RBM5-AS1在甲狀腺癌細胞中表達變化及其對細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響

梁寶珍，盧順，張利華，陳雪君

1南方醫(yī)科大學附屬東莞石龍人民醫(yī)院(東莞市第三人民醫(yī)院)甲狀腺外科，廣東東莞523320；2南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院普通外科

甲狀腺癌(TC)是常見的內分泌惡性腫瘤，雖然預后較好，但由于遠處轉移、遺傳和環(huán)境因素影響，大約10%的病例可能會分化成更具侵襲性的腫瘤[1-2]。TC發(fā)病過程涉及多種癌基因的激活、抑癌基因失活及信號通路的異常改變等過程，因此研究TC發(fā)病的分子機制對尋找治療靶點和指導治療具有重要意義[3-4]。近年研究證實，長鏈非編碼RNA(lncRNA)具備調控腫瘤細胞分化、代謝等功能，通過調節(jié)基因表達進而參與多種惡性生物學過程[5-7]。結合基序蛋白5反義RNA1(RBM5-AS1)基因定位于人染色體3p21.31，與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移密切相關，在骨肉瘤、口腔鱗癌等多種惡性腫瘤組織中高表達，與預后密切相關[8-9]。但目前關于RBM5-AS1與TC關系的報道較少。2019年6月—2021年1月，本研究觀察了RBM5-AS1在TC細胞中的表達變化，及其對細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響，并探討可能機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1和人TC細胞系C643、B-CPAP、TPC-1、BHT101、KMH-2、8305C購中國科學院細胞庫。胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司?？俁NA提取試劑盒、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司。逆轉錄及qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。PCR引物購自上海生工公司。CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自美國BD公司。Transwell小室購自美國Corning公司。蛋白裂解液和蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物有限公司。RBM5-AS1 siRNA、NC siRNA購自上海吉瑪公司。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化(p)-mTOR、p70核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)、真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(4E-BP1)和GAPDH一抗及辣根過氧化物酶標記的IgG二抗購自英國Abcam公司。合成。

1.2 TC細胞與甲狀腺細胞中RBM5-AS1表達檢測 采用qRT-PCR法檢測Nthy-ori 3-1細胞和C643、B-CPAP、TPC-1、BHT101、KMH-2、8305C細胞中的RBM5-AS1。取對數(shù)生長期的細胞，PBS洗3次，加入TRIzol試劑，完全裂解細胞，并依次加入氯仿、異丙醇和無水乙醇離心后獲取細胞中總RNA，檢測RNA的濃度和質量，用于后續(xù)實驗。使用逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，并繼續(xù)進行擴增。以cDNA為模板，按SYBR Green Ⅰ說明進行PCR擴增。以GAPDH作內參。RBM5-AS1上游引物序列為5′-TGGGAATGGGGAAGAGAAC-3′，下游引物序列為5′-TCTGTTCCTGGGTCTGTGTGC-3′。GAPDH上游引物序列為5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物序列為5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。反應條件：95 ℃預溫6 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 25 s，75 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt計算RBM5-AS1相對表達量。選擇RBM5-AS1表達水平最高的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 TC細胞分組與轉染 TC細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。當細胞融合度為95%時進行傳代，并取二代細胞進行實驗。取對數(shù)生長期的TC細胞鋪6孔板，待細胞融合度為70%～80%時進行轉染。將細胞分為對照組和實驗組，為別轉染NC siRNA和RBM5-AS1 siRNA。qRT-PCR檢測結果顯示，實驗組細胞中RBM5-AS1相對表達量(1.25±0.12)明顯低于對照組(3.49±0.17)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示RBM5-AS1 siRNA可以明顯抑制TC細胞中RBM5-AS1的表達。

