臨床表型是由于USH1表型的患者攜帶MYO7A的復(fù)合雜合變異，而攜帶USH3單倍型的純合變異的患者表現(xiàn)為USH3的表型。Ness等(2003)也在40例患有USH的德系猶太人群中發(fā)現(xiàn)，16例臨床分類為III型USH的患者，雖然所有患者均為CLRN1基因變異所致，但N48K純合子表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的臨床表型，聽力學(xué)表現(xiàn)尤為突出，發(fā)病年齡從嬰兒期到35歲以上不等。Aller等(2004)在西班牙USH3家系中的患者也表現(xiàn)出語(yǔ)前雙側(cè)對(duì)稱性重度進(jìn)行性感音神經(jīng)性聾(6歲：平均聽閾70 dB HL；17歲：平均聽閾>90 dB HL)。這些結(jié)果表明，臨床上USH3與USH1或USH2可能存在混淆；另一方面，由于出現(xiàn)遲發(fā)性和進(jìn)行性聽力損失，臨床上發(fā)現(xiàn)與USH3相符的一些患者攜帶USH2A、USH1B和USH1D變異。因此，根據(jù)結(jié)果和文獻(xiàn)回顧，進(jìn)行性感音神經(jīng)聾和語(yǔ)后聾并不是診斷和鑒別USH3的重要標(biāo)準(zhǔn)。隨著病例資料的逐步增多，USH3臨床表型出現(xiàn)更多的表現(xiàn)形式，相比較于臨床表型對(duì)USH的診斷，基因診斷更為明確和可靠。

3 USH治療的進(jìn)展

3.1臨床前研究 Usher相關(guān)的RP和其他視網(wǎng)膜疾病(IRD)的治療還沒有非常有效的方法，許多治療策略正在臨床前期或臨床Ⅰ/Ⅱa研究階段，其中包括基因替代、基因編輯、蛋白抑制和基于反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide ASO)的方法。絕大多數(shù)USH的治療研究都是使用患者來源的細(xì)胞(通常是成纖維細(xì)胞)或突變小鼠進(jìn)行的，但是大部分小鼠模型僅表現(xiàn)出感音神經(jīng)性聽力損失和前庭功能障礙表型，只有少數(shù)小鼠模型表現(xiàn)出進(jìn)行性視網(wǎng)膜變性。

3.1.1基因置換 基因置換在幾種Usher小鼠模型中有效：腺相關(guān)病毒(AAV)載體已經(jīng)通過視網(wǎng)膜下注射在Myo7a、Whrn131和Clrn1134基因敲除小鼠體內(nèi)，以恢復(fù)在每種模型中存在缺陷的Usher基因的表達(dá)，雙重疊AAV載體也已經(jīng)作為一種潛在更安全的大基因替代載體進(jìn)行了測(cè)試，取得了良好的效果。慢病毒載體的運(yùn)載能力更強(qiáng)，卻存在插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，通過慢病毒載體向USH1B小鼠模型視網(wǎng)膜運(yùn)送功能性Myo7a獲得成功[13]。在USH1C、USH1G、USH2D和USH3小鼠模型中，通過小鼠的圓窗膜或后半規(guī)管向內(nèi)耳注射AAV載體也顯著改善了小鼠的內(nèi)耳毛細(xì)胞功能。

小鼠的內(nèi)耳在出生時(shí)尚不成熟，出生后會(huì)繼續(xù)發(fā)育，大概在出生后12天驚嚇反應(yīng)陽(yáng)性，這為基因療法的有效干預(yù)提供了機(jī)會(huì)窗口。相比之下，人類的聽力在孕19周始出現(xiàn)驚嚇反應(yīng)，出生時(shí)完全成熟。USH1為先天性聽力損失，在孕前或者孕0～18周進(jìn)行一級(jí)預(yù)防是否有效仍需進(jìn)一步研究。

3.1.2基因編輯 另一種治療方法是基因編輯，包括核酸酶來消除基因突變，與包含野生型序列的DNA模板進(jìn)行同源重組來糾正DNA錯(cuò)誤，用于糾正點(diǎn)突變、小插入/缺失和剪接點(diǎn)突變。近年來，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其高效和易于使用而在基因編輯中廣受歡迎。該技術(shù)已成功地用于USH2A患者成纖維細(xì)胞突變修復(fù)以及患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)，包括USH2A(Glu767Serfs*21)純合突變或(Glu767Serfs*21)/(Cys759Phe)復(fù)合雜合突變[14]。兩項(xiàng)研究都沒有報(bào)道脫靶效應(yīng),在成纖維細(xì)胞中，突變矯正率僅為2.5%，而在iPSCs中，突變矯正率高達(dá)3%。因此確保效應(yīng)器官的靶點(diǎn)效應(yīng)和高水平的編輯效率將是未來研究的關(guān)鍵。

3.1.3蛋白抑制 Alagramam等[15]通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)另一種小分子——BioFocus 844(BF844)，經(jīng)腹腔注射到USH3敲入小鼠模型時(shí)，能夠穩(wěn)定CLRN1 p.(Asn48Lys)錯(cuò)義突變產(chǎn)生的有缺陷的Clarin1蛋白，從而防止進(jìn)行性聽力損失。

