水飛薊賓對糖尿病小鼠心肌損傷的治療作用及機制探討

劉鵬云，陳蕊蕊，紀(jì)兆樂，李澤霖，趙佩，秦超師，周海佳

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安710038

糖尿病是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率和病死率上升的主要原因之一[1]。糖尿病性心肌病是由糖尿病引起的與心臟結(jié)構(gòu)和功能異常相關(guān)的臨床疾病[2]。心肌肥厚、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化是糖尿病心肌病的主要特征[3]。據(jù)估計，約有12%的糖尿病患者罹患有糖尿病心肌病，并可進(jìn)一步演變?yōu)樾牧λソ呱踔翆?dǎo)致患者死亡[4]。因此，臨床上亟需尋找有效的治療藥物以延緩和減輕糖尿病心肌損傷。水飛薊賓(SIL)是從乳薊中分離的一種黃酮木脂素天然化合物[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SIL不僅有抗氧化、抗炎、抗菌和促進(jìn)細(xì)胞再生等多種生物學(xué)活性[6]，且有助于減輕多種病理因素導(dǎo)致的心血管疾病的病情[7-10]。然而,SIL對糖尿病心肌損傷的影響尚無研究報道。2020年8月—2021年7月，本研究觀察了SIL對糖尿病心肌損傷的治療作用，并初步探討其機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 雄性SPF級C57BL/6小鼠40只，8周齡，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，使用許可證號SYXK(軍)2012-0022，飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境。SIL和鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測試劑盒購自瑞士Roche公司。二氫乙錠超氧化物陰離子熒光探針(DHE)檢測試劑盒購自美國Abcam公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。cleaved Caspase-3、NF-κB、β-actin抗體購自美國Abcam公司。

1.2 動物分組及干預(yù) 將40只小鼠隨機均分為正常對照組、藥物對照組、模型組和實驗組，每組10只。模型組和實驗組小鼠制作糖尿病模型：將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，連續(xù)5 d給予STZ 50 mg/kg腹腔注射[11]，繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)12周后測量空腹血糖值超過16.6 mmol/L判定為糖尿病模型制作成功。實驗組小鼠于STZ注射后、藥物對照組小鼠于同一時點給予SIL 100 mg/(kg·d)灌胃，正常對照組和模型組小鼠每天給予等體積的生理鹽水灌胃。在STZ注射完成并連續(xù)干預(yù)12周后麻醉并處死小鼠，隨即收集相關(guān)實驗標(biāo)本。

1.3 心功能評價 采用Vevo2100成像系統(tǒng)測量心徑并評價心功能，獲得經(jīng)胸二維M型超聲心動圖、脈沖多普勒超聲心動圖以評價心臟收縮和舒張功能。彩色多普勒測量心室早期充盈峰值速度(E波)和晚期充盈速度(A波)，計算E/A。M型超聲心動圖測量左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，計算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室縮短分?jǐn)?shù)百分比(LVFS)。

1.4 心肌組織纖維化觀察及纖維化指標(biāo)基因檢測 采用Masson染色法。將心臟標(biāo)本制備成石蠟切片，按常規(guī)Masson染色步驟對組織切片進(jìn)行著色并固定，光學(xué)顯微鏡觀察并拍片，顯示各組心肌組織纖維化程度。使用Image Pro軟件對纖維化程度進(jìn)行相對定量分析。采用RT-PCR法檢測心肌組織中的纖維化指標(biāo)TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ基因。使用TRIzol試劑從心臟組織中提取總RNA。采用PrimeScript RT試劑盒對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。采用ABI7500系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃預(yù)變性5 s，60 ℃預(yù)變性34 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt計算基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參引物序列

