基于組織芯片技術(shù)分析間皮素在人膽囊癌組織中的細(xì)胞定位及意義

倪慶強(qiáng)，高恒軍，楊發(fā)基，劉方峰，朱化強(qiáng)，李洪光，周旭，常宏，盧俊

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝膽外科，濟(jì)南250021

膽囊癌是常見的消化道惡性腫瘤，根治性切除手術(shù)是目前惟一可能獲得治愈機(jī)會(huì)的治療手段。膽囊癌起病隱匿，常因膽石癥行膽囊切除手術(shù)中意外發(fā)現(xiàn)[1]，但僅約10%的患者有根治性切除手術(shù)機(jī)會(huì)[2]。由于膽囊解剖位置毗鄰第一肝門，借膽囊床與肝臟相連，早期易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，手術(shù)時(shí)獲得組織學(xué)陰性切緣較為困難，且放化療效果不佳，致使膽囊癌患者生存期短、預(yù)后極差。因此，迫切需要研究新的治療方法及治療靶點(diǎn)。間皮素是一種僅表達(dá)于機(jī)體間皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)，迄今其生物學(xué)行為仍未得到詳細(xì)闡明。研究表明，間皮素不同的細(xì)胞定位與其生物學(xué)行為密切相關(guān)。近年來，間皮素已逐漸成為卵巢癌、胸膜間皮瘤、胰腺癌等實(shí)體瘤靶向治療的熱點(diǎn)之一。然而，在膽囊癌研究領(lǐng)域關(guān)于間皮素的報(bào)道較少。2017年1月—4月，我們采用組織芯片技術(shù)檢測(cè)間皮素在膽囊癌和癌旁正常膽囊組織中的細(xì)胞定位情況，旨在進(jìn)一步探討其作為診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值，為提高膽囊癌診治水平提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來源 制備組織芯片所需膽囊癌及癌旁正常膽囊組織均購自上海芯超生物科技有限公司，其中膽囊癌組織和癌旁配對(duì)正常膽囊組織各20例份、單獨(dú)膽囊癌組織60例份，經(jīng)病理醫(yī)生二次復(fù)檢確診。80例膽囊癌患者中，男24例、女56例，年齡31～84(64.36±10.88)歲，病理類型為腺癌69例、腺鱗癌8例、鱗狀細(xì)胞癌3例，患者術(shù)前均未行化療、放療和或靶向藥物治療等抗腫瘤治療。

1.2 組織芯片制備 將20例份膽囊癌及癌旁正常膽囊組織各1位點(diǎn)、單獨(dú)60例份膽囊癌組織各1位點(diǎn)，順序排于空白受體蠟塊上，分布于同一張組織芯片(上海芯超生物科技有限公司，型號(hào)HGal-Ade100PG-01)共100位點(diǎn)，然后編號(hào)(圖1)。將組織陣列芯塊放置于50～52 ℃烘箱保溫，制成組織芯片蠟塊，修整蠟塊以備切片。將組織芯片的蠟塊以4 μm厚連續(xù)切片，附于載玻片上，放置于60 ℃烘箱烘烤16 h。按照編號(hào)每間隔50張，抽取1張組織芯片切片行HE染色；病理醫(yī)生根據(jù)HE染色組織形態(tài)進(jìn)行質(zhì)控，確保目標(biāo)組織的有效位點(diǎn)達(dá)90%以上。將做好的組織芯片實(shí)驗(yàn)用白片放置于切片盒中，4 ℃冰箱冷藏保存。

注：淺色為腫瘤組織芯片位點(diǎn)，深色為癌旁正常組織芯片位點(diǎn)。

1.3 膽囊癌和癌旁正常膽囊組織中間皮素檢測(cè) 采用免疫組化法，單克隆兔抗人mesothelin抗體購自Abcam公司。將石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟和水化，對(duì)內(nèi)源性的過氧化物酶進(jìn)行滅活處理。將脫蠟水化后的組織芯片放置于耐高溫的塑料切片架上，放入含有足量0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)的壓力鍋中；煮沸加熱至壓力閥噴氣后2 min，再以PBS洗滌3次。為避免結(jié)果出現(xiàn)假陽性，切片上的其他抗原位點(diǎn)非特異性地與一抗結(jié)合，可用正常的山羊血清封閉液，室溫封片1 h；甩去血清，滴加1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜。二抗處理后室溫孵育30 min，用PBS洗滌3次(每次5 min)。滴加DAB反應(yīng)2 min，顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)，再用蘇木素染液復(fù)染2 min。將切片按照乙醇濃度70%、85%、100%依次浸泡2 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ依次浸泡各5 min。全部透明后封片，晾干切片，顯微鏡觀察染色情況。

