L-肉堿對草龜攝食生長和身體組成的影響

武 帆，程 麗，印麗云，楊振才

（1.河北師范大學生命科學學院，河北石家莊 050024；2.青島科技大學化學與分子工程學院，山東青島 266042）

草龜（Chinemys reevesiis），又名烏龜、泥龜和金龜?shù)龋`屬于爬行綱、龜鱉目、龜科，具有較高的食用、藥用和觀賞價值。草龜喜靜不喜動，在高密度養(yǎng)殖中活動量更小，而市售龜飼料的蛋白質(zhì)、脂肪含量和能值較高，過剩的能量轉(zhuǎn)化為脂肪，沉積在肝臟、腹腔或四肢內(nèi)，使肝臟發(fā)生脂肪變性，引起脂肪肝病變。因此，需要調(diào)節(jié)脂肪代謝、降低身體內(nèi)脂肪含量、促進其健康生長。

研究表明，L-肉堿作為一種綠色安全的飼料添加劑，具有一定的降脂、促生長等作用。水產(chǎn)動物高密度養(yǎng)殖可能會導致其內(nèi)源性L-肉堿合成能力的降低，從而使體內(nèi)現(xiàn)有的L-肉堿水平不能滿足生長代謝的需求，進而影響動物的正常生理功能（Li 等，2019）。因此越來越多的水產(chǎn)配合飼料中添加L-肉堿，以求滿足水產(chǎn)動物基本的營養(yǎng)代謝需求。然而，肉堿對不同水產(chǎn)動物的作用不同（杜震宇等，2002），有些種類的飼料中添加外源性L-肉堿可顯著提高生長性能和飼料效率，如銀鱸（bidyanus bidyanus）、虹 鱒（Oncorhynchus mykiss）和異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）等（Yang 等，2012；Dikel 等，2010；章世元等，2009）；也有些種類的生長沒有明顯改善，如里海擬鯉（Rutilus rutilus caspicus）和羅非魚（Oreochromis spp）等（Kordi 等，2012；杜震宇等，2002）。目前，L-肉堿對水產(chǎn)動物影響的研究主要集中在魚類，其對水生爬行動物的研究鮮見報道。因此，本試驗以草龜為試驗對象，測定飼料中添加不同劑量的L-肉堿對草龜攝食生長和身體組成方面的影響，為肉堿在草龜飼料中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 本研究設置飼料中L-肉堿添加水平為0、100、200、300、400 mg/kg 和500 mg/kg的6 個試驗組（L0 組為對照組，L1～L5 組為肉堿添加組），每個試驗組設置8 個重復養(yǎng)殖缸，每個重復缸內(nèi)養(yǎng)殖10 只龜，共480 只龜。

1.2 試驗材料 試驗所用草龜稚龜購自湖北省天門市草龜養(yǎng)殖場，初均重為（8.28±0.54）g，共計1000 只。試驗所用基礎飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。為測定消化率，在飼料中加入0.1%的Y2O3作為標記物。將原料粉碎、過80 目篩，采用雙螺桿膨化機（北京現(xiàn)代機械技術(shù)有限公司）調(diào)制、擠壓、膨化成顆粒，穩(wěn)定干燥后噴涂豆油。

表1 試驗飼料組成及主要營養(yǎng)水平

1.3 試驗條件 養(yǎng)殖試驗在河北師范大學水產(chǎn)動物養(yǎng)殖實驗室進行。試驗用龜被養(yǎng)殖在直徑為60 cm，高為70 cm 的48 個養(yǎng)殖缸中，缸內(nèi)均配有電子溫控儀，以保證試驗期間的水溫維持在（30±0.1）℃。為保持水質(zhì)清潔，每天換水兩次，試驗用水為消毒、曝氣之后的自來水。整個試驗過程在室內(nèi)弱光條件下進行，每天僅在收集殘餌時開日光燈，水面光照強度約為120 lux。

1.4 試驗方法 用高錳酸鉀濃度為20 mg/kg 的藥液對草龜進行20 min 藥浴消毒處理，挑選大小均一，活動力強的480 只草龜隨機分到各個養(yǎng)殖缸中進行為期兩周馴化。馴化過程與正式試驗過程的條件和飼料投喂情況一致。馴化結(jié)束后禁食1 d 稱重，獲得初始體重。每天定量、飽足投喂三次（8∶00、12∶30、17∶00），投喂30 min 后用虹吸管將剩余餌料吸出，收集于干凈并已稱干重的紗絹袋中，置于65 ℃鼓風干燥箱中恒溫烘干，稱重并記錄殘餌干重。為矯正殘餌量，在相同試驗環(huán)境下沒有草龜?shù)母字型度攵匡暳?，相同時間后用相同的方法收回，計算溶失率。根據(jù)投餌量和矯正的殘餌量計算草龜?shù)臄z食量。養(yǎng)殖期為56 d，結(jié)束后禁食1 d 稱重，獲得終末體重。試驗期間，L1 組第8 個養(yǎng)殖缸因電子溫控儀出現(xiàn)故障，故提前終止了該缸的試驗。