1.5 心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 采用DHE染色測定心肌組織活性氧(ROS)水平。將心臟標(biāo)本制備成冰凍切片，用DHE熒光染料干預(yù)后用經(jīng)PBS沖洗，37 ℃水浴箱中黑暗環(huán)境下孵育30 min，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。DHE染液與被氧化的DNA片段反應(yīng)，產(chǎn)生亮紅色熒光，測定熒光強度以反映ROS水平。取適量心臟組織，經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌后制備成組織勻漿，按照SOD和MDA檢測試劑盒說明檢測SOD、MDA。

1.6 心肌組織炎癥因子指標(biāo)檢測 采用RT-PCR法檢測心肌組織中的TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA。PCR方法和反應(yīng)條件參考“1.4”。引物序列見表1。采用Western blotting法檢測NF-κB蛋白。提取各組心臟標(biāo)本總蛋白，用BCA法檢測樣品蛋白濃度；將50 μg蛋白通過SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；用5%脫脂牛奶封閉后，加入兔抗NF-κB和小鼠抗β-actin一抗孵育；洗滌后，用二抗再次孵育，使用增強化學(xué)發(fā)光試劑，通過Bio-Rad系統(tǒng)成像；采用Image J軟件分析曝光蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與β-actin蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7 心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白檢測 心肌細(xì)胞凋亡觀察采用TUNEL染色法。將各組心肌組織石蠟切片按照TUNEL檢測試劑盒說明書依次滴加TUNEL染液及DAPI染液，凋亡細(xì)胞核呈綠色。以TUNEL染色陽性細(xì)胞/全部細(xì)胞×100%計算細(xì)胞凋亡率。采用Western blotting法檢測各組心肌組織中的cleaved Caspase-3蛋白，方法參考“1.6”。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能指標(biāo)比較 與正常對照組相比，模型組小鼠E/A、LVEF、LVFS顯著減低，LVESD、LVEDD升高(P均<0.01)。與模型組相比，實驗組小鼠E/A、LVEF、LVFS升高，LVESD、LVEDD減低(P均<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠心功能指標(biāo)比較

2.2 各組心肌組織纖維化程度及纖維化指標(biāo)基因表達(dá)比較 與正常對照組相比，模型組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多且排列紊亂；與模型組相比，實驗組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維沉著顯著減少。見圖1。與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織纖維化比例及Collagen ⅠmRNA、Collagen ⅢmRNA、TGF-β1mRNA表達(dá)增高(P均<0.01)；與模型組相比，實驗組纖維化比例及Collagen ⅠmRNA、Collagen ⅢmRNA、TGF-β1mRNA表達(dá)降低(P均<0.01)。見表3。

圖1 各組小鼠心肌組織纖維化程度(Masson染色)

表3 各組小鼠心肌組織纖維化比例及纖維化指標(biāo)基因表達(dá)比較

2.3 各組心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織ROS、MDA水平增高，SOD活性下降(P均<0.01)；與模型組相比，實驗組ROS、MDA水平下降，SOD活性增高(P均<0.01)。見表4。

表4 各組小鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

2.4 各組心肌組織炎癥因子表達(dá)比較 與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA及NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)(P均<0.01)；與模型組相比，實驗組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA及NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)(P均<0.01)。見表5。

表5 各組小鼠心肌組織炎癥因子表達(dá)比較

2.5 各組心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 正常對照組、藥物對照組、模型組、實驗組心肌細(xì)胞凋亡率分別為1.78%±1.03%、1.22%±0.71%、23.36%±3.53%、8.72%±2.62%，cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量分別為100.43±22.35、95.83±20.11、212.46±27.82、152.53±20.19。與正常對照組相比，模型組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3表達(dá)增高(P均<0.01)；與模型組相比，實驗組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率，cleaved Caspase-3表達(dá)降低(P均<0.01)。藥物對照組與正常對照組凋亡率及cleaved Caspase-3表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病的一種獨立并發(fā)癥，是在糖尿病患者未患有高血壓、冠心病等其他心臟病的情況下發(fā)生的心肌結(jié)構(gòu)和功能異常[1-2]。糖尿病持續(xù)的高血糖狀態(tài)引起的心肌組織ROS過度生成和炎癥反應(yīng)異常放大在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[3,12]。因此尋找一種針對糖尿病心肌損傷過程的治療藥物，對減輕糖尿病心肌損傷及延緩糖尿病心肌病的發(fā)展具有重要意義。

