SUMO蛋白質修飾化CRMP2在膠質瘤細胞中表達變化及對細胞增殖的影響

王壘壘，吉蘇珍，劉志峰

1滄州市中心醫(yī)院腦科院區(qū)神經外科，河北滄州061000；2滄州市中心醫(yī)院西院區(qū)急診ICU

膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。由于多數病例確診較晚、治療抵抗等原因，導致膠質瘤的復發(fā)率較高，患者中位生存期僅為14個月[1-4]。因此，進一步了解膠質瘤發(fā)病的分子機制對新的治療靶點的開發(fā)有重要意義。CRMP2是一種微管相關蛋白，在神經組織中表達豐富，除了崁合于微管側壁穩(wěn)定微管促進微管組裝之外，還作為細胞內信號分子參與細胞遷移、分化、突起生長、可塑和再生等病理生理過程。研究顯示，CRMP2翻譯后修飾在其功能調節(jié)中起到了至關重要的作用[5-10]。SUMO蛋白質修飾化是存在于各種細胞生物學過程中的翻譯后調節(jié)，如轉錄調控、蛋白質穩(wěn)定性和轉運、細胞凋亡、應激反應和細胞周期等。Ucb9是一種綴合酶，近期研究人員發(fā)現，感覺神經元中存在CRMP2的蛋白修飾化位點，這一位點可被Ubc9修飾[11-13]。2020年6月—2021年8月，觀察了SUMO蛋白質修飾化CRMP2在膠質瘤細胞中的表達變化及對細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料人膠質瘤細胞系 A172、U87、GL15購自中國科學院細胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度。CRMP2、SUMO1、UBE2I/UBC9、Human IgG一抗及β-actin抗體購自美國Abcam公司。人CRMP2的全長編碼區(qū)基因購自美國OriGene公司。Q5?定點誘變試劑盒購自新英格蘭生物實驗室。Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司。5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)標記購自德國Sigma-Aldrich公司。紅色熒光疊氮化物AlexaFluor?594購自美國賽默飛科技公司。

1.2 膠質瘤細胞中Ucb9、CRMP2、SUMO蛋白質修飾化CRMP2檢測 采用Western blotting法。提取3種膠質瘤細胞總蛋白。取150 μg蛋白，100 g/LSDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉移至PVDF膜。0.05 g/mL脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性兔抗人CRMP2(1∶1 000)、SUMO1(1∶1 500)、UBE2I/UBC9(1∶500)、IgG(1∶2 000)一抗，以β-actin作為內參，4 ℃過夜。加入小鼠抗兔IgG二抗(1∶1 000)孵育1 h。采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描．以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。選取能穩(wěn)定表達膠質瘤所特有的細胞標志物，并已用于多種增殖相關細胞因子研究的GL15細胞進行后續(xù)實驗[14]。

1.3 SUMO蛋白質修飾化CAMP2對膠質瘤細胞增殖影響的觀察 將GL15細胞分為pCMV-CRMP2組、pCMV-CRMP2-K374A組及空白對照組。將pCMV質粒載體與人CRMP-2全長編碼混合；使用Q5?定點誘變試劑盒通過定點誘變誘導突變的核苷酸，構建pCMV-CRMP2-K374A，使得細胞被SUMO蛋白質修飾化能力下降。pCMV-CRMP2為陽性對照。pCMV-CRMP2組、pCMV-CRMP2-K374A組、空白對照組分別使用Lipofectamine2000試劑轉染pCMV-CRMP2、pCMV-CRMP2-K374A及pCMV質粒載體。pCMV-CRMP2、pCMV-CRMP2-K374A、空白對照組CAMP2相對表達量分別為1.18±0.067、1.21±0.071、0.81±0.043，pCMV-CRMP2組和pCMV-CRMP2-K374A組細胞中CAMP2表達均高于空白對照組(P均<0.05)。使用EdU(25 μg/mL)孵育細胞4 h后，甲醇固定細胞5 min，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。紅色熒光AlexaFluor?594疊氮化物用于顯示結合的EdU，DAPI染核。蔡司顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image J軟件進行分析。

1.4 Ucb9介導CAMP2的SUMO蛋白質修飾化對膠質瘤細胞增殖影響的觀察 將GL15細胞分為對照組及Ucb9組，Ucb9組使用Lipofectamine2000試劑將Ucb9類似物t-CSM肽20 μmol/L轉入GL15細胞，對照組轉入同等量0.01%二甲基亞砜。提取兩組總蛋白，采用Western blotting法檢測Ucb9、CRMP2蛋白，對照組、Ucb9組細胞中CAMP2相對表達量分別為0.80±0.046、0.78±0.045，Ucb9相對表達量分別為0.64±0.040、1.05±0.061，Ucb9組細胞中Ucb9表達水平高于對照組(P<0.05)。細胞增殖實驗檢測細胞增殖能力。方法同“1.3”。

2 結果

2.1 膠質瘤細胞中Ucb9、CRMP2、CUMO蛋白質修飾化CRMP2表達情況 GL15、A172、U87細胞中均表達Ucb9、CRMP2、SUMO蛋白質修飾化CRMP。3種膠質瘤細胞CRMP2、Ucb9U表達由高到低依次為U87、GL15、A172細胞，兩兩相比，P均<0.05。見圖1、表1。GL15、A172、U87細胞中CRMP2與Ucb9表達均呈正相關(r分別為0.87、0.79、0.81，P均<0.05)，SUMO蛋白質修飾化CAMP2與Ucb9表達呈正相關(r分別為0.76、0.80、0.77，P均<0.05)。

