山萘酚對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)小鼠急性胰腺炎的干預(yù)作用及機(jī)制

陳艷，趙月，何楝楝，王僚陽(yáng)，王曉川

中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院藥學(xué)部，廣東深圳518107

急性胰腺炎(AP)是一種常見的腹部炎癥性疾病，常由膽管疾病、過量飲酒、藥物、膽管和胰管的侵入性手術(shù)引起，導(dǎo)致胰酶異常激活消化胰腺自身組織，吸引免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到損傷部位，釋放大量的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等，從而造成局部胰腺組織和相關(guān)臟器損傷，激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號(hào)通路釋放炎癥因子進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至導(dǎo)致多器官功能衰竭[1-3]。目前臨床治療AP主要采用液體復(fù)蘇、營(yíng)養(yǎng)支持和鎮(zhèn)痛等對(duì)癥支持療法，但效果不理想。山萘酚是一種天然黃酮，廣泛存在于茶、西蘭花、蘋果、草莓和豆類中，具有抗炎、抗感染、抗氧化、抗癌、心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)和抗糖尿病等特性[4-5]。但對(duì)AP的治療作用還不明確。2020年8月—2021年3月，本研究觀察了山萘酚對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)小鼠AP的干預(yù)作用，并探討山萘酚相關(guān)機(jī)制，為AP臨床治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 24只C57BL/6雄性小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，鼠齡8～10周，體質(zhì)量20～22 g。雨蛙素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。GAPDH抗體購(gòu)自上海碧云天公司。NF-κB抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。血清淀粉酶購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。TNF-α、IL-1β檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 模型制作及給藥方法 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組，每組8只。模型組和實(shí)驗(yàn)組制作AP模型，腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg，溶于PBS)8次，每次間隔1 h；實(shí)驗(yàn)組在雨蛙素注射前1 h腹腔注射山萘酚(20 mg/kg，溶于DMSO)。對(duì)照組不制作模型，注射等量PBS，造模12 h后處死小鼠。

1.3 胰腺病理組織觀察 取胰腺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚切片，用HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺形態(tài)并對(duì)胰腺組織進(jìn)行病理?yè)p傷評(píng)分[6]。

1.4 血清淀粉酶及炎癥因子檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清淀粉酶及TNF-α、IL-1β，按試劑盒說明書操作。

1.5 胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)胰腺組織中的TNF-α、IL-1β。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化(100%、95%、85%、75%的乙醇)，H2O2孵育阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性；抗原修復(fù)，封閉，一抗孵育并4 ℃過夜，加二抗孵育；3,5-二氨基聯(lián)苯胺顯色，顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)；蘇木精復(fù)染10 min，乙醇梯度脫水(75%、85%、95%、100%的乙醇)，二甲苯浸泡，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，并用Image J軟件進(jìn)行定量分析平均光密度。采用Western blotting法檢測(cè)胰腺組織中的NF-κB蛋白。小鼠胰腺組織剪碎提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；每孔加入20 μg蛋白，電泳(80 V電泳30 h，150 V電泳50 min)、300 mA恒流濕轉(zhuǎn)1 h、封閉1 h凝膠電泳；加一抗孵育4 ℃過夜(1∶1 000)，洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯影。以GADPH為內(nèi)參，采用Image J軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠胰腺組織病理變化 模型組小鼠胰腺組織水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞壞死，實(shí)驗(yàn)組小鼠胰腺損傷程度明顯減輕。模型組胰腺組織水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腺泡細(xì)胞壞死評(píng)分低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組胰腺組織水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腺泡細(xì)胞壞死組織學(xué)評(píng)分低于模型組(P均<0.01)。見表1、圖1。

表1 各組小鼠胰腺組織病理評(píng)分比較(分，

圖1 各組小鼠胰腺組織病理變化(HE染色，100×)

2.2 各組小鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平比較 模型組血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平低于模型組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平比較

2.3 各組小鼠胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達(dá)比較 模型組胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達(dá)低于模型組(P均<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組小鼠胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達(dá)比較

圖2 各組小鼠胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達(dá)情況(免疫組化法)

3 討論

AP是胰腺的一種急性炎癥性疾病，除了胰腺局部病變外，還常伴有明顯的全身炎癥反應(yīng)，甚至伴有多器官損傷[7-8]。目前臨床上AP的治療多為液體復(fù)蘇和對(duì)癥支持治療，尚無特異性藥物[8-9]。越來越多的證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)是疾病進(jìn)展的主導(dǎo)因素[10-11]，因此，探討AP早期炎癥機(jī)制，尋找一種針對(duì)炎癥過程的潛在治療方法具有重要的臨床意義。

山萘酚是一種天然黃酮具有抗炎、抗感染、抗氧化、抗腫瘤、心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)和抗糖尿病等特性[4-5]。然而，山萘酚在AP中的藥理作用尚不清楚。雨蛙素是一種縮膽囊素類似物，本研究用雨蛙素誘導(dǎo)AP小鼠模型，該模型穩(wěn)定且已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性AP的研究[12-13]。本研究結(jié)果顯示，山萘酚能明顯減輕雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠AP，明顯減輕AP引起的胰腺組織病理?yè)p傷，小鼠胰腺組織病理學(xué)評(píng)分(壞死、空泡化、炎細(xì)胞浸潤(rùn))及血清淀粉酶水平明顯降低，血清炎癥因子TNF-α、IL-1β水平降低，并下調(diào)胰腺組織中NF-κB的表達(dá)，提示山萘酚可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活來抑制胰腺炎癥反應(yīng)。

炎癥是AP發(fā)展的一個(gè)主要過程，胰腺局部和全身器官損傷的嚴(yán)重程度取決于促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平。TNF-α、IL-1β等促炎因子在AP發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究表明，抑制炎癥因子表達(dá)有利于減輕疾病嚴(yán)重程度[14-15]。當(dāng)有害刺激作用于胰腺時(shí)，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)酶原的過早激活可引起腺泡細(xì)胞損傷，引起局部炎癥反應(yīng)；另一方面，胰腺腺泡細(xì)胞受損后，本身產(chǎn)生炎癥因子、趨化因子等，吸引免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到損傷部位，釋放大量細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，從而造成局部胰腺組織和相關(guān)臟器損傷[16-17]。本研究結(jié)果與相關(guān)研究一致，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平高于對(duì)照組，而山萘酚可顯著抑制血清及胰腺組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)，因此認(rèn)為山萘酚可以減少炎癥因子的產(chǎn)生，以減輕雨蛙素誘導(dǎo)的AP。

NF-κB通路是調(diào)節(jié)AP炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄和生物合成的重要信號(hào)通路，在AP的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。通常情況下，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中與IκB結(jié)合處于非活動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到炎癥因子及其他有害物質(zhì)等的刺激時(shí)，IκBs降解，NF-κB核易位信號(hào)暴露，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核與其同源DNA序列結(jié)合并誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)表達(dá)[18]。多種AP實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻?，NF-κB激活與小鼠AP的嚴(yán)重程度有關(guān)[19-20]，藥物抑制NF-κB信號(hào)通路的激活可顯著減輕AP[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組NF-κB通路被激活,而NF-κB在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)被顯著抑制，因此，我們推測(cè)山萘酚減輕AP炎癥反應(yīng)可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路激活來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究表明，KF可以通過減輕AP小鼠的炎癥反應(yīng)，抑制NF-κB炎癥通路的激活改善AP預(yù)后，而其在AP中的特異性作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。