甲基轉(zhuǎn)移酶3基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞c-Myc、EGFR、Bcl-2表達(dá)的影響及其機(jī)制

李顯永，趙暉，梁勇，程陽(yáng)，韓登俊，官潤(rùn)云

1自貢市第四人民醫(yī)院泌尿外科，四川自貢643000；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多種真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后修飾方式[1]，其中N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物RNA最普遍的內(nèi)部修飾方式[2]。m6A是一種動(dòng)態(tài)可逆的RNA甲基化修飾，與其相關(guān)的蛋白包括甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體[甲基轉(zhuǎn)移酶3(METTL3)、腎母細(xì)胞瘤1-相關(guān)蛋白(WTAP)、甲基轉(zhuǎn)移酶14(METTL14)]、去甲基酶[肥胖相關(guān)基因(FTO)、B同源蛋白5]，相應(yīng)的閱讀蛋白如YTH結(jié)構(gòu)域包含蛋白等[3]。METTL3作為甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體成員之一，現(xiàn)有研究認(rèn)為其是惟一具備RNA m6A修飾催化活性的酶[4]。m6A修飾可從多方面影響mRNA的新陳代謝，如參與mRNA的半衰期調(diào)節(jié)、穩(wěn)定性、翻譯效率、剪接和出核等生物進(jìn)程[3,5]。白血病、肺癌等腫瘤中相關(guān)腫瘤基因上存在大量m6A修飾，高豐度的m6A修飾將促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展[6-7]。前期研究表明，METTL3基因在雄激素非依賴(lài)性前列腺癌細(xì)胞系PC-3、DU145中呈高豐度表達(dá)，可增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和克隆形成能力[8-10]，然而具體分子機(jī)制尚不清楚。2019年2月—2020年1月，本研究擬通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默METTL3基因表達(dá)，觀察雄激素非依賴(lài)性前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145中腫瘤相關(guān)蛋白c-Myc、EGFR、Bcl-2的表達(dá)變化，并探討相應(yīng)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要材料 PC-3、DU145細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)。F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。脂質(zhì)體Lipofectamine2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。實(shí)時(shí)熒光定量試劑、RIPA裂解液均購(gòu)自Sangon公司。兔抗METTL3單克隆抗體、鼠抗m6A單克隆抗體、兔抗c-Myc單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗EGFR單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。鼠抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。脫脂奶粉購(gòu)自完達(dá)山有限公司。PVDF轉(zhuǎn)移膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。帶電尼龍膜購(gòu)自生興生物公司。

1.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 人前列腺癌PC-3、DU145細(xì)胞用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2飽和濕度)中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%以上融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，平均3 d傳代1次。PC-3、DU145細(xì)胞按2×105/孔接種于6孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。篩選針對(duì)METTL3基因的特異性siRNA片段和陰性對(duì)照siRNA片段[9]。METTL3 siRNA-1400上游序列為5′-GCUCAACAUACCCGUACUA-3′，下游序列為5′-UAGUACGGGUAUGUUGAGC-3′。陰性對(duì)照siRNA上游序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，下游序列為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。空白對(duì)照組不做特殊處理，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染METTL3 siRNA-1400。于培養(yǎng)箱中溫育6 h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。采用RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率[9]，轉(zhuǎn)染效率在80%以上。實(shí)驗(yàn)組METTL3 siRNA-1400片段有效抑制了METTL3基因表達(dá)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 各組細(xì)胞中c-Myc、EGFR、Bcl-2蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞樣本后加入裂解液，裂解物高速離心，取上清，-80 ℃保存。取樣本并加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，加熱后離心去不溶性沉淀。上樣品行SDS-PAGE電泳，后使用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入稀釋后的一抗(c-Myc 1∶1 000，Bcl-2 1∶1 000，EGFR 1∶1 000，內(nèi)參GAPDH 1∶10 000)，于4 ℃溫育條件下過(guò)夜。加入稀釋后的二抗，于室溫條件下溫育2 h。使用Gel-Pro Analyze圖像軟件行結(jié)果分析，以目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 各組細(xì)胞總RNA m6A水平檢測(cè) 采用Dolt blotting法。各組細(xì)胞樣本RNA提取后，濃度稀釋至20 ng/μL，于95 ℃條件下RNA變性，然后冰上冷卻。將2.5 μL的RNA加置帶電尼龍膜上，后于波長(zhǎng)254 nm/312 nm紫外光照射30～60 s。TBST洗膜，封閉液封閉轉(zhuǎn)印膜1 h，加入一抗(m6A 1∶1 000)，4 ℃條件溫育過(guò)夜。加入二抗(山羊抗IgG 1∶2 000)，室溫條件溫育2 h。采用Super Signal West Pico Chemiluminent Substrates發(fā)光液和FR-1800全功能發(fā)光及熒光生物圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。采用Gel-Pro Analyzer軟件處理并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞中c-Myc、EGFR、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 詳見(jiàn)表1、表2和圖1、圖2。