圖1 GL15、A172、U87細胞中CRMP2、Ucb9及SUMO蛋白質修飾化CAMP2表達情況(Western blotting法)

表1 GL15、A172、U87細胞中CRMP2、Ucb9及SUMO蛋白修飾化CRMP2表達情況

2.2 SUMO蛋白修飾化CRMP2對膠質瘤細胞增殖的影響 pCMV-CRMP2組、pCMV-CRMP2-K374A組、空白對照組細胞增殖能力分別為1.53±0.052、0.98±0.023、0.96±0.024。pCMV-CRMP2組細胞增殖能力高于pCMV-CRMP2-K374A組及空白對照組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 pCMV-CRMP2組、pCMV-CRMP2-K374A組、空白對照組細胞增殖情況(CCK-8法)

2.3 Ucb9介導CRMP2的SUMO蛋白修飾化對膠質瘤細胞增殖的影響 Ucb9組、對照組細胞增殖能力分別為1.65±0.063、0.91±0.031，Ucb9組細胞增殖能力高于對照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 Ucb9組、對照組細胞增殖情況(CCK-8法)

3 討論

膠質瘤是發(fā)病率最高的顱內惡性腫瘤，因其放化療耐受、浸潤性生長、無限增殖的特性，使其成為惡性程度最高的腫瘤之一。如何有效抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲是膠質瘤基礎研究的熱點。研究表明，轉錄后修飾，尤其是磷酸化和SUMO蛋白修飾化，賦予CRMP2在神經系統(tǒng)中調節(jié)多種信號通路的能力。針對CRMP2磷酸化在惡性腫瘤中作用的研究結果顯示，CRMP2基因絲氨酸522位點被CDK5磷酸化是GSK3B進一步磷酸化和SUMO蛋白修飾化所必需的，CRMP2磷酸化和蛋白修飾化可協(xié)同誘導惡性腫瘤細胞增殖[15,16]。有學者使用序列比對和結構分析，鑒定了CRMP2基因的賴氨酸374位點的SUMO蛋白修飾化點。有研究證明，Cdk5可使四聚體解體成單體，從而暴露SUMO蛋白修飾化位點。CRMP2在神經元極性、神經突向外生長、軸突導向、神經遞質釋放和神經元細胞死亡中起重要的調節(jié)作用。Rho相關蛋白激酶將CRMP2磷酸化，可抑制CRMP2結合微管蛋白異二聚體的能力，從而導致微管去穩(wěn)定化，最終使軸突生長，因此，它被認為是阿爾茨海默病的潛在治療靶點。有研究表明，CRMP2的SUMO蛋白修飾化可以調節(jié)兒茶酚胺A分化細胞的鈉電流和NaV1.7轉運，阻斷CRMP2蛋白修飾化可降低NaV1.7鈉電流，減輕神經性疼痛[17-19]。

本研究旨在探討SUMO蛋白質修飾化CAMP2在膠質瘤中的表達變化及對細胞增殖的影響。結果顯示，3種膠質瘤細胞CRMP2、Ucb9表達由高到低依次為U87、GL15、A172細胞，考慮表達差異與不同膠質瘤細胞惡性程度有關。3種膠質瘤細胞中CRMP2表達與Ucb9含量呈正相關，驗證Ucb9對CRMP2有SUMO蛋白修飾化作用。本研究選取GL15細胞進行隨后的實驗研究，采取構建質粒載體及細胞轉染的方法制備不同組別GL15細胞進行研究。細胞增殖實驗結果表明，單純CAMP2表達升高的膠質瘤細胞增殖能力較空白對照組明顯升高，但當膠質瘤細胞CRMP2的SUMO蛋白修飾化位點發(fā)生突變后其增殖活性下降。這些結果表明，CRMP2及其SUMO蛋白修飾化在膠質瘤細胞增殖中起到了一定作用。

Ubc9是一種E2 SUMO綴合酶，可介導CRMP2的SUMO蛋白修飾化[20]。我們假設，通過靶向調節(jié)Ucb9進而調節(jié)CRMP2的SUMO蛋白修飾化是膠質瘤潛在的治療策略。本研究采取細胞轉染的方法制備Ucb9表達明顯升高的膠質瘤細胞，進一步的細胞增殖實驗結果顯示，Ucb9表達升高后，膠質瘤細胞的增殖能力也明顯增強，表明Ucb9介導的CRMP2 SUMO蛋白修飾化在膠質瘤細胞增殖中起到正性作用。

綜上所述，CRMP2及其SUMO蛋白修飾化在膠質瘤細胞惡性生物學行為中存在協(xié)同作用。CRMP2及其SUMO蛋白修飾化可介導膠質瘤細胞增殖，通過調節(jié)CRMP2表達或使其SUMO蛋白修飾位點突變，可改變膠質瘤細胞增殖活性。以往研究結果顯示，CRMP2在惡性腫瘤細胞中普遍表達，可促進細胞增殖，磷酸化可使這一作用增強。本研究結果顯示，在膠質瘤細胞中，Ucb9介導的CRMP2 SUMO蛋白修飾化使得磷酸化CRMP2的生物學作用進一步增強，從而驅動膠質瘤細胞增殖。以上結果進一步闡述了膠質瘤的發(fā)病機制，通過靶向抑制CRMP2 SUMO蛋白修飾化有望成為膠質瘤治療的新策略。