SIL是從乳薊中分離出來的一種黃酮木脂素天然化合物[5]。以往研究發(fā)現(xiàn)，SIL具有顯著的抗氧化及抗炎活性，其對多種組織器官損傷的治療作用已得到證實[6,13-14]。有證據(jù)顯示，SIL也能夠有效治療多種心血管疾病。鄭超等[7]發(fā)現(xiàn)，SIL可通過抑制氧化應(yīng)激損傷和心肌細(xì)胞凋亡來緩解阿霉素的心臟毒性。曹旭丹等[8,15]發(fā)現(xiàn)，SIL對離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的干預(yù)作用。陳旭等[9]認(rèn)為，SIL可有效緩解內(nèi)毒素血癥心肌損傷。艾文[16]認(rèn)為，SIL通過抑制心臟炎癥和纖維化，最終抑制心肌肥厚的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，SIL可明顯減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心臟收縮及舒張功能障礙，并顯著抑制心肌纖維化進(jìn)程，證明了SIL對糖尿病心肌損傷的治療潛力。

高血糖促進(jìn)心肌線粒體中ROS的生成，進(jìn)而激活NADPH氧化酶，導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈功能和結(jié)構(gòu)完整性缺陷[17]。過量的ROS促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致氧化終產(chǎn)物MDA合成增加，改變心肌膜結(jié)構(gòu)和酶活性[18]。SOD是生物抗氧化酶系的重要組成成員之一，也被報道在糖尿病心肌中活性顯著下降[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織ROS、MDA水平增高，SOD活性下降，而給予SIL處理后ROS、MDA水平下降，SOD活性增高，提示SIL可能通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮抗糖尿病心肌損傷的作用。

在糖尿病情況下，炎癥反應(yīng)對心肌產(chǎn)生明確的損傷作用。據(jù)報道，糖尿病心肌炎癥形成的不同機制均與NF-κB分子的活化密切相關(guān)[20]。NF-κB是一種氧化還原敏感蛋白復(fù)合物，在炎癥中起核心作用。一方面，高血糖可直接促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄；另一方面，過量的ROS通過激活蛋白激酶C，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB的活化[21]。NF-κB可促進(jìn)TNF-α及炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6的轉(zhuǎn)錄和釋放，引發(fā)心血管損傷，最終導(dǎo)致心肌炎癥的發(fā)生[22]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，實驗組小鼠心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)下降，IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)抑制，表明SIL還可能通過抗炎作用從而治療糖尿病心肌損傷。

糖尿病患者心肌組織病理檢查顯示心肌膠原沉積異常增加，而氧化應(yīng)激、炎癥是糖尿病心肌纖維化的重要原因[23]。高血糖產(chǎn)生的過量ROS可誘導(dǎo)TNF-α激活，進(jìn)而誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白生成[24]。此外，心肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和促纖維化因子刺激糖尿病心臟纖維化，加速了心肌重構(gòu)[25]。HAUDEK等[26]報道，TNF-α信號可同時刺激內(nèi)在和外在的細(xì)胞死亡途徑，增強Caspase-3的激活，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。而TNF-α的促凋亡作用可能是通過NF-κB活化介導(dǎo)的。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，實驗組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維沉著顯著減少，CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF-β1mRNA表達(dá)明顯被抑制，心肌細(xì)胞凋亡率減少，cleaved Caspase-3表達(dá)降低。這說明抑制心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡也是SIL抗糖尿病心肌損傷的機制。

綜上所述，SIL可改善糖尿病心肌損傷小鼠心功能，作用機制與減輕心肌組織纖維化、抑制心肌組織氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)、抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。