骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中BMAL1、PI3K/AKT信號(hào)通路因子表達(dá)變化

張曉冬，溫亮

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院骨科，北京100020

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的關(guān)節(jié)退行性病變，發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)逐漸升高。目前OA仍以保守治療為主，探索OA發(fā)病機(jī)制對(duì)OA的預(yù)防及治療均有積極意義。生物鐘基因及蛋白在生物界中普遍存在，其作用是調(diào)控晝夜節(jié)律運(yùn)轉(zhuǎn)。研究顯示，OA患者軟骨細(xì)胞存在生物鐘紊亂的情況[1-2]，使得軟骨細(xì)胞修復(fù)與磨損之間的平衡遭到破壞，從而誘發(fā)OA。孟慶軍等[3]研究發(fā)現(xiàn)，OA大鼠軟骨細(xì)胞生物鐘BMAL1蛋白表達(dá)較正常大鼠顯著降低；靶向Bmal1消融小鼠軟骨細(xì)胞可消除其晝夜節(jié)律，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退行性變。鹽酸氨基葡萄糖是臨床治療OA的藥物，以其作為本實(shí)驗(yàn)的干預(yù)藥物，觀察干預(yù)后對(duì)生物鐘的影響。軟骨細(xì)胞生物鐘受何種信號(hào)通路調(diào)控目前尚不完全清楚。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，生物鐘可能與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)[4-5]。2020年6月—12月，我們觀察了OA大鼠軟骨組織生物鐘BMAL1基因及蛋白的表達(dá)情況，以及PI3K/AKT信號(hào)通路分子的表達(dá)變化，旨在從新的角度闡述OA的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，6周齡，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。鹽酸氨基葡萄糖購(gòu)自北京康比得藥業(yè)有限公司。HE染色試劑盒購(gòu)自索萊寶公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司。Western blotting蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白上樣緩沖液、ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自索萊寶公司。PI3K抗體、AKT抗體、BMAL1抗體、β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。雙人顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。電泳儀、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 動(dòng)物分組與干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為正常組、模型組、干預(yù)組，每組各8只。正常組不造模，給予生理鹽水3 mL/d灌胃。模型組和干預(yù)組采用Hulth法制作OA模型[6]。以10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，手術(shù)部位備皮并消毒。在髕韌帶處橫向切約3 mm長(zhǎng)的切口，將髕韌帶切斷，暴露關(guān)節(jié)腔內(nèi)部。切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，暴露半月板，用刀片取下內(nèi)側(cè)半月板。最后切斷前后交叉韌帶,縫合傷口。局部注射青霉素16萬(wàn)U/d防止傷口感染，連續(xù)注射3 d。模型組給予生理鹽水3 mL/d灌胃。干預(yù)組給予鹽酸氨基葡萄糖25 mg/(kg·d)灌胃。1次/天，連續(xù)28 d。

1.3 膝關(guān)節(jié)標(biāo)本采集 最后一次給藥后，將大鼠以10 %水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉，心臟取血6 mL，靜置20 min后，1 700 r/min離心10 min，充分分離血清，將所得血清分裝在EP管中，-80 ℃冰箱保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。膝關(guān)節(jié)取材在冰上完成，每組取2只大鼠膝關(guān)節(jié)置入4%甲醛溶液中固定，EDTA脫鈣，每只大鼠關(guān)節(jié)可形成6張左右切片，用于組織病理檢查；其余6只膝關(guān)節(jié)置于液氮中，-80 ℃冰箱保存，用于mRNA及蛋白檢測(cè)。

1.4 膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理檢查 采用HE染色法。大鼠膝關(guān)節(jié)置于EDTA飽和溶液中脫鈣70 d，每周更換1次脫鈣液。待針刺關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)可以刺入時(shí)，表明脫鈣完畢。取出膝關(guān)節(jié)，石蠟包埋，切片，脫臘，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察。

1.5 膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評(píng)分方法 取脫鈣后的膝關(guān)節(jié)軟骨切片，采用Safranin O染色，顯微鏡下觀察軟骨結(jié)構(gòu)(規(guī)則程度、血管翳、裂隙)、軟骨細(xì)胞數(shù)量(正常、增多、減少)、軟骨潮線(潮線完整、血管穿過(guò))、Safranin O染色情況(染色正常、染色輕中重度減弱、未顯色)，以上述四個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)分作為最終的Mankin′s評(píng)分[7]。