1.4 間皮素檢測(cè)結(jié)果判定 在顯微鏡下，間皮素陽性染色為棕黃色或棕褐色。染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，黃褐色計(jì)3分。陽性染色細(xì)胞所占比例：陽性細(xì)胞占比<1%計(jì)0分，陽性細(xì)胞占比1%～<10%計(jì)1分，陽性細(xì)胞占比10～<50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞占比≥50%計(jì)3分。每張切片隨機(jī)選取不同代表性區(qū)域觀察，高倍鏡下共觀察5個(gè)視野。將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞占比評(píng)分相乘得出總分，取平均值。所有結(jié)果由兩位病理學(xué)專家在不知臨床病理資料雙盲情況下獨(dú)立觀察，當(dāng)意見不同時(shí)，詳細(xì)討論后達(dá)成一致結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M(Q)表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

膽囊癌組織細(xì)胞膜中間皮素表達(dá)高于癌旁正常膽囊組織(P<0.05)，而在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中兩者間皮素表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。典型膽囊癌、癌旁正常膽囊組織間皮素檢測(cè)結(jié)果見圖2、圖3。

表1 膽囊癌和癌旁正常膽囊組織不同細(xì)胞定位的間皮素表達(dá)情況比較[M(Q)]

注：A為膽囊癌組織間皮素細(xì)胞質(zhì)陽性率90%、細(xì)胞膜陽性率15%、細(xì)胞核陽性率0；B為膽囊癌組織間皮素細(xì)胞質(zhì)陽性率90%、細(xì)胞膜陽性率15%、細(xì)胞核陽性率80%；C為膽囊癌組織間皮素細(xì)胞質(zhì)陽性率100%、細(xì)胞膜陽性率90%、細(xì)胞核陽性率100%；D為膽囊癌組織間皮素細(xì)胞質(zhì)陽性率100%、細(xì)胞膜陽性率20%、細(xì)胞核陽性率60%。

3 討論

臨床上膽囊癌發(fā)病率雖不如其他消化道腫瘤發(fā)病率高，但其惡性程度高，5年生存率極低，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)展至中晚期，失去手術(shù)切除治療的機(jī)會(huì)。

因此，臨床迫切需要找到新的指標(biāo)作為膽囊癌早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

目前，關(guān)于間皮素正常功能的研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，間皮素敲除的小鼠在生長(zhǎng)發(fā)育、生殖及造血功能方面均與正常小鼠類似，認(rèn)為間皮素可能并不是人體生長(zhǎng)發(fā)育所必須。盡管間皮素在正常機(jī)體中分布局限，但其在許多腫瘤中都有表達(dá)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，間皮素在卵巢癌、胸膜間皮瘤、胰腺癌及三陰性乳腺癌等腫瘤組織中均有表達(dá)，腫瘤組織與正常組織中間皮素存在差異性表達(dá)。另外，間皮素還可以促進(jìn)腫瘤的增殖、局部侵犯、轉(zhuǎn)移以及化療抵抗[3-8]。如在胰腺癌細(xì)胞系中，間皮素可激活PI3K/AKT及NF-κB信號(hào)通路，并上調(diào)IL-6/Mcl-1表達(dá)，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]；間皮素還可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)7和MMP9分泌，促進(jìn)胸膜間皮瘤、胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[3,10]；間皮素可與卵巢癌細(xì)胞表面的CA-125相結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]。此外，臨床觀察性研究結(jié)果表明，間皮素高表達(dá)與腫瘤的更高級(jí)別、更晚分期及不良預(yù)后相關(guān)[12-13]。間皮素的上述特點(diǎn)，使其有望成為腫瘤相關(guān)抗原特異性診斷和靶向治療的理想分子。

本研究在間皮素的檢測(cè)方法方面，選用組織芯片技術(shù)。與傳統(tǒng)病理石蠟切片相比，組織芯片技術(shù)將多個(gè)病理切片進(jìn)行篩選、打孔等處理后固定于同一蠟塊上進(jìn)行平行分析，可使實(shí)驗(yàn)條件盡可能一致，大大降低實(shí)驗(yàn)成本。本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常膽囊組織相比，膽囊癌組織細(xì)胞膜間皮素表達(dá)增高。這表明間皮素可能通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的黏附力使腫瘤細(xì)胞聚集形成癌轉(zhuǎn)移灶，從而在膽囊癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。FRIERSON等[14]研究了150例不同組織間皮素表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)間皮素基因在胰腺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在前列腺、膀胱、輸尿管、肝臟、腎臟、甲狀腺組織中不表達(dá)或極低表達(dá)，進(jìn)一步提示間皮素具有作為膽囊癌特異性診斷指標(biāo)與治療靶點(diǎn)的潛能。膽囊是人體非必需器官，適合作為生物免疫靶向治療靶器官，針對(duì)間皮素相關(guān)免疫靶向治療方面已有些研究成果[15-18]。本研究應(yīng)用組織芯片技術(shù)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，從膽囊癌細(xì)胞定位角度闡明間皮素在膽囊癌組織中高表達(dá)，將為進(jìn)一步研究間皮素促進(jìn)膽囊癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制及其生物學(xué)行為提供參考。本研究后續(xù)將圍繞間皮素基因敲除后對(duì)膽囊癌發(fā)生、發(fā)展的影響開展工作，以期為膽囊癌的早診、早治奠定基礎(chǔ)。