1.5 龜體營養(yǎng)成分和Y2O3的分析 干物質(zhì)的測定方法是將飼料樣品在105 ℃的烘箱（上海博迅醫(yī)療生物有限公司）中烘干至恒重，龜體水分在65 ℃的烘箱中烘至恒重；粗蛋白質(zhì)采用Foss 全自動凱氏定氮儀Kjeltec8420 測定（Foss，USA）；粗脂肪采用索氏抽提法-石油醚提取測定；能量采用Parr 6300 全自動氧彈量熱儀（Parr，USA）測定；粗灰分采用馬弗爐（天津泰斯特儀器有限公司）灼燒法測定。

根據(jù)Refstie 等（1997）的方法消化樣品后，采用ICP-MS 電感耦合等離子質(zhì)譜儀X Series 2（美國賽默飛）測定飼料和糞便中釔的含量，計算消化率。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

攝食率/（%/d）=It/[（mt+m0）/2×t]×100；

總消化率/%=（1-飼料中Y2O3含量/糞便中Y2O3含量）×100；

特定生長率/（%/d）=（lnmt-lnm0）/t×100；

相對生長率/（%/d）=（mt-m0）/m0/t×100；

餌料系數(shù)=It/（mt-m0）。

采用Statistica 10.0 軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），各試驗組間的差異采用Duncan’s 多重比較，各肉堿添加組與對照組的差異采用LSD 檢驗，P ＜0.05 表示差異顯著。L-肉堿添加量與特定生長率之間的定量關(guān)系采用多項式回歸分析方法，顯著水平為P ＜0.05。試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果

2.1 飼料中L-肉堿添加量對草龜攝食生長的影響 如表2 所示，各組之間的特定生長率（F（5，41）=2.572，P=0.04102 ＜0.05）和相對生長率（F（5，41）=2.468，P=0.04811 ＜0.05）具有顯著差異，與對照組相比均有不同程度的升高，其中L2 組最高，其次是L1 組，均顯著高于L0 組和L4 組。試驗L2、L1 組的特定生長率和相對生長率較對照組分別提高8.61%、8.13%、15.54%、14.79%（P ＜0.05）。攝食率（F（5，41）=1.287，P=0.2883＞0.05）、總消化率（F（5，12）=1.264，p=0.3405＞0.05）和餌料系數(shù)（F（5，41）=0.5045，P=0.7711＞0.05）在各組之間無顯著性差異。草龜?shù)奶囟ㄉL率與L-肉堿的添加量回歸關(guān)系顯著（F（3，43）=4.400，P=0.009），回歸方程為y=22.320x3-17.530x2+3.469x+2.084，解得特定生長率最高點對應的L-肉堿添加量為0.1324 g/kg，即132.4 mg/kg。

表2 飼料中L-肉堿添加量對草龜攝食生長的影響

2.2 飼料中L-肉堿添加量對草龜體成分和肝臟粗脂肪含量的影響 如表3 所示，添加不同梯度的L-肉堿對龜體的水分（F（5，24）=0.1153，P=0.9878＞0.05）、粗蛋白質(zhì)（F（5，24）=0.8130，P=0.5521＞0.05）、粗脂肪（F（5，24）=0.03807，P=0.9991＞0.05）、粗灰分含量（F（5，24）=0.3101，P=0.9020 ＞0.05）和能值（F（5，24）=0.07165，P=0.9959＞0.05）均無顯著影響（P ＞0.05）。添加不同梯度L-肉堿會顯著影響肝臟粗脂肪含量（F（5，12）=3.161，P=0.04753 ＜0.05），L3 組的肝臟粗脂肪含量較L0 組比降低25.72%（P ＜0.05）。

表3 飼料中L-肉堿添加量對草龜體成分和肝臟粗脂肪含量的影響

3 討論

3.1 飼料中添加L-肉堿對草龜攝食生長的影響成年水產(chǎn)動物的體內(nèi)較少出現(xiàn)肉堿缺乏的情況，但對于尚未發(fā)育完全的幼體，自身的肉堿合成不能滿足機體的正常生長需要，會限制其快速的生長。在這種情況下，適量添加外源性L-肉堿顯得尤為重要。