1.4 兩組細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。轉染后細胞消化、重懸，調整細胞密度為1×104/mL，96孔板鋪入各組細胞，每孔100 μL，每組設4個復孔。將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。分別于培養(yǎng)0、24、36、48、60、72 h后向各孔加入10 μL的CCK-8稀釋液，采用流式細胞術檢測。1 h后用酶標儀測定450 nm波長下的吸光度值表示細胞增殖能力。

1.5 兩組細胞凋亡率測算 采用annexinV/PI雙染色法。轉染后細胞消化、重懸，調整細胞密度為1×105/mL，加入70%乙醇重懸。置于4 ℃固定24 h；離心棄上清，PBS洗2遍，加入AnnexinV-FITC、PI各5 μL混勻進行染色，輕輕混勻，室溫下反應15 min。流式細胞儀檢測并計算細胞凋亡率。

1.6 兩組細胞侵襲、遷移能力檢測 細胞侵襲能力檢測采用Transwell小室實驗。將基質膠覆蓋于Transwell上室。取轉染后細胞用無血清的培養(yǎng)基制成密度為2.5×104/mL的細胞懸液。取細胞懸液500 μL加入Transwell小室上室，下層加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基500 μL。于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，保留下層細胞，用棉簽清理未穿膜細胞，經多聚甲醇固定和結晶紫染色，15 min后將其置于顯微鏡下進行細胞計數(shù)。在上述基礎上，移入涂有明膠的Transwell小室上室，計數(shù)侵襲細胞數(shù)。細胞遷移能力檢測使用帶有8 μm孔徑插入物的Transwell小室進行。在200 μL無血清培養(yǎng)基中將2×104個細胞接種到上室中，并將600 μL完全培養(yǎng)基添加到下室。48 h后，將細胞用4%多聚甲醛固定并用結晶紫染色。顯微鏡下計數(shù)遷移細胞數(shù)。

1.7 兩組細胞中mTOR、p-mTOR、p70S6K、4E-BP1蛋白檢測 采用Western boltting法。取兩組轉染細胞，加入蛋白裂解液RIPA混勻后冰上震蕩裂解30 min。離心取上清后進行蛋白定量，經BCA法蛋白定量合格。然后加入等體積的上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE(5%濃縮膠、10%分離膠)分離蛋白。采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，然后用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入mTOR、p-mTOR、p70S6K、4E-BP1和GAPDH一抗(稀釋比均為1∶1 500)，4 ℃孵育過夜。TBST沖洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(稀釋比均為1∶4 500)，室溫孵育1 h。TBST洗3次后，采用ECL超敏化學發(fā)光法曝光條帶，Image J軟件分析蛋白灰度值。

2 結果

2.1 TC細胞與甲狀腺細胞中RBM5-AS1表達比較 C643、B-CPAP、TPC-1、BHT101、KMH-2、8305C細胞中RBM5-AS1相對表達量分別為1.25±0.31、1.14±0.29、2.46±0.12、2.03±0.05、1.15±0.32、3.61±0.12，均高于Nthy-ori 3-1細胞的0.28±0.05，P均<0.05。以8305C細胞中RBM5-AS1表達量最高，故選擇8305C細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 兩組TC細胞增殖能力比較 見表1。

表1 兩組細胞不同時間點增殖能力比較

2.3 兩組TC細胞凋亡率比較 實驗組、對照組細胞凋亡率分別為15.74%±3.87%、34.21%±4.08%，實驗組細胞凋亡率低于對照組(P<0.05)。

2.4 兩組TC細胞侵襲、遷移能力比較 實驗組侵襲和遷移實驗穿膜細胞數(shù)分別為(94.53±2.75)、(54.80±3.25)個，對照組分別為(152.00±3.18)、(87.20±2.51)個，實驗組侵襲和遷移細胞數(shù)少于對照組(P均<0.05)。