1.6 膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PI3K、AKT、BMAL1 mRNA檢測(cè) 采用PCR法。取凍存的膝關(guān)節(jié)，用手術(shù)刀片刮下關(guān)節(jié)表面的軟骨組織，加入液氮進(jìn)行研磨。將研磨后的分成2份，分別用于基因和蛋白檢測(cè)。使用RNA提取試劑盒提取組織軟骨粉末中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PCR試劑盒說(shuō)明書構(gòu)建反應(yīng)體系，按照每組每個(gè)樣本3個(gè)平行孔加樣，使用PCR儀設(shè)定的模板反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物由廣州復(fù)能公司Genecopoeia合成，引物序列見表1。從2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因與內(nèi)參基因引物序列

1.7 膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PI3K、AKT、BMAL1蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取研磨好的軟骨粉末，加入RIPA裂解液裂解30 min，100 ℃水浴5 min。3 000 r/min離心3 min，取上清。采用BCA試劑盒測(cè)試提取蛋白濃度，配置成1 μg/μL的蛋白溶液，加入蛋白上樣緩沖液后100 ℃煮沸5 min。將蛋白液加入凝膠板上的上樣孔中，80 V通電30 min后轉(zhuǎn)換成120 V，直至條帶完全分散開后停止電泳。根據(jù)黑膠白膜原則進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉。PBS清洗，根據(jù)Marker標(biāo)記進(jìn)行裁剪并敷對(duì)應(yīng)的一抗、二抗。使用ECL超敏發(fā)光液顯色，讀取條帶灰度值,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化比較 正常組軟骨具有一定厚度，表面光滑，潮線完整；模型組軟骨厚度變薄，潮線不完整；干預(yù)組軟骨厚度基本正常，潮線基本完整。

2.2 三組Mankin′s評(píng)分比較 正常組、模型組、干預(yù)組Mankin′s評(píng)分分別為(0.25±0.18)、(11.32±0.34)、(5.66±0.62)分。與正常組比較，模型組、干預(yù)組評(píng)分均升高；與模型組比較，干預(yù)組評(píng)分降低(P均<0.01)。

2.3 三組軟骨組織中PI3K、AKT、BMAL1 mRNA表達(dá)比較 見表2。

表2 三組軟骨組織中PI3K、AKT、BMAL1 mRNA表達(dá)比較

2.4 三組軟骨組織中PI3K、AKT、BMAL1蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 三組軟骨組織中PI3K、AKT、BMAL1蛋白表達(dá)比較

2.5 BMAL1表達(dá)與PI3K、AKT表達(dá)的相關(guān)性 BMAL1 mRNA表達(dá)與PI3K、AKT mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.432、-0.541，P均<0.05)，BMAL1蛋白表達(dá)與PI3K、AKT蛋白表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.313、-0.415，P均<0.05)。

3 討論

生物鐘普遍存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，它是由神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和基因時(shí)序震蕩表達(dá)所形成的體系，使得生物從微觀的基因蛋白層面到宏觀的晝夜更替都具備了生物節(jié)律性[8-9]。在生物鐘系統(tǒng)中存在著兩個(gè)閉合的環(huán)路，分別是BMAL1、CLOCK和PER1、CRY1，其中由BMAL1、CLOCK基因及蛋白組成的環(huán)路對(duì)生物鐘起激活作用，而PER1、CRY1基因及蛋白組成的環(huán)路則相反[10]。PI3K/PTEN/mTOR有mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物，二者通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外各種刺激進(jìn)行接受和整合從而調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，OA的發(fā)病與軟骨細(xì)胞生物鐘蛋白BMAL1表達(dá)缺失有關(guān)[11-13]。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，生物鐘可能與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)[4-5，14]。本研究通過(guò)制備OA模型，以鹽酸氨基葡萄糖作為OA的陽(yáng)性治療藥物進(jìn)行干預(yù)，觀察在正常情況、OA情況及陽(yáng)性藥物干預(yù)下，大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生物鐘BMAL1基因及蛋白的變化以及PI3K/AKT信號(hào)通路因子的表達(dá)變化。