3.1.4基于反義寡核苷酸(ASO)的方法 另一種治療方法是使用ASO，這是一種短的人工修飾核酸，它通過互補(bǔ)堿基配對(duì)與RNA結(jié)合。ASO可以被設(shè)計(jì)成與剪接增強(qiáng)子或沉默靶部位的前mRNA結(jié)合，阻止或促進(jìn)剪接體的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)前mRNA的剪接。已經(jīng)用ASOs治療USH1c敲入小鼠的聽力和前庭缺陷，這種小鼠具有隱蔽的剪接位點(diǎn)突變，導(dǎo)致蛋白被截?cái)?。Depreux等[16]通過新生小鼠的腹膜注射ASOs部分糾正了突變的USH1c轉(zhuǎn)錄本的前mRNA剪接缺陷；在同一實(shí)驗(yàn)中，還將ASOs注射到羊膜腔內(nèi)給USH1c敲入胎鼠，并觀察到出生后小鼠的前庭功能和聽力的部分糾正；Wang等[17]在胎鼠第13～13.5天將ASO經(jīng)羊膜腔直接注射到內(nèi)耳，可糾正Harmonin RNA剪接，恢復(fù)感覺毛細(xì)胞束中Harmonin蛋白的表達(dá)，防止毛細(xì)胞丟失，提高聽覺敏感度，并改善前庭功能障礙,聽力和前庭功能的改善一直持續(xù)到成年。ASOs還被用于糾正USH2A基因深度內(nèi)含子突變(C.7595-2144A>G)導(dǎo)致的剪接缺陷，該突變導(dǎo)致在患者來源的成纖維細(xì)胞和微基因剪接試驗(yàn)中插入偽外顯子(PE40)。

總體而言，在針對(duì)Usher亞型的治療方面，近年來涌現(xiàn)了許多前景光明的治療策略。

3.2臨床試驗(yàn) 基于臨床前研究的成功，目前已有數(shù)項(xiàng)針對(duì)Usher相關(guān)性RP患者臨床試驗(yàn)。在Usher特異性基因治療方面，第一個(gè)臨床試驗(yàn)評(píng)估視網(wǎng)膜下注射基于馬傳染性貧血病毒(EIAV)的重組慢病毒載體(UshStat)治療MYO7A相關(guān)USH1(NCT01505062)的效果[13]。但是，由于審查臨床開發(fā)計(jì)劃和優(yōu)先事項(xiàng)，贊助商賽諾菲已經(jīng)終止了這項(xiàng)I/IIA期試驗(yàn)。另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在準(zhǔn)備中，使用雙雜交AAV載體將MYO7A運(yùn)送到USH1B患者的視網(wǎng)膜(https://cordis.europa.eu/project/id/754848/it)?？紤]到FDA和歐洲藥品管理局(European Medicines Agency)已經(jīng)批準(zhǔn)Spark Treeutics Luxturna基因療法用于RPE65相關(guān)視網(wǎng)膜疾病患者，基因替代療法將成為未來更有可能用于治療幾種Usher亞型的選擇。然而，其缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，而且傳統(tǒng)的病毒方法不適合像USH2A這樣的非常大的基因(cDNA長(zhǎng)度>15 kb)。

在RP的治療中，桿源性視錐細(xì)胞存活因子(RdCVF)的病毒傳遞也在研究中；RdCVF是一種由視桿細(xì)胞自然分泌的保護(hù)視錐感光細(xì)胞的因子，已被發(fā)現(xiàn)在病毒介導(dǎo)的視網(wǎng)膜表達(dá)后促進(jìn)RP小鼠模型的光感受器存活。如果該方法對(duì)人類有效，可能適用于大量未經(jīng)分子診斷的IRD患者。

Usher綜合征和其他IRDs的治療方法的選擇與疾病的分期息息相關(guān)?，F(xiàn)有的治療方法可能只有在視網(wǎng)膜光感受器未受損的階段才有效。在視網(wǎng)膜變性的晚期，細(xì)胞替代療法或視網(wǎng)膜假體可能是最可行的選擇。胚胎干細(xì)胞和iPSC技術(shù)的進(jìn)步使細(xì)胞移植成為晚期視網(wǎng)膜疾病患者的希望[18]。作為干細(xì)胞眼科治療研究的一部分，骨髓來源干細(xì)胞(BMSC)已經(jīng)在5名患有不同亞型的Usher綜合征的未分型患者身上進(jìn)行了試驗(yàn)[19]。治療前平均視敏度0.635 LogMAR，術(shù)后平均提高0.18 LogMAR。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn) Clarin1僅限于視網(wǎng)膜Müller膠質(zhì)細(xì)胞，在小鼠視網(wǎng)膜中，已發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性骨髓來源干細(xì)胞(BMSC)在損傷后遷移并與Müller膠質(zhì)細(xì)胞融合，由此產(chǎn)生的雜交細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)有助于替換受損的神經(jīng)元，顯示了哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中BMSC的再生潛力。

雖然目前還沒有針對(duì)Usher特異性聽力損失的臨床試驗(yàn)，但有一項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，含有人無性轉(zhuǎn)錄因子(Atoh1)cDNA的重組腺病毒5(Ad5)載體迷路注射可治療重度至極重度感音神經(jīng)性聾患者(NCT02132130),研究結(jié)果尚未公布。幾個(gè)Usher小鼠突變體的成功臨床前工作使基因治療成為炙手可熱的研究方向；然而，這些治療是在小鼠內(nèi)耳仍在發(fā)育的情況下進(jìn)行的，對(duì)USH兒童或成人是否有效仍尚未定論。

4 結(jié)論

Usher綜合征是一種具有廣泛的臨床和遺傳異質(zhì)性的疾病，通常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的聽覺和視覺雙重感覺喪失，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成極大的影響。近些年由于分子遺傳學(xué)的發(fā)展，對(duì)USH的診斷和病因研究取得了很大的進(jìn)展，但是，對(duì)于USH引起的視力下降、聽力損失和前庭功能損傷并未有效的預(yù)防措施和阻止手段，因此，對(duì)患者進(jìn)一步臨床分型并預(yù)測(cè)預(yù)后顯得尤為重要，這將為后期的遺傳咨詢、人工耳蝸植入前診斷提供有效信息。