在飼料中添加外源性L-肉堿，可通過提高水產(chǎn)動物的飼料利用率來促進生長（Yang 等，2012；章世元等，2009；汪軍濤等，2009）；研究表明，其對吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）、黃河鯉魚（Cyprinus carpio）和彭澤鯽等（茍庚午等，2016；郭黛健等，2011；羅萍等，2006）均有促生長作用，但餌料系數(shù)差異不大；還有少數(shù)水產(chǎn)動物通過提高攝食率來促進生長（Ma 等，2008；Twibell 等，2000）。但是L-肉堿的添加對一些魚類生長并沒有促進作用，如里海擬鯉、大菱鲆（Scophthalmus maximus）和雜交羅非魚成魚等（Kordi 等，2012；劉興旺等，2012；Yang 等，2009）。L-肉堿對水產(chǎn)動物生長性能的影響，與水產(chǎn)動物的種類（杜震宇等，2002）、試驗期間所處的生長階段（Ozório 等，2001）、水質(zhì)參數(shù)（Li 等，2019）、飼料成分以及養(yǎng)殖期間所處環(huán)境（杜震宇等，2002）等有關(guān)。

本試驗在配合飼料中添加L-肉堿，顯著提高了草龜?shù)奶囟ㄉL率和相對生長率，其中L1 組和L2 組均顯著高于對照組。以特定生長率為標準，通過非線性回歸可以得出草龜配合飼料中L-肉堿的適宜添加量為132.4 mg/kg?？傊?，在草龜配合飼料中添加L-肉堿促進了草龜?shù)纳L，但并未對攝食率和餌料系數(shù)造成顯著影響。本試驗結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是添加外源性L-肉堿可促進體內(nèi)物質(zhì)的代謝，足量的L-肉堿使草龜充分發(fā)揮了最大氧化供能能力，使新陳代謝率提高進而提高生長速度（張明輝等，2008）。

3.2 飼料中添加L-肉堿對草龜體成分和肝臟粗脂肪含量的影響 補充L-肉堿可增強脂肪酸的氧化，從而降低機體脂肪含量。研究表明，飼料中添加L-肉堿能夠降低不同魚類的脂肪含量，并增加蛋白質(zhì)含量，或降低組織和魚體的蛋白質(zhì)分解代謝，表現(xiàn)出顯著的蛋白質(zhì)儲留效果（郭黛健等，2011；Chen 等，2010；Jalali 等，2010）。但也有研究報道，在飼料中添加L-肉堿并未對體成分產(chǎn)生顯著性影響。如對吉富羅非魚幼魚、大菱鲆和黑鯛幼魚（Sparus macrocephalus）的研究（孫蕾，2016；劉興旺等2012；彭士明等2010）。與這些研究的結(jié)果相似，本試驗在配合飼料中添加不同梯度的L-肉堿也未對草龜?shù)捏w成分產(chǎn)生顯著性影響。但與對照組相比，試驗組龜體粗蛋白質(zhì)含量均有不同程度的增加，因此，在草龜配合飼料中添加L-肉堿可能對節(jié)約蛋白質(zhì)有積極作用。

肝胰臟是魚類進行脂肪酸β 氧化和調(diào)節(jié)脂肪蓄積的主要器官（田娟等，2009），而L-肉堿作為脂肪酸氧化的關(guān)鍵因子，可促進脂肪酸的氧化，避免脂肪在肝臟中的堆積和脂肪肝癥狀的發(fā)生（楊文平，2017）。如在黑鯛幼魚、尼羅羅非魚和羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn)（彭士明等，2010；Chen 等，2010；杜震宇等，2002），添加外源性L-肉堿可降低肝臟的粗脂肪含量。吉富羅非魚和奧尼羅非魚肝臟粗脂肪含量隨L-肉堿含量的增加而增加（茍庚午等，2016；黃凱等，2010）。本試驗在草龜飼料中添加外源性L-肉堿后，顯著降低了肝臟的粗脂肪含量，其中L3 組的肝臟粗脂肪含量最低，顯著低于對照組，其余各組間并無顯著性差異?？傊?，添加適量的L-肉堿可起到降低肝臟粗脂肪含量的效果，對蛋白質(zhì)分解有節(jié)約作用。但添加過量的L-肉堿可能會加重肝臟的代謝負荷，從而提高肝臟的粗脂肪含量。