2.5 兩組TC細胞中mTOR、p-mTOR、p70S6K、4E-BP1蛋白表達比較 見表2。

表2 兩組TC細胞中mTOR、p-mTOR、p70S6K、4E-BP1蛋白表達比較

3 討論

TC是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%，包括乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌四種病理類型。絕大部分TC起源于濾泡上皮細胞。電離輻射、碘、激素、其他甲狀腺疾病、遺傳和表觀遺傳學等危險因素都可能與TC的發(fā)生相關，但TC的病因及發(fā)病機制尚不清楚[10]。近年來，有研究證實，lncRNA在TC發(fā)展進程中發(fā)揮基因調控作用，參與TC的惡性進展[11]。研究表明，離子轉運體26A家族反義RNA1(SLC26A4-AS1)在TC組織和細胞中呈低表達，上調SLC26A4-AS1表達可能通過激活DDX5來抑制TC細胞的增殖和轉移[12]。lncRNA微小染色體維持蛋白3相關蛋白-反義鏈1可能通過競爭性抑制miR-211-5p從而促進TC的轉移[13]。因此，lncRNA望成為TC診斷和治療的靶點，發(fā)掘調控TC的重要lncRNA，并且進一步探討相關分子機制，對于研發(fā)有效治療干預措施、改善患者預后十分重要。

RBM5-AS1是新近發(fā)現(xiàn)的參與腫瘤發(fā)生發(fā)展多個過程有關的lncRNA，主要表達于細胞核，長度為1.2 kb，位于3號染色體[14]。LI等[8]研究證明，RBM5-AS1在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中表達顯著升高，過表達RBM5-AS促進OSCC細胞的增殖。SERENA等[15]研究表明，RBM5-AS1過表達能夠通過調控WNT信號通路，導致結腸癌干細胞的激活增加。DENG等[9]研究報道，RBM5-AS1高表達于骨肉瘤細胞和組織，在體內及體外過表達RBM5-AS1，可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。目前關于RBM5-AS1在TC中的作用尚不清楚。本研究首先檢測明確RBM5-AS1在TC細胞中的表達均高于正常甲狀腺細胞。選擇RBM5-AS1表達相對較高的8305C細胞轉染RBM5-AS1 siRNA，實驗結果發(fā)現(xiàn)，抑制RBM5-AS1表達后，TC細胞的增殖、遷移、侵襲能力均明顯降低，凋亡率升高，這表明RBM5-AS1參與促進TC的惡性進展。

mTOR磷酸化后參與腫瘤細胞的生長、存活、代謝和細胞免疫等過程[16]。p70S6K是該信號通路下游的重要蛋白，主要是通過增強mRNA翻譯來促進腫瘤細胞生長。LI等[17]究證明，激活的p70S6K可促進非小細胞肺癌的上皮細胞—間充質轉化并增強腫瘤細胞對厄洛替尼的耐藥。4EBP1是mTOR的另一下游底物，是一種翻譯關鍵調節(jié)因子。SEI等[18]研究表明，4EBP1在發(fā)生轉移的腎癌患者腫瘤組織中表達量更高，是臨床預后不良的獨立危險因素。mTOR/p70S6K/4EBP1信號通路參與惡性腫瘤的周期進展、分化、凋亡、自噬、運動和代謝等過程[19-20]。本研究結果顯示，相比對照組，實驗組細胞中p-mTOR、p70S6K、4E-BP1蛋白表達下降，提示mTOR/p70S6K/4E-BP1信號通路的激活受到抑制，可能以mTOR為調控中樞，激活下游靶蛋白p70S6K、4E-BP1，促進TC細胞惡性生物學行為。

綜上所述，TC細胞中RBM5-AS1表達上調；干擾RBM5-AS1表達可抑制TC細胞的增殖、遷移、侵襲能力，促進其凋亡，其機制可能與調控mTOR/p70S6K/4EBP1信號通路有關。RBM5-AS1有望成為抗TC治療的新靶點。后續(xù)實驗將以多個TC細胞系為研究對象，分析RBM5-AS1作為癌基因的具體機制，同時還需進行體內試驗與臨床研究進一步驗證以上結論。