表1 各組PC-3細(xì)胞c-Myc、EGFR、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

表2 各組DU145細(xì)胞c-Myc、EGFR、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

圖1 各組PC-3細(xì)胞c-Myc、EGFR、Bcl-2蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

圖2 各組DU145細(xì)胞c-Myc、EGFR、Bcl-2蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

2.2 各組細(xì)胞總RNA m6A水平變化 PC-3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組RNA m6A修飾水平分別為15 765.853±3 102.316、33 778.833±4 803.387、33 539.744±4 783.892，DU145細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組RNA m6A修飾水平分別為9 354.107±1 158.352、20 820.921±1 622.452、23 290.103±1 697.817，實(shí)驗(yàn)組RNA m6A修飾水平均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P均<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組PC-3、DU145細(xì)胞RNAm6A修飾水平檢測(cè)結(jié)果(Dolt blotting法)

3 討論

早期從宮頸癌HeLa細(xì)胞裂解液中分離出催化m6A修飾形成的兩個(gè)復(fù)合物，分別為MT-A(200 kDa)和MT-B(800 kDa)。METTL3則是從MT-A復(fù)合物中鑒別出的一個(gè)70 kDa的蛋白[11]。很長(zhǎng)一段時(shí)間以來(lái)，關(guān)于METTL3、m6A的研究緩慢，直到2011年去甲基轉(zhuǎn)移酶FTO的發(fā)現(xiàn)，揭示了m6A是一種動(dòng)態(tài)可逆的RNA修飾方式[12]，隨后其他m6A相關(guān)的酶相繼發(fā)現(xiàn)，它們?cè)诙喾N腫瘤中發(fā)揮的作用也被揭示。CAI等[10]發(fā)現(xiàn)，沉默前列腺癌細(xì)胞系中的METTL3可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、存活、集落形成、侵襲能力下降。本課題組前期研究也得到相似結(jié)果，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的METTL3與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展及分化密切相關(guān)[8]。

為了探索METTL3基因在雄激素非依賴(lài)性前列腺癌中可能發(fā)揮的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾技術(shù)下調(diào)前列腺癌PC-3、DU145細(xì)胞中METTL3表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)蛋白c-Myc、EGFR、Bcl-2表達(dá)也顯著下調(diào)。這提示下調(diào)METTL3基因?qū)⒁种魄傲邢侔┠[瘤相關(guān)蛋白c-Myc、Bcl-2、EGFR的表達(dá)。c-Myc、EGFR、Bcl-2是與前列腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密的癌基因，在前列腺癌中發(fā)揮重要的腫瘤基因特性。原癌基因c-Myc參與細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)，是眾多腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，高表達(dá)的c-Myc與前列腺癌的復(fù)發(fā)及預(yù)后不良相關(guān)[13]。研究表明，高表達(dá)的EGFR接受EGF的刺激維持前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移[14]。還有研究顯示，前列腺癌中抗細(xì)胞凋亡因子Bcl-2介導(dǎo)的信號(hào)通路是雄激素受體拮抗劑恩雜魯胺耐藥的機(jī)制之一[15]。由此推測(cè)，前列腺癌中高表達(dá)的METTL3可能促進(jìn)了前列腺癌相關(guān)腫瘤蛋白的表達(dá)，參與了腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。