關(guān)節(jié)軟骨由軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞組成，軟骨表面的局灶損傷是OA發(fā)生的開始，進(jìn)而出現(xiàn)軟骨基質(zhì)代謝紊亂，最后發(fā)展成更大范圍的軟骨破壞[15-16]。本研究采用Hulth法制作OA模型，結(jié)果顯示，OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面不光滑，HE染色可見軟骨變薄，潮線不完整，Mankin′s評(píng)分較高，表明存在明顯的骨破壞，此表現(xiàn)與OA的病理表現(xiàn)一致，證明Hulth法可成功復(fù)制OA模型。鹽酸氨基葡萄糖是目前臨床治療OA的常用藥物，其作用原理是基質(zhì)膠原網(wǎng)架上附著鹽酸氨基葡萄糖形成的蛋白聚糖膠體復(fù)合物，增加膠原網(wǎng)架的彈性，可承載壓力并緩沖應(yīng)力，從而起到保護(hù)軟骨和軟骨下骨的作用。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)組給予鹽酸氨基葡萄糖后，軟骨表面較模型組光滑，且Mankin′s評(píng)分下降，表明鹽酸氨基葡萄糖對(duì)OA大鼠具有治療作用。

哺乳動(dòng)物的生物鐘受中樞及外周生物鐘的調(diào)控。中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核(SCN)，SCN可自主產(chǎn)生生物節(jié)律，并通過(guò)調(diào)控生物鐘環(huán)路維持人體的生物節(jié)律，如睡眠、內(nèi)分泌、體溫等。外周生物鐘則存在于身體的各個(gè)外周組織當(dāng)中，如骨關(guān)軟骨、心臟、肌肉等，外周生物鐘不同于中樞生物鐘，其不具備產(chǎn)生自主節(jié)律的功能，節(jié)律的產(chǎn)生受SCN的調(diào)控。在生物鐘系統(tǒng)中，BMAL1是重要的信號(hào)元件，它起到了激活生物鐘環(huán)路的作用。軟骨細(xì)胞生物鐘屬于外周生物鐘，受控于SCN，當(dāng)軟骨細(xì)胞中生物鐘關(guān)鍵元件BMAL1減少時(shí)，軟骨細(xì)胞生物節(jié)律表達(dá)受到抑制，因此難以維持“休息時(shí)軟骨細(xì)胞的修復(fù)”與“運(yùn)動(dòng)時(shí)軟骨細(xì)胞的磨損”之間的節(jié)律與平衡。使用藥物干預(yù)后，BMAL1表達(dá)有所增加，故可以維持該平衡。本研究結(jié)果顯示，模型組軟骨細(xì)胞生物鐘基因BMAL1 mRNA及蛋白表達(dá)下降，表明OA的發(fā)生伴隨著軟骨細(xì)胞生物鐘的紊亂，生物鐘系統(tǒng)中起激活作用的環(huán)路基因及蛋白表達(dá)受到抑制；干預(yù)組BMAL1 mRNA及蛋白表達(dá)均不同程度增高，表明鹽酸氨基葡萄糖對(duì)于恢復(fù)軟骨細(xì)胞生物鐘的平衡有一定作用，提示治療OA的藥物可能通過(guò)調(diào)控生物鐘的表達(dá)進(jìn)而緩解OA癥狀，進(jìn)一步驗(yàn)證了BMAL1在OA發(fā)病中的作用。

軟骨細(xì)胞中的PI3K、AKT mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高，表明OA的發(fā)生伴隨著PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。本研究結(jié)果顯示，模型組PI3K/AKT通路相關(guān)基因PI3K、AKT mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，表明PI3K/AKT通路處于激活狀態(tài)，同時(shí)伴隨著BMAL1基因及蛋白表達(dá)的下降；干預(yù)組PI3K、AKT mRNA及蛋白表達(dá)不同程度下調(diào)，表明PI3K/AKT通路受到抑制，同時(shí)伴隨著BMAL1基因及蛋白表達(dá)增高。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，BMAL1表達(dá)與PI3K/AKT表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可能下調(diào)BMAL1基因及蛋白的表達(dá)。

綜上所述，OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中起生物鐘激活作用的BMAL1表達(dá)量下降；OA大鼠PI3K/AKT信號(hào)通路呈激活狀態(tài)，可降低BMAL1表達(dá)。PI3K/AKT信號(hào)通路與生物鐘的靶向調(diào)控關(guān)系，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。