近期研究表明，METTL3是甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中惟一具備獨(dú)立催化活性的酶，可以接受S-腺苷基甲硫氨酸為m6A修飾形成提供甲基。而METTL14并不發(fā)揮實(shí)際的催化活性，可與METTL3相結(jié)合形成異質(zhì)二聚體，參與METTL3活性位點(diǎn)的變構(gòu)，并且促進(jìn)與RNA底物結(jié)合的作用，提升催化效率。WTAP發(fā)揮調(diào)節(jié)亞基作用，招募甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體在mRNA上的定位，促進(jìn)m6A修飾形成。METTL3是m6A修飾形成至關(guān)重要的酶[4]。本實(shí)驗(yàn)在PC-3、DU145細(xì)胞中通過(guò)RNA干擾技術(shù)成功下調(diào)METTL3基因表達(dá)，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞總RNA的m6A修飾水平也相應(yīng)下調(diào)，與以上基礎(chǔ)研究結(jié)果相符。

有學(xué)者采用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，m6A峰主要分布在mRNA的5′非編碼區(qū)(UTR)、3′非翻譯區(qū)、內(nèi)部外顯子、翻譯起始和終止密碼子附近區(qū)域，對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)產(chǎn)生重要影響[7]。通常蛋白質(zhì)的合成是在mRNA的5′端由起始因子eIF4F與7-甲基鳥(niǎo)嘌呤結(jié)合而啟動(dòng)翻譯，但RYAN等[5]研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾可以不依賴(lài)eIF4F的活性而促進(jìn)mRNA的翻譯，當(dāng)消耗METTL3后將會(huì)選擇性地抑制攜帶有5′UTR甲基化mRNA的翻譯。關(guān)于白血病的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤基因c-Myc、Bcl-2、PTEN mRNA存在大量m6A修飾，敲低METTL3后mRNA的m6A修飾豐度降低，相應(yīng)的腫瘤蛋白表達(dá)也下調(diào)，認(rèn)為m6A促進(jìn)了相關(guān)腫瘤基因的翻譯[6]。乳腺癌相關(guān)研究也表明，METTL3可以通過(guò)靶向Bcl-2 mRNA的m6A修飾，調(diào)節(jié)腫瘤基因Bcl-2的表達(dá)[16]。關(guān)于肺癌的研究顯示，miR-33a可以直接靶向METTL3 mRNA的3′UTR，抑制其表達(dá)，使METTL3下游的腫瘤基因EGFR、TAZ、MAPKAPK2和DNMT3A蛋白表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)[17]。LIN等[7]發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞內(nèi)腫瘤基因EGFR、TAZ、MAPKAPK2、DNMT3A mRNA的終止密碼子附近存在一個(gè)或多個(gè)m6A峰，敲低METTL3后靶點(diǎn)基因mRNA的m6A修飾水平下降，相應(yīng)的腫瘤蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)，但其mRNA的豐度并無(wú)明顯變化，提示METTL3可能調(diào)控了mRNA的翻譯進(jìn)而影響腫瘤蛋白的表達(dá)。本研究在PC-3、DU145細(xì)胞中下調(diào)METTL3表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞RNA的m6A修飾水平下降，同時(shí)相關(guān)腫瘤蛋白c-Myc、EGFR、Bcl-2表達(dá)也顯著下調(diào)。由此推測(cè)，前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的METTL3可能通過(guò)m6A修飾途徑促進(jìn)了前列腺癌腫瘤相關(guān)基因的翻譯，上調(diào)腫瘤蛋白的表達(dá)。

此外，CHOE等[18]后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的METTL3可以不依賴(lài)于自身的甲基轉(zhuǎn)移酶活性及下游的m6A相關(guān)閱讀蛋白而促進(jìn)mRNA的翻譯。METTL3蛋白分子的前200個(gè)氨基酸片段與翻譯起始因子eIF3h相互作用，促使mRNA形成loop環(huán)，增加mRNA和核糖體再循環(huán)利用效率，從而提升腫瘤基因的翻譯效率。由此可見(jiàn)，前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的METTL3也可能獨(dú)立于其甲基轉(zhuǎn)移酶活性以及m6A相關(guān)閱讀蛋白直接促進(jìn)腫瘤相關(guān)基因的翻譯。

綜上，本研究結(jié)果表明，沉默雄激素非依賴(lài)性前列腺癌PC-3、DU145細(xì)胞METTL3基因后，將下調(diào)腫瘤相關(guān)蛋白c-Myc、EGFR、Bcl-2的表達(dá)，其機(jī)制可能與METTL3參與RNA的m6A修飾有關(guān)，其具體的翻譯調(diào)控機(jī)制及對(duì)雄激素依賴(lài)性前列腺癌的影響還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)探索。